一種用於在裡氏木黴細胞內表達外源蛋白的表達設備及其基因工程菌的製作方法

2023-09-19 23:31:15

專利名稱：一種用於在裡氏木黴細胞內表達外源蛋白的表達設備及其基因工程菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種用於在裡氏木黴(Trichodermareesei) 細胞內表達外源蛋白的表達設備及其基因工程菌。
背景技術：
裡氏木黴是在二戰時期從索羅門群島的棉製油布中分離得到的一種嗜溫腐生性絲狀真菌，具有良好的降解纖維素材料的能力。由於該菌由ReeseE. T.博士篩選鑑定，因此被命名為iTrichoderma reesei。作為工業菌株，Τ. reesei能夠生產分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶等，其中一些裡氏木黴突變株的胞外酶蛋白產量可達60g/L， 而最主要的纖維素酶CBHI (cellobiohydrolase I，纖維二糖水解酶I)，可以達蛋白分泌總量的50% (約30g/L)。裡氏木黴作為工業生產菌株生產纖維素酶、半纖維素酶已有多年的歷史，這些酶類被廣泛應用於紡織、造紙、製漿等工業領域。除具有極好的合成和分泌蛋白的能力以外，T. reesei還具有真核的蛋白分泌機制和與哺乳動物系統相似的蛋白質翻譯後修飾、加工性能，如高甘露糖型和N-糖基化。由於其適於蛋白生產的諸多優點，而且對人類沒有毒性，裡氏木黴也已成為相關研究人員開展真菌細胞學、遺傳學和生理生化研究的重要生物材料。美國能源部(NOE)資助支持了裡氏木黴基因組的測序工作，目前全基因組序列已經完成並公布。裡氏木黴全基因組測序的完成為利用功能基因組學方法研究具有重要生物學意義的功能基因奠定了基礎。農桿菌介導轉化法是利用農桿菌Ti質粒上的T-DNA將外源基因轉移到真菌基因組中的方法。根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化是近年來發展的一種新方法，與傳統的轉化方法相比，該方法操作簡便，可導入大片段的DNA，轉化效率高，導入基因大多是單拷貝，表達效果好，穩定遺傳。基於上述優點，農桿菌介導的轉化技術已成為目前真菌分子生物學研究中快速發展的轉化方法，成為真菌系統突變分析的有效工具。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對外源蛋白表達量低，分離純化困難的不足，提供一種操作簡便快捷的用於在裡氏木黴(Trichoderma reesei)細胞內表達外源蛋白的表達設備及其應用和所獲得的裡氏木黴基因工程菌，可高效分泌表達來源於動物、植物和真菌等的異源基因。本發明的第一方面提供一種用於在裡氏木黴(Trichoderma reesei)細胞內表達外源蛋白的表達設備，其中，所述的表達設備從5』至3』依次包括以下元件(1)控制外源基因在裡氏木黴中轉錄的啟動子；( 控制外源蛋白在裡氏木黴中分泌表達的信號肽的編碼序列；C3)多克隆位點；(4)控制外源基因在裡氏木黴中終止轉錄的終止子。本發明中，所述的啟動子是能夠控制外源基因在裡氏木黴中轉錄的啟動子，較佳的為裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(p。bhI)，更佳的啟動子的序列是序列表中 SEQ ID NO 18 所示。本發明中，所述的信號肽可以是本領域中能夠控制外源蛋白在裡氏木黴中分泌表達的任何信號肽(分泌肽)，較佳的信號肽的編碼序列為序列表中SEQ ID N0:1所示。本發明中，所述的多克隆位點可以是本領域各種常規的多克隆位點，較佳的多克隆位點序列是序列表中SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示。本發明中，所述的終止子是能夠控制外源基因在裡氏木黴中終止轉錄的終止子 (T。bhI)，較佳的是裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子，更佳的終止子的序列是序列表中SEQ ID NO 19所示。較佳的，所述的表達設備還包括以下元件( 篩選標記基因的表達盒，其位於元件(1)啟動子的上遊或元件(4)終止子的下遊。本發明中，所述的篩選標記基因的表達盒能夠在裡氏木黴中表達各種本領域的常規篩選標記，較佳的，所述的篩選標記是新黴素磷酸轉移酶、慶大黴素乙醯基轉移酶、或潮黴素磷酸轉移酶，較佳的篩選標記是潮黴素磷酸轉移酶，其基因序列較佳的是GeneBank的登錄號為Z32698. 1的第1437位位至第4057位所示。較佳的，所述的在裡氏木黴細胞內表達外源蛋白的表達設備還進一步包括外源蛋白的編碼序列，其位於第⑶元件多克隆位點之中、之前或之後。