一種表達外源蛋白的表達系統的製作方法

2023-09-19 23:40:40 2

專利名稱：：一種表達外源蛋白的表達系統的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種表達系統。本發明具體涉及一種由質粒pAmk與大腸桿菌組成的表達系統。本發明具體涉及由pAmk質粒與大腸桿菌組成的表達系統表達外源蛋白的表達方法。
背景技術：
：在生物技術與生物工程領域中，通過將外源基因克隆於表達載體上，轉入到一個適當的宿主細胞中，來達到表達與生產重組蛋白的目的。應用到工業生產中，通過發酵可以達到大量生產外源蛋白，達到工業化的水平。在表達系統的選擇上，有細菌，酵母，植物細胞，動物細胞等，而大腸桿菌表達系統，以其簡易，迅速，培養廉價等優點，一直以來是表達各種外源蛋白的首選。大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早，目前應用最廣泛的經典表達系統。隨著分子生物學技術的不斷發展，大腸桿菌表達系統也得到不斷的發展和完善。與其它表達系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、培養周期短、抗汙染能力強等特點。在基因表達技術中佔有重要的地位，是分子生物學研究和生物技術產業化發展進程中的重要工具。而在許多種以大腸桿菌為表達宿主菌的表達系統中，研究者們一直在尋找，更加簡單，方便，產量高，適合於發酵罐等大規模生產的表達外源蛋白的表達系統。致力於尋找更高效表達的策略。影響外源基因在大腸桿菌中的高效表達因素有很多，其中有一點是宿主細胞對密碼子的偏愛性，如果差異性過大，稀有密碼子較多的話，其表達量較低。所以如果外源基因為真核基因，或者其他來源的稀有密碼子較多的基因，按照本表達系統的密碼子使用頻率，根據表達系統對密碼子的偏愛對基因進行重新設計，構建表達工程菌株，可以更有利於外源基因在表達系統中的表達。將外源基因直接克隆於質粒載體pAmk融合啟動子的下遊，通過誘導，發現宿主菌並沒有表達外源蛋白。但是在啟動子3'端下遊保留一段基因，再克隆入外源基因，並在外源基因的5'端連接編碼導肽的DNA序列。經檢測，發現有外源蛋白的表達。所以我們對這段位於啟動子下遊的基因序列進行研究。發現在啟動子下遊保留一種基因序列形式更適合於外源蛋白的表達。以表達胰島素原為例，將胰島素原基因序列5'端加入編碼導肽的DNA序列，克隆於啟動子3'端下遊，構建表達質粒。將表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得工程菌，通過乳糖誘導，經SDS-PAGE檢測菌體蛋白，發現表達的胰島素原包涵體蛋白量佔菌體總蛋白量的36%-38%。通過在發酵罐(30L)中擴大發酵培養基因工程菌。培養33小時，OD值達到150時結束髮酵收集菌體，獲得的溼菌體量約為200g/L，通過細胞破碎，離心獲得包涵體溼重約為18g/L。超過國內現有文獻報導水平(李紅霞，餘蓉，李曉紅.人胰島素原在基因工程菌中的高效表達[J].華西藥學雜誌，2005，20(1):014017)
發明內容本發明的一個目的是提供一種適用於表達外源蛋白的表達質粒載體pAmk。本發明的一個目的是提供一種基因序列形式Xfa)ATGAGTY其中X代表位於質粒pAmk啟動子下遊的一個包含n個鹼基DNA序列，n的取值為1-150。^mAQI編碼兩個胺基酸的導肽序列MS，Y代表位於MS後編碼一個胺基酸或一個多肽的DNA序列。上述序列形式中n優選取值為98，X(n)的具體的優選形式為GCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT這種基因序列形式對外源基因在本表達系統中的表達起著重要的作用。結合以下的優選實例對段基因序列形式做進一步的說明。優選實例l，構建表達質粒pAmk-MS32-proinsulin:其中n取98，X的具體形式為GCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT將編碼N端帶32個導肽的胰島素原序列克隆於上述序列下遊，構建表達質粒pAmk-MS32-proinsulin，通過誘導，檢測到宿主菌中有胰島素原的包涵體表達。其中，32個導肽的序列為MSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMF，即為ATGAGTY的一種優選形式所編碼的多肽序列。