一種定點刪除轉基因細胞中的外源基因的方法

2023-09-19 23:33:05 2

專利名稱：一種定點刪除轉基因細胞中的外源基因的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種定點刪除轉基因細胞中的外源基因
的方法。
背景技術：
自從1997年，體細胞克隆羊"多莉"誕生以來，利用轉有目的基因的體細胞做供 體，通過體細胞核移植技術生產轉基因家畜逐漸成為生產轉基因大動物的主要方法。目前 在獲得轉有目的基因的體細胞的過程中，普遍採用的方法是將真核抗性基因(也稱標記基 因，如neomycin等)與目的基因構建在同一個載體上，通過細胞轉染後對標記基因的篩選 從而獲得穩定整合了外源目的基因的體細胞。然而，轉基因動物中標記基因的存在給轉基 因動物的後續研究帶來了許多不便[1]。一，目前可以作為真核篩選基因進行轉基因動物研 究的標記基因非常有限，當轉基因動物中已存在某一選擇標記基因時，該標記基因在隨後 的再次轉基因中就不能再作為選擇標記，限制了多基因轉基因的研究，尤其在哺乳動物基 因敲除的研究中，常染色體等位基因的雙敲除需要兩個不同的標記基因，在對另一等位基 因進行敲除前，必須進行標記基因的刪除；二，用於高效表達標記基因的外源啟動子和增強 子元件的存在可能影響目的基因整合位點附近調控元件的作用，從而可能影響轉基因動物 的表型分析。此外，對於乳腺生物反應器研究來說，標記基因的存在使得目的蛋白的分離純 化和檢測增加了一定的難度；對於轉基因動物食品安全性評價研究，標記基因的存在增加 了轉基因動物及轉基因食品對人類健康的潛在危險，使轉基因食品安全性評價的研究更為複雜。 因此，培育無標記基因的轉基因動物，對轉基因動物研究的進一步發展及轉基因 動物食品安全具有重大的意義。 Cre重組酶於1981年從Pl噬菌體中發現，屬於A Int酶超基因家族。Cre重組酶 基因編碼區序列全長1029bp (EMBL資料庫登錄號X03453)，編碼38kDa蛋白質。Cre重組酶 是一種位點特異性重組酶，能介導兩個34bp的LoxP位點(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT)之間的特異性重組，是LoxP位點間的序列或基因被刪除。 目前，對於轉基因動物細胞中標記基因的刪除多採用1996年Abuin等在小鼠胚胎 幹細胞中建立的方法。即用真核表達cre重組酶的載體轉染細胞後，用1，3，5-三-苯甲醯 基-2-去氧-2-氟-P-D-核糖(FIAU)篩選標記基因獲得刪除的細胞。該方法需要在構建 表達載體時引入與FIAU作用的負篩選基因，同時需FIAU進行藥物篩選，無疑增加了載體構 建難度和細胞篩選步驟。

發明內容
本發明的目的在於提供一種定點刪除轉基因細胞中外源基因的方法。 本發明的方法是將螢光蛋白基因與cre基因重組構建表達載體，導入到目的細胞
中，通過檢測螢光蛋白來篩選基因被定點刪除的細胞。
為實現上述目的，首先構建表達螢光蛋白與cre重組酶重組表達的表達載體。在本發明的一個實施方案中，所採用的螢光蛋白為綠螢光蛋白(GFP)。將構建的表達載體導入目的細胞，通過流式細胞儀分選表達螢光蛋白的細胞，這些細胞就是基因被定點刪除的細胞。 在本發明中，被定點刪除的基因是指在LoxP-Nn-LOXP (l表示序列長度為n的核苷酸序列)結構當中的DNA序列，其可以是外源基因，或者是標記基因。例如在本發明的一個實施例中，被刪除的基因為neo標記基因。 在本發明中，目的細胞是指含有LoxP-Nn-LOXP結構需要將Nn定點刪除的細胞。 在本發明中，將表達載體導入目的細胞的手段包括各種轉化或轉染的方法，例如
磷酸鈣、脂質體介導的化學轉染方法，基因槍、電穿孔、顯微注射等物理方法。 在本發明實施例中，通過構建表達GFP和ere的表達載體，導入穩定整合了
LoxP-neo-LoxP結構的轉基因牛耳成纖維細胞，流式細胞儀分選細胞，經鑑定表明，GFP陽
性的細胞neo基因均被刪除，而GFP陰性的細胞則含有neo基因。說明，通過本發明方法能
夠準確篩選出基因被定點刪除的細胞。 本發明方法能夠準確篩選出基因被定點刪除的細胞，避免了藥物篩選，為篩選基因被定點刪除的細胞，特別是標記基因刪除的細胞的篩選提供了新途徑。對培育無標記基因的轉基因動物，對轉基因動物研究的進一步發展及轉基因動物食品安全具有重大的意義。


圖1顯示的是實施例1構建的表達GFP和ere重組酶的表達載體。
