用於檢測和鑑定超廣譜β-內醯胺酶的方法

2023-09-20 02:14:05 1

專利名稱:用於檢測和鑑定超廣譜β-內醯胺酶的方法
技術領域：
本發明公開的實施方式涉及分子診斷，並且尤其是涉及用於檢測和鑑定攜帶有超廣譜內醯胺酶(ESBL)的微生物的診斷，並且尤其是涉及用於檢測和鑑定攜帶有CTX-M 基因的微生物的診斷。
背景技術：
β -內醯胺酶對於β -內醯胺藥物具有抗性。這些酶破壞β -內醯胺抗生素的 β -內醯胺環，所述β -內醯胺抗生素例如青黴素、頭孢菌素、頭黴素和碳青黴烯(厄他培南 (ertapenem))0這些抗生素在它們的分子結構中具有共同的單元被稱為β _內醯胺的四原子環。內醯胺酶破壞該環，使之開環，使所述分子的抗菌性質失活。
超廣譜β -內醯胺酶(extended spectrum β -lactamase, ESBL)日益成為全球出現的醫院感染的原因，並還令人擔憂地成為公共問題的原因(Rossolini等，2008，CMI)。 ESBL是水解具有氧亞胺基側鏈的超廣譜頭孢菌素的β-內醯胺酶。這些頭孢菌素包括頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢他啶，以及氧亞胺基單環內醯胺氨曲南。因此，ESBL對於這些抗生素和相關的氧亞胺基β-內醯胺類具有抗性。最為公眾所知的ESBL來自於TEM-I、ΤΕΜ-2 或SHV-I基因，並包括改變這些β-內醯胺酶的活性位點附近的胺基酸的構型的突變。這擴展了易受這些酶水解的內醯胺抗生素的範圍。
TEM和SHV典型變種例如TEM和SHV，在影響了歐洲大部後，目前正在美國迅速蔓延，而一種新型的ESBLJP CTX-M，則流行於南美、地中海和西歐國家(Govinden等，2007， AJB)。在20世紀80年代晚期的日本、歐洲和阿根廷，特別是在1989年的德國，發現了最新的變種，可將其名字歸因於其對於頭孢噻肟的高的抵抗活性(Naas等，2008，CMI)。其被認為是所有變種中最有影響的組(Rasmussen和Hoiby，2004，CJM)。它的出現可能是增加頭孢曲松和/或頭孢噻肟的使用以治療細菌感染的結果，已知其來源於克羅非菌屬的成員中的基因。到目前為止，根據Lahey Clinic網站(可登陸全球資訊網址lahey. org/Studies)，已經記載了超過85種CTX-M衍生物，其可以分成5個種系組(phylogenetic group) (CTX-M-I、 2、8、9 和 25)。[0010]CTX-M抗性基因發現於腸桿菌科，其可以輕易地穿透物種之間的質粒。包括肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等在內的具有CTX-M基因的腸細菌種被認為是尿路感染的主要原因。 其它的腸桿菌科，例如陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌、產氣腸桿菌以及產酸克雷伯桿菌，也可以攜帶CTX-M基因。檢測CTX-M抗性品系特別關鍵，因為需要與醫院中的其他病人隔離，並且僅剩下碳青黴烯作為感染的主要治療手段。
直到最近，獲知品系抗性的唯一途徑是進行手工抗微生物敏感性試驗。敏感性試驗有很多缺點，包括需要大量的時間獲得結果，即48 96小時。首先，操作者需要從樣本中分離出菌株，這可能需要48小時；然後，繼續進行生化鑑定，這又需要18 24小時；然後進行手工抗微生物敏感性試驗，這可能還需要佔用24小時。除了在獲得結果上的延誤外， 手工試驗方法還遭遇其它問題，例如，由於抗生素盤的不適當儲存和抗生素盤的不適當擴散造成的缺乏重現性，以及缺乏標準化方法。
ESBL檢測的特異性和準確性非常重要，因為假陰性結果可能導致開業醫生設計出不適當的抗生素療法，例如採用第三代頭孢菌素或氨曲南治療ESBL感染的個體。這給治療的個體帶來了不必要的風險，並且還增加了臨床環境(例如醫院)中交叉汙染的機率。 由於一些產ESBL品系在體外不會對所有的採用建議的轉效點的第三代或第四代頭孢菌素顯示抗性，因此臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)推薦報導對於青黴素、頭孢菌素和氨曲南耐受的產EBSL腸桿菌科(CLSI，Ml 00-S1 8)，因為它們的結果可能是臨床耐受。攜帶有CTX-M抗性基因的生物體水解較新的頭孢菌素和氨曲南的能力使得它們的檢測更加困難。CLSI指南提出，產CTX-M品系的存在的錯誤診斷取決於最初篩選和確認試驗中所使用的藥物。
