一種基於受體的檢測β-內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法

2023-09-20 02:18:55 2

一種基於受體的檢測β-內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法
【專利摘要】一種基於受體的檢測β-內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法，屬於免疫學檢測【技術領域】。本發明試紙條包括PVC背襯，PVC背襯前端設置樣品墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜後端與吸水墊連接；結合微孔板上含有抗β-內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物的混合物；硝酸纖維素膜上依次包被有氨苄西林-BSA檢測線和羊抗鼠IgG控制線。本發明適合進行現場檢測的免疫層析色譜檢測法，能實現至少十五種β-內醯胺類抗生素的多殘留檢測；檢測快速，僅需要5-10min；便攜，適合現場檢測；操作簡便，不需要專業技術人員。
【專利說明】—種基於受體的檢測β-內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於受體的檢測β -內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法，屬於免疫學檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]因為現有獸藥種類繁多，就β內醯胺類抗生素也有很多種，僅是單殘留檢測遠不能滿足對獸藥濫用而導致的藥物殘留的很好檢測。運用抗原抗體反應能夠實現對一小部分的β內醯胺類抗生素的檢測，但仍難以滿足多殘留檢測的需要。現有的能實現多殘留檢測的方法主要是儀器分析，其中包括高效液相色譜法、液質聯用(HPLC-MS)、氣質聯用(GC-MS)和TTC法等。但這些檢測方法需要昂貴的儀器設備，操作需要專業技術人員，且不能適應高通量、現場的快速檢測。因此實現具有快速，便攜優點的免疫檢測方法的多殘留檢測具有現實意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種基於受體的能夠同時檢測十五種β_內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條及其製備方法，該方法是基於針對該類抗生素的受體的。
[0004]本發明的技術方案，一種基於受體的檢測內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條，包括PVC背襯，在PVC背襯前端設置樣品墊，樣品墊為德國Schleicher&Schuell公司的Glass24墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜後端與吸水墊連接，吸水墊材料是吸水紙；硝酸纖維素膜上依次包被有氨苄西林-BSA檢測線和羊抗鼠IgG控制線；與其配套使用的結合微孔板，結合微孔板上的微孔中含有抗β_內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物的混合物。
[0005]所述基於受體的檢測β -內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條的製備方法，製備步驟為:
(1)氨苄西林-BSA偶聯物的製備:將氨苄西林(AMP)與碳二亞胺(EDC)以1: 3摩爾比溶於pH 5,0.0lmol/L 2_(N_嗎啉代)乙磺酸(MES)溶液中，室溫攪拌活化lh，按摩爾比AMP: BSA=50: I稱取BSA溶解在0.01M、pH7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液中，將AMP的活化物逐滴滴入BSA溶液中，室溫反應4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶聯物；
(2)製備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原製成20-40nm膠體金顆粒；
(3)抗β-內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物的製備:取步驟(2)製備的4mL膠體金調至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β -內醯胺類抗生素受體0.4mL，放置30min後加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%,放置至少30min後，10000 rpm離心50min,並用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩衝液4mL重懸兩次，最後用該硼酸鹽緩衝液0.4mL重懸，得到穩定的抗β -內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物。[0006](4)小鼠陰性血清-膠體金標記物的製備:將步驟(3)中的抗β -內醯胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重複步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標記物。