圖2顯示的是實施例lcre-IRES EGFP酶切鑑定結果。其中1&9， lkb梯度DNA分子量標準；2&3， cre-IRES EGFP質粒Xba I酶切結果，6. lkb ;4&5， cre-IRES EGFP質粒Not工、Xba I雙酶切結果，4. 7kb+l， 351bp ;6&7， cre-IRES EGFP質粒Nhe 1、Bsiw I雙酶切結果，5. lkb+l， 032bp ;8， cre-IRES EGFP質粒對照。 圖3顯示的是實施例2cre-IRES EGFP質粒瞬時轉染細胞ere重組酶表達的Western blot檢測結果。 圖4顯示的是實施例3cre-IRES EGFP質粒瞬時轉染細胞後marker free細胞克隆點的鑑定結果。其中1， Marker ;2-11，不同的Marker free細胞克隆點細胞；12，轉有LoxP-NEO-LoxP結構的轉基因牛的基因組；13，含有LoxP-NEO-LoxP結構的單標載體；14，正常牛對照；15，空白對照。 圖5顯示的是實施例4用marker free細胞為供體細胞核移植獲得的囊胚的鑑定。其中1， Marker ;2-8， Marker free細胞為供體核移植獲得的囊胚；9，轉有neo單標的轉基因牛的基因組；10，含有neo的單標載體；ll，正常牛對照；12，空白對照。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例中所使用的載體、菌種、試劑及其來源 pIRES2-EGFP和pIRES-NE0載體(Clontech公司)，pIREShyg3載體(Clontech公司)，PBS185(GibcoBRL)pMD19-T (TaKaRa公司);宿主菌大腸桿菌DH5a本實驗室保存；引物合成由上海生工完成；序列測定由北京優博公司完成；LA Taq酶、T4DNA連接酶、內切酶均購自TaKaRa公司；抗ere重組酶抗體購自Abeam公司，HRP標記的二抗購自KPL公司；細胞培養基DMEM、 PBS和胎牛血清購自Gibico公司；脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；蛋白提取細胞裂解液購自碧雲天公司。293T細胞(人胎腎細胞)購自北京協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心。酶切、連接、回收、轉化、PCR擴增等常規實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
實施例lcre重組酶真核表達載體的構建 以PBS 185質粒為模板，設計PCR引物擴增ere重組酶的CDS序列，同時在序列的
兩端分別引入Nhel和BsiWI酶切位點。 所設計的上下遊引物分別為Nhe I-Cre-F :GAAGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACBsi WI-Cre-R :TCTCGTACGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG Cre CDS擴增的反應體系為50 反應體系，其中PBS185質粒1 (200ng/ii 1) ， primer (20pmo1/ yl)各1 ， dNTP (10mM) 6 ii 1 ， 5 X LA PCR Buffer 5 ii 1 ， LA Taq酶(Takara) 0. 3 ii 1 。 反應程序為94t:預變性5min，98t:變性10s，68t:退火延伸lmin，共35個循環，72 °C 10min。 將PCR產物回收連接到pMD19-T載體上，經過測序鑑定正確後，Nhe I和BsiW I雙酶切回收1032bp的片段，連接到同樣經過Nhe I和BsiW I雙酶切的pIREShyg3的多克隆位點上獲得pcre-IREShyg載體。 以pIRES2-EGFP質粒為模板，設計PCR引物擴增IRES EGFP序列，在序列的上遊引物5'端引入NotI酶切位點，在下遊引物上突變掉Not I酶切位點同時引入XbaI酶切位點，上遊引物為Not I-IGFP-F :ATAGCGGCCGCACTAGAGGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCC，下遊引物為Xbal-IGFP-R :TGATCTAGAGTCGCGGCGGCTTTAC，反應體系和反應程序同上，將PCR產物回收連接到pMD19-T載體上，經過測序鑑定正確後，Not I和Xba I雙酶切回收1351bp的片段，連接到同樣經過Not I和Xba I雙酶切的pcre-IREShyg載體上，取代pcre-IREShyg載體上IRES hyg序列，構建完成成功表達cre重組酶和GFP但不含真核抗性基因的載體。其酶切鑑定結果如圖2所示。 實施例2 293T細胞和牛成纖維細胞轉染及cre重組酶的表達檢測