優選實例2，構建表達質粒pAmk-MS16-proinsulin:方法如例1，將例1中的32個導肽序列，換成16個導肽序列，構建表達質粒pAmk-MS16-proinsulin，通過誘導，檢測到宿主菌中有胰島素原的包涵體表達。其中，16個導肽的序列為MSLNTSGLGASTMQIS，即為ATGAGTY的一種優選形式所編碼的多肽序列。優選實例3，構建表達質粒pAmk-MS8-proinsulin:方法如例1，將例1中的32個導肽序列，換成8個導肽序列，構建表達質粒pAmk-MS8-proinsulin，通過誘導，檢測到宿主菌中有胰島素原的包涵體表達。其中8個導肽的序列為MSLNTSGL，即為ATGAGTY的一種優選形式所編碼的多肽序列。優選實例4，構建表達質粒pAmk-MS4-proinsulin:方法如例1，將例1中的32個導肽序列，換成4個導肽序列，構建表達質粒pAmk-MS4-proinsulin，通過誘導，檢測到宿主菌中有胰島素原的包涵體表達。5其中4個導肽的序列為MSLN，即為ATGAGTY的一種優選形式所編碼的多肽序列。優選實例5，構建表達質粒pAmk-MS-proinsulin:方法如例1，將例1中的32個導肽序列，換成3個導肽序列，構建表達質粒pAmk-MSR-proinsulin，通過誘導，檢測到宿主菌中有胰島素原的包涵體表達。其中2個導肽的序列為MSR，即為ATGAGTY的一種優選形式所編碼的多肽序列。優選實例6，構建表達質粒pAmk-23-proinsulin:方法如例1，將例1中的32個導肽序列，換成23個導肽序列，誘導後，通過檢測，並沒有發現有胰島素原的表達。其中23個導肽的序列為MGDEIIHLTDFDVSLALTQTGSK從上述的幾個優選實例中，我們得到了一個結論是，在進行外源蛋白的表達時，將外源基因克隆入pAmk時在啟動子下遊保留一段鹼基序列的距離，並且至少保留兩個導肽的序列MS所以在融合啟動子下遊保留的基因序列形式為Xfa)ATGAGTY其中X代表一個包含n個鹼基DNA序列，n的取值為1-150。n優選取值為98，X(n)具體形式為TCACACAGGAAACAGCTGGCGCGCCCAGCTTCGGCATGGCACGTTTGACGTGCCTGGTCGGCAGGGTACGTTTGAATTATTCATAAGAGGAATACGTT。ATGAGT編碼兩個胺基酸的導肽序列MS，Y代表位於MS後編碼一個胺基酸或一個多肽的DNA序列。如在例l，2，3，4，5中。Y分別代表了編碼短肽，LNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMF，LNTSGLGASTMQIS，LNTSGL，LN，以及R的DNA序列。本發明的一個目的是提供表達質粒pAmk轉化的宿主細胞大腸桿菌。其中宿主細胞大腸桿菌優選為BL21(DE3)本發明的一個目的在於提供與本表達系統相應的宿主菌的密碼子使用頻率分析。本發明的目的還在於提供運用通過本表達系統構建的工程菌株生產外源蛋白的方法。圖1為pAmk-MSR-proinsulin表達質粒的構建過程。圖2為SDS-PAGE電泳檢定圖其中泳道1為陰性對照，DE3菌體蛋白圖譜。泳道2和泳道3為基因工程菌的菌體蛋白電泳圖。圖3為對構建的表達質粒pAmk-MSR-proinsulin進行測序得到的測序報告。以下結合具體實例對本發明作進一步的說明，以表達外源蛋白胰島素原為例來具體描述此表達系統的使用方法與特點，包括表達質粒構建，誘導表達外源蛋白等方面。具體實施例方式實施例1表達質粒pAmk-MSR-proinsulin的構建1.1質粒與菌株pAmk全長5.59Kb，啟動子為由脂蛋白啟動子和乳糖啟動子構成的融合啟動子，脂蛋白終止序列，鏈黴素抗性，質粒由本實驗室構建。pET28a-23DT-proinsulin表達質粒，其中含有胰島素原的基因序列，抗性為卡那黴素，由本實驗室構建。菌株為DH5a，BI21(DE3)，均為本實驗室保藏。1.2工具酶及試劑限制性內切酶AscI，Ncol，T4連接酶，購於TAKARA公司。PfoDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶購於南京金思特公司，質粒抽提試劑盒，PCR產物純化試劑盒，DNA膠回收試劑盒購於上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為國產分析純試劑。引物由南京金思特公司合成。1.3載體質粒的準備將本實驗室構建的攜帶有pAmK的DH5a與攜帶有pET28a-23DT-proinsulin的DH5a分別接種到含有鏈黴素(25iig/ml)和卡那黴素(25yg/ml)的LB培養基中，培養過夜，用質粒抽提試劑盒提取質粒，用滅菌的雙蒸水溶解洗脫。