所述的外源蛋白是指來源於裡氏木黴以外的蛋白，包括動物、植物和真菌的蛋白。本發明中，較佳的，所述的表達設備還進一步包括第二個多克隆位點，該第二個多克隆位點位於第(4)元件終止子和第( 元件篩選標記基因的表達盒之間。本發明第二方面提供一種含有上述任何一種表達設備的載體，較佳的是根瘤農桿菌二元載體，如 T-DNA 表達載體 pPZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、 或pPK2，但不限於這些載體，更佳的選自ρΡΖΡ201ΒΚ、ρΒΙ121、或pCAMBIA。本發明第三方面提供一種含有上述任何一種載體的宿主細胞，較佳的是根瘤農桿菌 LBA4404、GV2260、C58C1、GV3100、A136、GV3101、GV3850、AGL-1、EHAlOl、EHA105，更佳的是根瘤農桿菌GV3101。本發明第四方面提供一種表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌，其基因組中含有任何一種如上所述的表達設備。所述的裡氏木黴屬於裡氏木黴種，較佳的是裡氏木黴 Trichoderma reesei QM6a、QM9414、QM 9123、Sa28、QM 9136、NRRL 3653、ME-446、DB746、 4065MG4、4065MG5、NRRL 3652、或NRRL 11236，更佳的是裡氏木黴 Trichoderma reesei RUT C30。本發明第五方面提供一種該表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌的製備方法包括，將上述含有外源蛋白基因的表達設備的根瘤農桿菌二元載體轉化根瘤農桿菌，將所得的根瘤農桿菌轉化子和裡氏木黴接合，挑選基因組中整合有外源蛋白基因的表達設備的接合子，即為表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌。該裡氏木黴基因工程菌可高效分泌表達來源於動物、植物和真菌等的異源基因。本發明第六方面提供一種生產蛋白的方法，包括培養所述的表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌，從培養物中獲得該外源蛋白。本發明的裡氏木黴基因工程菌可應用於製備工業酶製劑、飼料添加劑和蛋白質藥物。所述酶製劑為中性纖維素內切酶、纖維二糖酶、β葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶。
本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1、本發明的裡氏木黴表達設備在一環化質粒上，易於保存和DNA操作。2、本發明的裡氏木黴表達設備利用農桿菌結合轉移技術，可提高轉化效率，縮短操作時間和工作量。3、本發明的裡氏木黴表達設備具有優化的分泌表達能力，適合大多數異源基因的分泌表達。4、本發明的裡氏木黴表達設備的多克隆位點中含有稀有接口，兼容絕大多數異源基因的連接，節約操作時間提高工作效率。5、本發明的基因工程菌可以作為纖維素酶誘導劑篩選的靈敏指示劑。6、本發明的基因工程菌可高效表達中性纖維素酶，在造紙業和紡織業具有很重要的應用。7、本發明提供的表達設備，可實現來源於動物、植物和真菌的異源蛋白質基因在絲狀多細胞真核微生物裡氏木黴中的高效分泌表達。由於裡氏木黴培養條件粗放，適用於固體培養和液體深層發酵；裡氏木黴本身沒有毒性，在產酶條件下不會產生真菌毒素和抗生素，符合國際食品安全認證；裡氏木黴產生的胞外蛋白質易於分離純化，成本低廉。因此本發明可以為洗滌、紡織、飼料、食品、造紙、醫藥等酶製劑行業提供基因工程生產菌株，提高酶製劑的生產效率降低生產成本。


以下結合

本發明的特徵和有益效果。圖1為裡氏木黴表達設備TOF的物理圖譜。Pcbh I :cbh I啟動子；leader 分泌肽；MCS 多克隆酶切位點；Tcbh I :cbh I終止子；Hgy Box 潮黴素磷酸轉移酶基因篩選標
τ5 jB. O圖2為裡氏木黴表達載體pTO32F00的構建圖。。圖3為含紅色螢光蛋白的重組表達載體PTO32F01的構建圖。圖4為含中性纖維素內切酶Wgl的重組表達載體pTO32F02的構建圖。圖5為含中性纖維素內切酶Egl3的重組表達載體pTO32F03的構建圖。圖6為紅色螢光蛋白在裡氏木黴中的表達。A.誘導培養的菌絲在普通光源下觀察；B.誘導培養的菌絲在紅色螢光光源下觀察。圖7為不同纖維素酶誘導劑誘導紅色螢光蛋白胞外分泌表達。1.乳糖；2.纖維二糖；3. CMC ；4.微晶纖維素；5.濾紙纖維。圖8為裡氏木黴中的中性纖維素酶酶活。A.原始裡氏木黴；B. FGl ；C. FG2.