2. 1細胞培養及瞬時轉染 取牛耳組織剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍後分批植塊於含lmLDMEM/F12+10% FBS的25cm2的培養瓶中，待組織塊貼壁牢固後再補加DMEM/F12+10% FBS至6mL，於37°C、5% C02培養箱培養6 7d，每2d換液1次，待細胞生長匯合後，以0. 25%trypsin消化傳代2 3次，分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO凍存，即培養出牛成纖維細胞。
將293T細胞和牛成纖維細胞分別接種於6孔細胞培養板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至70-80%匯合度時，按照說明書要求，用Lipofectamine 2000脂質體將cre重組酶表達載體PBS185和pcre-IRESEGFP轉入細胞中。
2. 2Western blot檢測cre重組酶的表達 轉染後的細胞在37t:培養箱中培養48小時後，用碧雲天公司的細胞裂解液裂解，
裂解產物以12， 000rpm離心10分鐘後取上清做Western blot雜交。雜交中轉有PBS185
的細胞表達的cre重組酶為陽性對照，使用的一抗為小鼠抗cre重組酶的單克隆抗體，二抗
為辣根過氧化氫酶偶聯的兔抗鼠抗體。雜交結果表明pcre-IRESEGFP載體在哺乳動物細胞
中能夠有效表達cre重組酶(圖3)。 實施例3基因刪除細胞的篩選及鑑定 lLoxP-Nn_LoxP結構的構建 用引物擴增或酶切連接等方法將兩個LoxP位點引物pIRES-NE0載體的Neo表達框兩端，構建成pIRES-LoxP-NE0-LoxP，其中LoxP-NEO-LoxP結構兩端可引入特殊酶切位點，以用於連接到其它特異表達載體。LoxP-NEO-LoxP結構中的NEO基因還可以用其它任意基因結構(Nn， N代表核苷酸序列，n代表核苷酸數)替代，即構建成LoxP-Nn-LOXP結構。
2細胞培養及瞬時轉染 將上述LoxP-Nn-LoxP結構(以LoxP-neo-LoxP結構為例)直接轉染牛成纖維細胞，可獲得穩定整合LoxP-neo-LoxP結構的轉基因牛成纖維細胞，將上述轉基因牛成纖維細胞接種於6孔細胞培養板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至70-80%匯合度時，按照說明書要求，用Lipofectamine 2000脂質體將cre重組酶表達載體pcre-IRESEGFP轉入細胞中。 2轉染後細胞的流式分選及單克隆培養 轉染後的細胞在37t:培養箱中培養48小時，0. 1 %的胰酶消化，流式細胞儀分選表達GFP的陽性細胞，按照500個細胞/100mm培養皿的密度接種細胞，在含10%胎牛血清的匿EM培養基中培養7至8天至長出明顯的單細胞克隆點。
3單細胞克隆點neo基因刪除的鑑定 將生長狀態良好的單細胞克隆點細胞用0. 1%的胰酶消化轉接到48孔細胞培養板中，待細胞長滿需要傳代時，取2， 000-3， 000個細胞做細胞PCR。設計跨LoxP-neo-LoxP結構的引物，用以鑑定neo基因是否被刪除。上遊引物SM-14 :AACCTACTCGAGATAACTTC，下遊引物SM-1922 :GATGGTCGATAGATAACTTC，如果neo基因沒有被刪除，應擴增出1. 9kb左右的PCR產物。為了避免在刪除neo基因的同時，引入GFP和cre重組酶基因，分別設計了擴增GFP和cre重組酶基因的引物(GFP上遊引物TGCAGTGCTTCAGCCGCTAC， GFP下遊引遊CTCAGGTAGTGGTTGTCGGG ;cre上遊引物ACATTTGGGCCAGCTAAAC， cre下遊引物CGGAAATCCATCGCTCGACC)用以確定體細胞中無GFP和cre重組酶的整合。細胞PCR結果如圖4，結果表明，除11泳道樣品以外，其它樣品均成功刪除neo基因，並且沒有GFP和cre重組酶的整合。 4囊胚PCR進一步確定neo基因的刪除 根據細胞PCR的結果，隨機挑選7個不同neo—GFP—cre—的克隆點細胞作為核移植供體細胞進行體細胞核移植，取發育7天的囊胚分別做單囊胚PCR進一步確認neo基因的刪除，PCR結果如圖5，所用囊胚均無neo基因的存在，並且沒有GFP和ere重組酶基因的隨機整合。 由此可見，利用本發明方法構建的表達ere重組酶的載體可以不經過藥物篩選直接獲得標記基因刪除的單細胞克隆點，用這些細胞作為體細胞核移植的供體細胞可以獲得標記基因刪除的克隆囊胚。