1.4載體質粒的酶切反應將抽提的質粒pAmK依次進行AscI和NcoI酶切，酶切產物通過瓊脂糖電泳回收5.21Kb的載體片段，並通過DNA膠回收試劑盒進行純化。1.5通過PCR擴增外源基因片段將外源蛋白proinsulin基因插入到pAmk的啟動子下遊導肽MSR後端，首先要得到MSR-proinsulin的基因片段。具體通過以下步驟得到該片段。1.5.1以pAmk為模板，設計引物，擴增pAmk中AscI酶切位點與表達導肽MSR之間的片段。將其命名為fragment-MSR。上遊引物a，(20bp)5'GGAATTGTGAGCGGATAACA3'下遊引物b，(25bp)5'AAAACGACTCATAACGTATTCCTCT3，使用PfuDNA聚合酶擴增，擴增條件為94t:，45s、53°C，45s、72°C，30s。共30個循環。PCR產物進行瓊脂糖電泳，在紫外燈下回收130bp左右的條帶，DNA膠回收試劑盒純化目的條帶。1.5.2以本實驗室構建的pET28a-23DT-proinsulin為模板，設計引物，擴增pET28a-23DT-proinsulin中胰島素原與NcoI酶切位點之間片段。將其命名為fragment-proinsulin上遊引物c，(25bp)5'ATGAGTCGTTTTGTCAATCAGCACC3，下遊引物d，(21bp)5'CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3'使用PfuDNA聚合酶擴增，擴增條件為94t:，45s、68°C，120s。二步PCR，共30個循環PCR產物進行瓊脂糖電泳，在紫外燈下收580bp左右的條帶，DNA膠回收試劑盒純化目的條帶。1.5.3重疊區延伸法獲得融合基因由於下遊引物b的5'端與上遊引物c的5'端有12個鹼基的互補，所以以fragment-MSR與fragment-proinsulin為模板，通過PCR在退火時可以使fragment-MSR基因的單鏈與fragment-proinsulin基因的單鏈配對，通過DNA聚合酶的作用，得到將fragment-MSR與fragment-proinsulin連接的片段。命名為fragment-MSR-proinsulin。使用PfuDNA聚合酶擴增，擴增條件為94t:，45s、57°C，50s、72°C，80s。共30個循環。PCR產物進行瓊脂糖電泳，在紫外燈下回收710bp左右的條帶，DNA膠回收試劑盒純化目的條帶。1.6轉化與篩選擴增得到的fragment-MSR-proinsulin片段兩端分別含有AscI與NcoI酶切位點，將經AscI與NcoI酶切後的pAmk載體片段與經AscI與NcoI酶切後的fragment-MSR-proinsulin片段通過14連接酶進行連接，將連接產物轉化入大腸桿菌DH5a中，塗布於含有鏈黴素的LB平板(鏈黴素濃度為25iig/ml)過夜培養。得到轉化子，挑取轉化子，培養，提取質粒，以質粒為模板通過PCR來篩選陽性轉化子。採用擴增fragment-MSR片段的上遊引物a，與擴增fragment-proinsulin片段的下遊引物d，用於PCR反應篩選陽性克隆，引物序列如下上遊弓I物(20bp)5，GGAATTGTGAGCGGATAACA3，下遊引物(21bp)5'CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3'採用TaqDNA聚合酶，PCR反應條件為94°C，45s、57°C，50s、72°C，80s。共30個循環。PCR產物進行瓊脂糖電泳，陽性克隆條帶位於710bp左右。我們合成了測序引物5'GGAATTGTGAGCGGATAACA3'，對陽性克隆進行DNA序列測定(南京金思特公司)，測序結果表明，我們構建的表達質粒pAmk-MSR-proinsulin，與我們預期相同，即將MSR-proinsulin的序列克隆入質粒pAmk中。質粒的構建過程見圖1實施例2工程菌的構建與誘導表達2.1工程菌株的構建將表達質粒pAmk-MSR-proinsulin轉化入宿主菌BL21(DE3)中，塗布LB平板(鏈黴素的濃度為25iig/ml)，過夜培養，獲得轉化子。2.2外源蛋白的表達與電泳分析取例2.1中獲得的轉化子單菌落接入到5毫升LB培養基中(其中鏈黴素的濃度為25iig/ml)，37度180rpm，其間添加乳糖，過夜培養。