具體實施例方式一、裡氏木黴異源表達設備本發明提供了一種裡氏木黴異源表達設備。該表達設備通過農桿菌結合轉移裡氏木黴細胞。宿主菌屬於裡氏木黴種，較佳的是裡氏木黴iTrichodermareesei RUT C30。被表達的基因是與裡氏木黴異源的任何外源基因。
本發明的裡氏木黴表達設備的製備方法(1)通過PCR擴增，分別得到裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子 (Pcbhl)、外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子(T。bhI)、潮黴素磷酸轉移酶基因篩選標記盒各自DNA序列。(2)將啟動子(P。bhI)、分泌肽、多克隆位點、終止子(T。bhI)、潮黴素B篩選標記盒依次連接到表達載體中，構建得到重組表達載體1，即PWE32F00。這裡的表達載體主要起大量拷貝本表達設備和提供農桿菌結合轉移位點的作用，所以可以選擇任何一種農桿菌二元載體，如 PZP100、PPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI 121、pCAMBIA、pPK2，但不限於這些載體。(3)將外源目的基因插入到上述表達載體1中，使外源基因位於分泌肽和T。bhI之間，得到重組表達質粒2，即pWE32F01、pWE32F02和pWE32F03。上述步驟O)中，分泌肽和多克隆位點為人工合成；將啟動子、分泌肽、多克隆位點、終止子和篩選標記連接，可用限制性內切酶酶切和連接酶連接的方法將各個元件連入表達載體，所述的限制性內切酶酶切和連接酶連接都是本領域常規做法。上述步驟C3)中，將外源基因插入到上述表達載體1中，可用限制性內切酶酶切和連接酶連接的方法將外源基因連入表達載體1中，所述的限制性內切酶酶切和連接酶連接都是本領域常規做法。二、裡氏木黴基因工程菌本發明提供了一種裡氏木黴基因工程菌，該基因工程菌是將本發明的表達設備通過農桿菌接合轉移入裡氏木黴細胞，培養篩選轉化子製備而得，具體製備步驟如下(1)將本發明的含有表達設備的載體電轉化根癌農桿菌；再利用接合轉移機制轉化裡氏木黴細胞。(2)將上述轉化後的細胞進行篩選、鑑定，得到表達紅色螢光蛋白的重組裡氏木黴菌株，和高效表達中性纖維素內切酶的重組裡氏木黴菌株。下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進行。在本發明的下述實施例中，PDA培養基配方如下馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自來水lOOOmL，自然pH。Luria Bertani (LB)培養基的配方如下蛋白腖10g，酵母粉5g，氯化鈉10g。馬丁氏培養基的配方如下PePtonelg, YE 0. 3g，乳糖 20g，(NH4)2S041. 4g, Urea 0. 3g, KH2P042. Og, CaCl2O. 34g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, Mandels 微量元素液 lmL。Mandels 微量元素液(1000X)FeSO4 · 7H20 5g, MnSO4 · H2O 1. 6g, ZnSO4 · 7H20 1. 4g, CoCl · 6H202g,水定容至 1L。結合轉移用的培養基a. MM salts (IL)KH2P043. 625g, K2HP045. 125g, NaCl 0. 375g, MgSO4 · 7H20 1. 250g, CaCl2 · 2H20 0. 165g, FeSO4 · 7H20 0. 0062g, (NH4)2SO4L 250g.b. IM MES
6
21. 32g定容到IOOmL, pH5. 3 (5Μ KOH調節)需要過膜除菌。c. 5Μ KOH7. 013g 定容到 25mL。d. M-IOOTrace (0. 5L)H3B0330mg, MnCl2 · 4H20 70mg, ZnCl2200mg, Na2MoO4 · 2H20 20mg, FeCl3 · 6H20 50mg, GuSO4 · 5H20 200mg.e. M-IOOSalt (IL)KH2P0416g, Na2S044g, KCl 8g, MgSO4 · 7H20 2g, CaCl2Ig, M-IOOTrace 8mL.f. Induction MediumMM salts 80mL,葡萄糖 0. 36g，甘油 1. 26g, 24mLx8 分裝 8 瓶，水定容至 192mL，接種時每瓶加lmL(lM MES，過膜除菌)調節pH值，起到緩衝的作用。g. Induction Medium PlatesMM salts 160mL,葡萄糖 0. 36g,甘油 2. 52g,水定容至 384mL，96mLx4 分裝 4 瓶，每瓶中加入1.5g瓊脂，115°C，20min滅菌。