本文所公開的實施方式提供了優於其他用於檢測和鑑定具有ESBL例如CTX-M抗性基因的細菌的方法的優勢，包括提高的精確性，可在較短時間內獲得結果，以及不需要進行附加的步驟，例如用於檢測ESBL的瓊脂糖凝膠電泳(Lartigue等，2004，FEMS ML ；Pitout 等，2004，凡1^^0肚等，2007丄10)。而且，本文所公開的實施方式提供了優於其他已報導的用於檢測ESBL(包括CTX-M)的方法的優勢，這是因為，本文所公開的方法和組合物明確設計用於檢測和鑑定新發現的CTX-M基因的異構體，所述異構體在例如美國專利申請公開號US20070248954中所描述的分析方法開發時還是未知的。US20070248954中公開的方法使用與新發現的CTX-M異構體的序列不完全互補的引物，這樣會損害特異性，或者甚至導致假陰性結果。

發明內容
提供了用於快速、靈敏地檢測具有抗生素抗性的ESBL(包括CTX-M基因)的組合物和方法。所述組合物包括寡核苷酸引物和探針集，用於在樣品中檢測CTX-M核酸和/或其他ESBL核酸的存在。這些引物和探針集可以用在擴增方法(例如PCR，特別是定量PCR) 中，並可以裝入試劑盒中，以應用於目的是在測試樣品(特別是病人樣品)中檢測ESBL基因存在的擴增方法中，由此，所述基因的檢測表示所述樣品中包含具有ESBL的細菌。
因此，在一個實施方式中，本發明提供寡核苷酸引物和探針，其包括SEQID NO 1 24所列出的序列中的至少10個保守核苷酸，或者基本由SEQ ID NO 1 24所列出的序列中的至少10個保守核苷酸組成，或者由SEQ ID NO 1 24所列出的序列中的至少10個保守核苷酸組成。本文公開的引物和/或探針可以用在檢測和/或鑑定樣本中具有超廣譜β -內醯胺酶(例如CTX-M)的微生物的存在的方法中。
本發明進一步提供用於在樣品中檢測ESBL基因(例如CTX-M)的試劑盒，其中，所述試劑盒包含本文公開的實施方式的組合物。在一些實施方式中，所述試劑盒可以包括將所提供的組合物用於基於聚合酶的擴增反應(例如PCR或QPCR)的說明。
其他的實施方式涉及檢測的方法從待分析超廣譜β-內醯胺酶(例如CTX-M)的存在的樣本中獲得樣品；在標準PCR條件下，將所述樣品與擴增引物集接觸，其中，所述擴增引物集包含至少一對引物對，其中，所述引物集包含一個以上的具有通用鹼基的引物，其中，所述引物對與位於超廣譜β-內醯胺酶基因(例如CTX-M)內的靶序列側翼的核酸雜交，並且其中，所述引物對產生靶擴增產物；提供用於引物延伸的試劑和條件，以產生靶擴增產物；確定靶擴增產物的存在和/或量。
本發明還涉及本文公開的實施方式的引物和探針的用途，其中，所述引物或探針具有根據SEQ ID NO :1 M所限定的任意序列的序列。


圖1表示被分成4組的所有CTX-M基因的系統發育樹，產酸克雷伯桿菌 (Klebsiella oxytoca)是夕卜類群。
圖2表示序列排列，其顯示了本文所公開的用於檢測CTX-M-I組(Ctxml-616F/SEQ ID NO 1) (ctxml-740R/SEQ ID NO 2) (ctxml/2_657B/SEQID NO 5)的引物的位置。還顯示了 以前公開的擴增引物(CTXM1-F3/SEQ IDNO 40) (CTXM1-R2/SEQ ID NO 41)。所示出的參考序列是所有CTX-M-I序列排列的共有序列。所示出的共有序列對應於SEQ ID NO :48。
圖3表示序列排列，其顯示了本文所公開的用於檢測CTX-M-2組(Ctxm2-609F/SEQ ID NO 3) (ctxm2-776R/SEQ ID NO 4) (ctxm 1/2-657B/SEQID NO 5)的引物的位置。還顯示了以前公開的擴增引物(T0H01-2F/SEQ ID NO 42) (Τ0Η0 1-1R/SEQ ID NO :43)。所示出的參考序列是所有CTX-M-2序列排列的共有序列。所示出的共有序列對應於SEQ ID NO 49。