取200ul菌液，5000rpm離心20分鐘，棄上清，菌體沉澱中加入60ul蒸餾水重懸，加入1X載樣緩衝液，在沸水浴中放置5分鐘後進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結果見圖2。其中泳道1為陰性對照，為BL21(DE3)菌體蛋白圖譜。泳道2和泳道3為基因工程菌的菌體蛋白電泳圖。通過軟體分析，胰島素原表達量約佔菌體總蛋白量的35%以上描述的具體實施方式在於闡述本發明的最佳實施方式而不是以任何形式限制本發明。本領域技術人員根據本發明的啟示，結合本領域的常識所做的各種變更，均落在本發明專利申請的權利要求範圍之內。序列表上海一就生物醫藥有限公司—種表達外源蛋白的表達系統10198DNA人工序列位於融合啟動子與起始密碼子之間的DNA序列的一種優選形式。1tcacacaggaaacagctggcgcgcccagcttcggcatggcacgtttgacgtgcctggtcg60gcagggtacgtttgaattattcataagaggaatacgtt98232PRT人工序列位於胰島素原N端的32個導肽序列。2MetSerLeuAsnThrSerGlyLeuGlyAlaSerThrMetGinlie151015SerlieGlyGlyAlaGlyGlyAsnAsnGlyLeuLeuGlyThrHis202530MetPhe3[O川]16PRT人工序列〈223〉位於胰島素原N端的16個導肽序列。3MetSerLeuAsnThrSerGlyLeuGlyAlaSerThrMetGinlie151015Ser48PRT人工序列位於胰島素原N端的8個導肽序列。4MetSerLeuAsnThrSerGlyLeu1554PRT人工序列位於胰島素原N端的4個導肽序列。5MetSerLeuAsn1623PRT人工序列位於胰島素原N端的23個導肽序列。6MetGlyAspGlulielieHisLeuThrAspPheAspValSerLeu151015AlaLeuThrGinThrGlySerLys20720DNA人工序列擴增片段fragment-MSR所設計的5'引物。7ggaattgtgagcggataaca20825DNA人工序列10擴增片段fragment-MSR所設計的3'引物。8aa^cgactcataacgtattcctct25925DNA人工序列擴增片段fragment-proinsulin所設計的5'引物。9atgagtcgttttgtcaatcagcacc251021DNA人工序列擴增片段fragment-proinsulin所設計的3'引物。10ccgccatggcgcttttgatcc211權利要求提供一種表達外源蛋白的表達載體質粒pAmk。2.按照權利要求1所述的表達載體質粒pAmk，其特徵在於包含由脂蛋白啟動子(plpp)和乳糖啟動子(P01ac)組成的融合啟動子。3.按照權利要求1所述的表達載體質粒pAmk，其特徵在於包含位於權利要求2中融合啟動子3'端下遊的一段基因序列形式。4.按照權利要求3中所述的基因序列形式，其具體形式為Xfa)ATGAGTY其中X代表位於權利要求2中所述的啟動子下遊的一個包含n個鹼基DNA序列，n的取值為1-150。ATGAGT編碼兩個氧基酸的導肽序列MS，Y代表位於MS後編碼一個胺基酸或一個多肽的DNA序列。5.按照權利要求1所述的表達載體質粒pAmk，其特徵在於包含脂蛋白終止序列(lpptranterm)。6.按照權利要求1所述的表達載體質粒pAmk，其特徵在於包含鏈黴素抗性基因(str)。7.按照權利要求1所述的表達質粒載體pAmk，其所轉化的宿主菌為大腸桿菌。8.將外源基因克隆入權利要求1所述的載體質粒pAmk，將表達質粒轉化入權利要求7所述的大腸桿菌中，誘導工程菌表達外源蛋白的方法。9.按照權利要求7所述的宿主菌，對其密碼子使用頻率進行分析，結果見下表。tableseeoriginaldocumentpage0全文摘要本發明提供了一種表達質粒pAmk，以及在表達質粒中位於融合啟動子下遊一種基因序列形式。以通過pAmk表達外源蛋白胰島素原(proinsulin)為例，介紹本發明表達系統的特點。提供以起始質粒pAmk建構表達質粒、轉化入表達宿主菌、通過乳糖誘導表達生產外源蛋白的方法。文檔編號C12P21/02GK101691578SQ20091003004公開日2010年4月7日申請日期2009年3月31日優先權日2009年3月31日發明者侯景,劉景晶,劉素麗,劉言華,孔婧,張笑巖,楊亞男,範豪,魯勇申請人:上海一就生物醫藥有限公司