倒平板前每瓶加入^ilLlM MES (過膜除菌)。h. M-IOOplates葡萄糖10g，KN033g，M-IOOSalt solution 62. 5mL，水定容至 1L，IOOmLxlO 瓶分裝， 每瓶加入0. 75g瓊脂。115°C，20min滅菌。i.乙醯丁香酮(AS)0. 01962 使用 DMSO 溶解定容至 0. 5mL。DNA 提取液的配方如下Tris-HCl (pH7. 5)0. 2mol/L，NaCl 0. 5mol/L, EDTAO. 01mol/L, SDS 1%。在本發明的下述實施例中使用的裡氏木黴是Trichoderma reesei RUTC30 (購自 ATCC)。質粒提取試劑盒購自hvitrogen (USA)，膠回收試劑盒購自OMEGA公司。實施例1包含本發明的裡氏木黴表達設備的表達載體的構建1. 1、裡氏木黴基因組的提取及檢驗將裡氏木黴Trichoderma reesei RUT C30接種於PDA培養基上，於沘°C下恆溫培養7天至孢子成熟。製備適量孢子懸液接種於馬丁氏培養基液體種子培養基中，於 300C ISOrpm條件下培養2天至菌絲體濃度達到4 5g/L用於提取基因組。本實施例採用本領域常用的真菌快速提取基因組法提取裡氏木黴的基因組DNA， 提取完畢後使用瓊脂糖凝膠電泳電泳檢驗所提取的基因組DNA。1. 2、裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(P。bhI)的分離根據GeneBank上發布的cbhl啟動子的序列，以上述提取的裡氏木黴基因組DNA 為模板，以上遊引物和下遊引物進行特異的PCR擴增分離P。bhI。上遊引物Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，其中含有EcoRV酶切位點。下遊引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，其中含有McII酶切位點。PCR擴增反應條件以及反應體系參照試劑盒說明書，PCR的擴增產物大小為 1490bp，該擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結果表明所獲得的擴增產物為目的片段。
1. 3、外切葡聚糖纖維二糖水解酶I終止子(T。bhI)的分離根據GeneBank上發布的cbh I終止子的序列，以上述提取的裡氏木黴基因組DNA 為模板，以上遊引物和下遊引物進行特異的PCR擴增分離T。bhI。上遊引物P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，其中含有MuI酶切位點。下遊引物P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，其中含有HpaI酶切位點。PCR擴增反應條件以及反應體系參照試劑盒說明書，PCR的擴增產物大小為 IlOObp,該擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結果表明所獲得的擴增產物為目的片段。1. 4、分泌肽leader和多克隆位點MCS合成利用DNA基因合成技術，人工合成分泌肽leader，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。利用DNA基因合成技術，人工合成多克隆位點MCS，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。 利用DNA基因合成技術，人工合成多克隆位點MCS，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。1. 5、潮黴素B篩選標記盒的獲得以質粒pAN7_l(NCBI gi :475166)為模板，使用引物經PCR擴增得到了潮黴素磷酸轉移酶篩選標記盒。上遊引物P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示，其中含有McI酶切位點；下遊引物P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示，其中含有^CbaI酶切位點。PCR擴增反應條件以及反應體系參照試劑盒說明書，PCR的擴增產物大小為264;3bp，該擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析和DNA序列分析，結果與質粒pAN7_l的 GeneBank中保留序列1 一致，所獲得的擴增產物為目的片段。1. 6、裡氏木黴pTO32F00表達載體的構建用兩種限制性內切酶的組合體系(EcoRV和SacII，SacII和PacI，PacI和StuI， StuI和Hpal，HpaI和SacI，SacI和Xbal，及EcoRV和XbaI)分別雙酶切上述實例1. 