[0007](5)製作配套使用的結合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物按體積比1:1混合後，取10 μ L混合物包被在96微孔板上；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氨苄西林-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測線和控制線，在37°C烘箱乾燥；
(7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條，即得到用於檢測的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
[0008]所述基於受體的檢測β -內醯胺類抗生素的免疫膠體金試紙條的應用，其特徵在於可以檢測至少15種β內醯胺類抗生素；分別為阿莫西林，氨苄西林、青黴素G、青黴素V、鄰氯青黴素，雙氯青黴素，萘夫西林、苯唑西林、頭孢克洛，頭孢替唑、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢硫脒，頭孢吡肟。
[0009]本發明的有益效果:本發明提供一種便攜、快速、適合進行現場檢測的免疫層析色譜檢測法(gold immunochromatography assay;GICA),能實現至少十五種β_內醯胺類抗生素的多殘留檢測。本發明檢測快速，僅需要5-10min ;便攜，適合現場檢測；操作簡便，不需要專業技術人員。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1組裝完成的免疫層析試紙條結構。1、PVC背襯；2、樣品墊，3、硝酸纖維素膜，
4、吸水墊，5、檢測線，6、控制線。
[0011]圖2該試紙條對氨苄西林等十五種β -內醯胺類抗生素的檢測結果。
【具體實施方式】
[0012]實施例1
如圖1所示，PVC背襯I 一端依次粘貼樣品墊2、硝酸纖維素膜3，另一端粘附吸水墊4，硝酸纖維素膜3上包被了氨苄西林-BSA作為檢測線5，和羊抗鼠IgG作為控制線6。配套使用的微孔板上包被了抗β-內醯胺類抗生素的簇特異性抗體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物。
[0013]按以下步驟製備:
(1)氨苄西林-BSA偶聯物的製備:將氨苄西林與EDC以1: 3摩爾比溶於MES(0.0lmol/L、pH 5)，室溫攪拌活化lh，之後將活化物逐滴加入溶解了 BSA的HEPES(0.01mol/L、pH 7)中，BSA和氨苄西林的摩爾比為1:50，反應4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶聯物；
(2)製備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原製成20nm-40nm膠體金顆粒；
(3)抗β-內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物的製備:取步驟(2)製備的4mL膠體金調至pH 9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β-內醯胺類抗生素受體
0.4mL,放置30min後加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min後，10000 rpm離心50min，並用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩衝液4mL重懸兩次，最後用該硼酸鹽緩衝液0.4mL重懸，得到穩定的抗β -內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物；
(4)小鼠陰性血清-膠體金標記物的製備:將步驟(3)中的抗β_內醯胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重複步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標記物；
(5)製作配套使用的結合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗β_內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物按體積比1:1混合後，取IOyL混合物包被在96微孔板上；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氨苄西林-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測線和控制線，在37°C烘箱乾燥；
(7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條。即得到用於檢測的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
[0014]應用實施例1
將陰性的純牛奶與0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液(A液)，用0.0lM PBS:DMF=I: I的混合溶液分別配製lmg/mL的阿莫西林，氨苄西林，青黴素G，青黴素V，鄰氯青黴素，雙氯青黴素，萘夫西林，苯唑西林，頭孢克洛，頭孢替唑，頭孢噻肟，頭孢噻呋，頭孢哌酮，頭孢硫脒，頭孢吡肟，頭孢氨苄，頭孢羥氨苄，頭孢拉定，頭孢呋辛，頭孢地嗪。用A液稀釋得到濃度為Wg/mL的標準品溶液。
[0015]檢測時取50 μ L lPg/mL的上述標準品溶液,加入已經包有金標受體和金標小鼠陰性血清的微孔板中，反應3min，然後將試紙條樣品墊一端浸入樣本溶液，液面不得超過MARK線,5_15min內可以判定結果,30min後結果無效。