序列表說明 SEQ ID No. l&2是用於擴增ere酶基因CDS序列的引物對；SEQID No. 3&4是用於擴增IRES EGFP序列的引物對；SEQ ID No. 5&6用以鑑定neo基因是否被刪除的引物對；SEQID No. 7&8以及SEQ IDNo. 9&10是分別用以擴增GFP和ere重組酶基因的引物對。序列表〈110〉北京濟普霖生物技術有限公司〈120〉 一種定點刪除轉基因細胞中的外源基因的方法〈130>KHP08113406. 3〈160>10〈170>PatentIn version 3.5〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gaagctegca tgtccaattt actgacegte c〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tctcgtecgc teatcgecat cttccagcag〈210>3〈211>41〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3ategeggecg cactegagga attccgcccc tctccctccc c〈210>4〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tgatctegag tcgcggcggc tttec
7〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列5aacctactcg agateacttc〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6gatggtcgat agateacttc〈210>7〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tgcagtgctt cagccgctec〈210>8〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8ctcaggtegt ggttgtcggg〈210>919〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9acatttgggc cagcte朋c10〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10
權利要求
一種表達螢光蛋白和cre重組酶的表達載體。
2. 如權利要求1所述的表達載體，其中所述螢光蛋白為綠螢光蛋白。
3. —種定點刪除轉基因細胞中外源基因的方法，其包括如下步驟用權利要求1或2 所述的表達載體導入目的細胞，流式細胞儀分選表達螢光蛋白的細胞，其中所述目的細胞 含有LoxP-Nn-LOXP結構，Nn為序列長度為n的外源基因。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，還包括進一步培養分選出來的細胞，並用 PCR法鑑定。
5. 如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，所述的外源基因為標記基因。
6. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的標記基因為neo基因。
7. 如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，所述的目的細胞為轉基因動物細胞。
8. —種篩選被定點刪除基因的細胞的方法，其包括如下步驟用權利要求1或2所述 的表達載體導入目的細胞，流式細胞儀分選表達螢光蛋白的細胞，其中所述目的細胞含有 LoxP-Nn-LOXP結構，Nn為序列長度為n的外源基因。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，還包括進一步培養分選出來的細胞，並用 PCR法鑑定。
10. 如權利要求8或9所述的方法，其特徵在於，所述的外源基因為標記基因。
全文摘要
本發明提供了一種定點刪除轉基因細胞中外源基因的方法，其通過構建表達螢光蛋白和cre重組酶的表達載體，將該表達載體導入目的細胞中，從而在目的細胞中cre重組酶與螢光蛋白共表達，cre酶定點刪除掉LoxP-Nn-LoxP結構中的NnDNA序列，通過檢測細胞中螢光蛋白的表達，即達到分選基因被定點刪除的細胞。本發明方法能夠對外源基因或標記基因進行準確的刪除，並能準確分選出基因被定點刪除的細胞，避免了使用藥物分選，對培育無標記基因的轉基因動物，對轉基因動物研究的進一步發展及轉基因動物食品安全具有重大的意義。
文檔編號C12Q1/68GK101760473SQ20081024659
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月25日 優先權日2008年12月25日
發明者丁方榮, 孫秀柱, 戴蘊平, 李寧, 王少華 申請人:北京濟普霖生物技術有限公司