2、 1.3、1.4、1.5得到的？。_、T。bhI、分泌肽、多克隆位點、潮黴素磷酸轉移酶基因篩選標記盒片段和農桿菌二元載體pPZP201BK(取自新澤西州立大學的瓦克斯曼研究所的Peter Hajdukiewicz)。再用DNA連接酶將上述多個雙酶切片段相連。DNA連接反應完成將連接液轉入大腸桿菌感受態Dffia(天根公司)，然後塗布含有卡那黴素(50ug/ml)的LB平板。 挑出單克隆，接入含有卡那黴素(50ug/ml)的LB液體培養基，菌液用plasmidextraction kit (Omega, USA)提質粒。測序驗證出陽性轉化子，獲得表達載體PWE32F00，即得到用於表達外源基因的裡氏木黴表達載體。表達載體PWE32F00如圖2所示。插入序列結構示意圖如圖1所示。插入序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :20所示，其中第1-1490位是 Pcbhl，第1485-1565位是分泌肽，第1558-1578位是多克隆位點，第1573-2706位是Tebhl，第 2701-2723位是多克隆位點，第2718-5372位是潮黴素磷酸轉移酶基因篩選標記盒。實施例2利用裡氏木黴表達設備表達紅色螢光蛋白2. 1、紅色螢光蛋白基因Red的獲得以質粒pDSRed2-Nl (Clontech公司，貨號63M06)為模板，使用引物經PCR擴增得到了 697bp的紅色螢光蛋白Red基因。上遊引物P7，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示，其中含有I^cI酶切位點；下遊引物P8，其核苷酸序列如SEQ ID NO :11所示，其中含有EcoRV酶切位點。
擴增產物的長度為697bp，長度及序列分析的結果均與預期相符。2. 2、Red與表達設備的對接將上述擴增產物(red基因)經過I3acIjc0RV限制性酶切，使用T4連接酶連接到經過I^acI，EcoRV限制性酶切的表達載體PWE32F00中，得到了含Pebhl-Red_T。bhI表達設備的重組載體PWE32F01 (如圖3所示)。將PWE32F01轉化DH5a(天根公司)，然後塗布含有卡那黴素(50ug/ml)的LB平板。挑出單克隆，接入含有卡那黴素(50ug/ml)的LB液體培養基，菌液用plasmid extraction kit (Omega, USA)提質粒。測序驗證出陽性轉化子，獲得表達載體PWE32F01，即得到用於表達外源基因的裡氏木黴表達載體PWE32F01 (表達載體如圖 3所示)。2. 3、pTO32F01電轉根瘤農桿菌質粒PWE32F01電轉根瘤農桿菌GV3101感受態細胞(購買於中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心)，塗布在含Gen+Kan的LB平板上，確保細胞濃度稀釋到全部根瘤農桿菌均以單克隆形式出現。在30°C下培養48h。挑取單克隆的根瘤農桿菌接種到加了 Gen+Kan 的LB培養基中，放在30°C，200rpm的搖床中培養Mh。使用引物對做菌落PCR，篩選陽性轉化子。2. 4、根瘤農桿菌結合轉移倒化(111(^丨011 Medium Plates平板，並將醋酸纖維素膜覆蓋在培養基的上面。將裡氏木黴T.reesei RUT C30的孢子稀釋成合適的濃度。把上述步驟3電轉後的陽性根瘤農桿菌和該裡氏木黴孢子等體積混合，點到上述醋酸纖維素膜上。放在27°C下共培養4 後，把加了潮黴素和頭孢的M-100培養基倒在膜上，即為上層培養基。將平板放在30°C下培養。2. 5、轉化子的鑑定及目的基因的表達提取上述步驟4所得的陽性轉化子的基因組DNA作為模板，用引物P7(其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示)和P8 (其核苷酸序列如SEQ IDNO 11所示)進行PCR擴增。 結果顯示，抗性轉化子的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳得到大小約為697bp的red基因的特異帶，而用原始菌株T.reeseiRUT C30的基因組DNA為模板進行同樣的PCR反應，沒有出現擴增產物。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)和P4(其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示)擴增出3365bp的片段，對應於表達設備P。bhI-Red_T。bhI的大小。將獲得的重組裡氏木黴菌株接種於馬丁氏液體培養基中，30°C、200rpm振蕩培養 72h後，取發酵液點到載玻片上，放到螢光顯微鏡下觀察，紅色螢光蛋白的激發光557nm，發射光579nm。