[0016]結果判斷:若檢測線和控制線同時出現紅色條帶，則說明該受體不能識別該種抗生素，或者靈敏度過低。若控制線沒有紅色條帶出現則表示該試紙條無效。
[0017]將上述檢測線不出現紅色條帶的標準品溶液繼續用A液稀釋到合適梯度，用多個試紙條同時進行上述檢測步驟，至檢測線出現有梯度的紅色條帶為止，得到合適的梯度條帶後，拍照保存。
[0018]如圖2所示，每根試紙條測試內容如下:(I) Ong/mL阿莫西林；(2) Ing/mL阿莫西林；(3) 2ng/mL阿莫西林；(4) 2ng/mL氨節西林；(5) 5ng/mL氨節西林；(6) 0.5ng/mL青黴素 G ; (7) Ing/mL 青黴素 G ; (8) Ing/mL 青黴素 V ; (9) 2ng/mL 青黴素 V ; (10) 5ng/mL鄰氯青黴素；(11) 10ng/mL鄰氯青黴素；(12) 10ng/mL雙氯青黴素；(13) 20ng/mL雙氯青黴素；(14) 5ng/mL萘夫西林；(15) 10ng/mL萘夫西林；(16) 20ng/mL苯唑西林；(17)50ng/mL 苯唑西林；(18) 50ng/mL 頭孢克洛；(19) IOOng /mL 頭孢克洛；(20) I Ong/mL 頭孢替唑；(21) 25ng/mL頭孢替唑；(22) 250ng/mL頭孢噻廂；(23) 500ng/mL頭孢噻月虧；(24) 25ng/mL 頭孢噻呋；(25) 50ng/mL 頭孢噻呋；(26) 5 ng/mL 頭孢哌酮；(27) 10 ng/mL頭孢哌酮；(28) 25 ng/mL頭孢硫脒；(29) 50 ng/mL頭孢硫脒；(30) 10 ng/mL頭孢批月虧；
(31)25 ng/mL頭孢卩比月虧。
【權利要求】
1.一種基於受體的檢測β-內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條，其特徵在於:包括PVC背襯(1)，在PVC背襯(I)前端設置樣品墊(2),樣品墊為德國Schleicher&Schuell公司的Glass24墊，樣品墊(2)與硝酸纖維素膜(3)前端連接，硝酸纖維素膜(3)後端與吸水墊(4)連接，吸水墊材料是吸水紙；硝酸纖維素膜(3)上依次包被有氨苄西林-BSA檢測線(5)和羊抗鼠IgG控制線(6);與其配套使用的結合微孔板，結合微孔板上的微孔中含有抗β_內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物的混合物。
2.權利要求1所述基於受體的檢測內醯胺類抗生素的免疫層析試紙條的製備方法，其特徵在於製備步驟為: (1)氨苄西林-BSA偶聯物的製備:將氨苄西林與碳二亞胺EDC以1: 3摩爾比溶於0.0lmol/L、pH 5的2-(N-嗎啉代)乙磺酸MES中，室溫攪拌活化lh，之後將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES中，牛血清蛋白BSA和氨苄西林的摩爾比為1: 50，室溫反應4h，用生理鹽水4°C透析3天，形成氨苄西林-BSA偶聯物； (2)製備膠體金顆粒:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原製成20-40nm膠體金顆粒； (3)抗β-內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物的製備:取步驟(2)製備的4mL膠體金調至pH 9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的抗β -內醯胺類抗生素受體0.4mL,放置30min後加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%,放置至少30min後，IOOOOrpm離心50min,並用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩衝液4mL重懸兩次，最後用該硼酸鹽緩衝液0.4mL重懸，得到穩定的抗β-內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物； (4)小鼠陰性血清-膠體金標記物的製備:將步驟(3)中的抗β_內醯胺類抗生素受體替換為陰性小鼠的純化血清，重複步驟(3)，得到小鼠陰性血清-膠體金標記物； (5)製作配套使用的結合微孔板:將步驟(3)和步驟(4)得到的抗β_內醯胺類抗生素受體-膠體金標記物和小鼠陰性血清-膠體金標記物按體積比1:1混合後，取10 μ L混合物包被在96微孔板上； (6)硝酸纖維素膜的處理:將氨苄西林-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜上，依次作為檢測線和控制線，在37°C烘箱乾燥； (7)試紙條的組裝:將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條，即得到用於檢測的免疫層析試紙條，4°C冷藏備用。
3.權利要求1所述基於受體的檢測內醯胺類抗生素的免疫膠體金試紙條的應用，其特徵在於可以檢測至少15種β內醯胺類抗生素；分別為阿莫西林，氨苄西林、青黴素G、青黴素V、鄰氯青黴素，雙氯青黴素，萘夫西林、苯唑西林、頭孢克洛，頭孢替唑、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢硫脒，頭孢吡肟。
【文檔編號】G01N33/532GK103983775SQ201410254564
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】匡華, 胥傳來, 郭靖男, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:無錫傑聖傑康生物科技有限公司, 江南大學