結果如圖6所示，重組裡氏木黴菌絲體在螢光顯微鏡下發出紅色螢光，而原始的裡氏木黴菌絲體在螢光顯微鏡下沒有紅色螢光。2. 6、探究紅色螢光蛋白的表達與纖維素酶誘導劑的關係將步驟2. 4得到的重組裡氏木黴基因工程菌的孢子接種到添加了 2%葡萄糖的馬丁氏液體培養基中，於30°C，200rpm振蕩培養48h，菌體生長至生長旺盛期後，用沒有添加任何糖的馬丁氏液體培養基洗滌菌體3次，離心收集菌體用沒有添加任何糖的馬丁氏液體培養基復溶，然後以相同體積分裝到添加不同底物的誘導產酶培養基(馬丁氏培養基)中， 在30°C，200rpm的條件下繼續培養，定時取樣使用螢光酶標儀測定在激發光535nm，發射光 595nm處的螢光吸收值，結果見圖7所示。可見，最佳碳源依次是微晶纖維素，濾紙纖維，CMC，乳糖，纖維二糖。實施例3利用本發明表達設備表達中性纖維素酶3. 1、中纖纖維素酶基因wgl、egl3的分離Wgl基因的分離wgl基因是Bicillus subtilis W168(ATCC)菌株中纖維素內切酶，其最適pH值在中性，wgl基因的NCBI保存號為M16185. 1。以 Bicillus subtilis W168 菌株(ATCC 23857)的基因組 DNA 為模板，以 P9、P10 引物進行PCR擴增，得到wgl基因。上遊引物P9，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示，其中含有I^cI酶切位點；下遊引物P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示，其中含有MuI酶切位點。擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，其分子大小為1428bp，與預期結果相符合；經DNA序列分析，其序列與GeneBank上發布的序列一致。egl3基因的分離egl3 基因為 Humicola grisea var. thermoidea 菌株中纖維素內切酶，egl3 基因的NCBI保存號為AB003107. 1。以人工合成egl3基因(序列見NCBI :AB003107. 1)為模板，以Pll、P12引物進行 PCR擴增，得到egl3基因。上遊引物Pll，其核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示，其中含有I^cI酶切位點；下遊引物P12，其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示，其中含有MuI酶切位點。擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，其分子大小為867bp，與預期結果相符合；經DNA序列分析，其序列與GeneBank上發布的序列一致。2、wgl、egl3與表達設備對接分別將上述所獲得的wgl、egl3基因經I^cI和MuI酶切後與經同樣酶切的表達載體PWE32F00連接，經轉化大腸桿菌DH5 α，獲得含表達設備P。bhI_wgI-Tebhl和 PcbhI-egl3-TcbhI的重組質粒，分別是質粒pTO32F02、pffE32F03,如圖4、5所示。將重組質粒中的表達設備進行DNA測序分析，結果表明表達設備中各元素包括啟動子、目的基因以及終止子的結構完全正確。3、電轉分別將質粒pTO32F02、pffE32F03電轉根瘤農桿菌感受態細胞，塗布在含Gen+Kan 的LB平板上，確保細胞濃度稀釋到全部根瘤農桿菌均以單克隆形式出現。在30°C下培養 48h。挑取單克隆的根瘤農桿菌接種到加了適量Gen+Kan的LB培養基中，放在30°C，200rpm 的搖床中培養Mh。通過測序驗證篩選陽性轉化子。4、結合轉移倒化(111(^丨011 Medium Plates平板，並將醋酸纖維素膜覆蓋在培養基的上面。將裡氏木黴T.reesei RUT C30的孢子稀釋成合適的濃度。把上述步驟3電轉後的陽性根瘤農桿菌和該裡氏木黴孢子等體積混合，點到膜上。放在27°C下共培養4 後，把加了潮黴素 B和頭孢噻唑的M-100培養基倒在膜上，即為上層培養基。將平板放在30°C下培養。5、篩選及鑑定從上述步驟4所得的平板上挑取的單個菌落，即重組菌株，進行基因型鑑定。以重組菌株的基因組DNA為模板，使用引物P9(其核苷酸序列如SEQID NO :12所示)和PlO (其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示)擴增出14^bp的片段，對應於基因wgl的大小。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示)和P4 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示) 擴增出4096bp的片段，對應於表達設備大小P。bhI-wgl-T。bhI的大小，該重組菌株命名為陽1。以重組菌株的基因組DNA為模板，使用引物Pll (其核苷酸序列如SEQID N0:14所示)和P12(其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示)擴增出867bp的片段，對應於基因egl3 的大小。使用引物Pl (其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)和P4 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示)擴增出3535bp的片段，對應於表達設備大小P。bhI-egl3-T。bhI的大小，該重組菌株命名為TO2。6、重組菌株表達產物分析將在含潮黴素的PDA平板上生長良好的重組菌株rei、re2接種於含有2%葡萄糖的液體馬丁氏培養基中，培養一定時間後，按照合適的接種量轉接到含有2%乳糖的液體馬丁氏培養基中。培養2d後。取發酵液測中性纖維素內切酶活。其中，酶活力單位定義為每毫升酶液每分鐘水解羧甲基纖維素鈉(CMC)產生1 μ g還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為一個酶活力單位。結果見圖8，可見，中性纖維素酶wgl，egl3在裡氏木黴菌株已經表達。
權利要求
1.一種用於在裡氏木黴(Trichoderma reesei)細胞內表達外源蛋白的表達設備，其特徵在於，所述的表達設備從5』至3』依次包括以下元件(1)控制外源基因在裡氏木黴中轉錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在裡氏木黴中分泌表達的信號肽的編碼序列；(3)多克隆位點；(4)控制外源基因在裡氏木黴中終止轉錄的終止子。
2.如權利要求1所述的表達設備，其特徵在於，所述的啟動子是裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I啟動子(P。bhI)；所述的終止子是裡氏木黴外切葡聚糖纖維二糖水解酶I 終止子。
3.如權利要求1或2所述的表達設備，其特徵在於，所述的表達設備還包括以下元件 (5)篩選標記基因的表達盒，(5)篩選標記基因的表達盒，其位於元件⑴啟動子的上遊或元件(4)終止子的下遊。
4.如權利要求1 3任一項所述的表達設備，其特徵在於，所述的在裡氏木黴細胞內表達外源蛋白的表達設備還進一步包括外源蛋白的編碼序列，其位於第( 元件多克隆位點之中、之前或之後。
5.一種含有如權利要求1 4任一項所述表達設備的載體。
6.一種含有如權利要求5所述載體的轉化子。
7.—種表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌，其特徵在於，其基因組中含有如權利要求4所述的表達設備。
8.—種如權利要求7所述的表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌的製備方法，其特徵在於，包括將含有如權利要求5所述的表達設備的根瘤農桿菌二元載體轉化根瘤農桿菌， 將所得的根瘤農桿菌轉化子和裡氏木黴接合，挑選基因組中整合有外源蛋白基因表達設備的接合子，即為表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌。
9.一種生產蛋白的方法，其特徵在於，包括培養如權利要求7所述的表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌，從培養物中獲得外源蛋白。
10.如權利要求7所述的表達外源蛋白的裡氏木黴基因工程菌在製備工業酶製劑、飼料添加劑或蛋白質藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於在裡氏木黴(Trichoderma reesei)細胞內表達外源蛋白的表達設備及其基因工程菌。該表達設備從5』至3』依次包括以下元件(1)控制外源基因在裡氏木黴中轉錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在裡氏木黴中分泌表達的信號肽的編碼序列；(3)多克隆位點；(4)控制外源基因在裡氏木黴中終止轉錄的終止子。將外源基因插入上述表達設備中，經T-DNA二元載體轉化根瘤農桿菌，和裡氏木黴接合，所得裡氏木黴基因工程菌可高效分泌表達來源於動物、植物和真菌等的異源基因，從中獲得外源蛋白的大量生產。該裡氏木黴培養條件粗放，適合固體培養和液體深層發酵，在產酶條件下不會產生真菌毒素和抗生素，產生的胞外蛋白質易於分離純化，成本低廉。
文檔編號C12N1/21GK102268448SQ20111017781
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者呂丹丹, 王瑋, 魏東芝 申請人:華東理工大學