圖4表示序列排列，其顯示了本文所公開的用於檢測CTX-M-8組(Ctxm8-119R/SEQ ID NO 7) (ctxm8-7F/SEQ ID NO 6) (ctxm8/9_42B/SEQ IDNO :10)的引物的位置。還顯示了以前公開的擴增引物(CTXM825F/SEQ IDNO 44) (CTXM825/SEQ ID NO :45)。所示出的參考序列是所有CTX-M-8序列排列的共有序列。所示出的共有序列對應於SEQ ID NO :50。
圖5表示序列排列，其顯示了本文所公開的用於檢測CTX-M-9組(Ctxm9-7F/SEQ ID NO 8) (ctxm9-117R/SEQ ID NO 9) (ctxm8/9_42B/SEQ IDNO :10)的引物的位置。還顯示了 以前公開的擴增引物(CTXM914F/SEQ IDNO 46) (CTXM914R/SEQ ID NO 47)。所示出的參考序列是所有CTX-M-9序列排列的共有序列。所示出的共有序列對應於SEQ ID N0:51。
具體實施方式
本文公開的實施方式涉及用於有效和特異性檢測和/或鑑定具有超廣譜β -內醯胺酶(ESBL)的微生物的方法和組合物。
在本文中所使用的術語「超廣譜β -內醯胺酶」或「ESBL」意指這樣的β -內醯胺酶其能夠通過水解青黴素、第一、第二和第三代頭孢菌素和氨曲南(但不是頭黴素和碳青黴烯)而對這些抗生素產生細菌抗性，並且其可以被內醯胺酶抑制劑例如克拉維酸所抑制。本領域技術人員可以理解，術語「ESBL」包括目前已知的和將來發現的所有超廣譜 β -內醯胺酶，其包括但不限於Lahey Clinic網站在全球資訊網址lahey. org/Studies上列出的所有ESBL。因此，術語ESBL包括SHV或巰基可變型、TEM型、TOHO和CTX-M型的ESBL。
在一些實施方式中，將所述組合物和分析用於檢測和鑑定CTX-Μβ-內醯胺酶。以前，已經對CTX-M酶進行了詳細地綜述(Bonnet，R.，等.(2004)，β-內醯胺酶生長組CTX-M 酶(Growing group of extended-spectrum beta-lactamases :the CTX-M enzymes).抗微生物製劑化學療法(Antimicrob. Agents Chemother). 48 :1-14)。 CTX-Μβ-內醯胺酶的一些代表性的、非限制性的特徵如下頭孢噻肟在抗性範圍內的最低抑菌濃度(MIC) (> 64 μ g/ml)，而對於頭孢他啶的MIC則顯然在敏感範圍O 8 μ g/ml)。 但是，CTX-M型ESBL實際上能水解頭孢他啶，並對該頭孢菌素產生抗性(MIC高達256 μ g/ ml)。氨曲南MIC是可變的。CTX-M型β-內醯胺酶水解頭孢吡肟，頭孢吡肟的MIC高於在產生其他的ESBL型的細菌中觀察到的MIC。他唑巴坦對於CTX-M型β-內醯胺酶顯示了高於克拉維酸幾乎10倍的抑制活性。一些細菌可能同時攜帶有CTX-M型和SHV型ESBL或者 CTX-M型ESBL和AmpC型β -內醯胺酶，它們可能改變抗生素抗性表型。
本文所公開的實施方式能快速檢測和/或鑑定CTX-M β -內醯胺酶，其包括被鑑定為CTX-M-I至CTX-M-82的CTX-Mβ -內醯胺酶，包括在表1列出的菌株中發現的一些或所有CTX-M型β -內醯胺酶。
表 1
權利要求
1.用於檢測和或鑑定樣本中具有CTX-M超廣譜內醯胺酶的微生物存在的方法，其包括從待分析CTX-M基因的存在的樣本中獲得樣品；在標準PCR條件下，將所述樣品與擴增引物集接觸，其中，所述擴增引物集包含至少一對引物對，其中，所述引物集包含一個以上的具有通用鹼基的引物，其中，所述引物對與位於CTX-M超廣譜β -內醯胺酶基因內的靶序列側翼的核酸雜交，並且其中，所述引物對產生靶擴增產物；提供用於引物延伸的試劑和條件，以產生靶擴增產物；以及確定靶擴增產物的存在和/或量，其中，所述靶擴增產物的存在說明所述CTX-M基因的存在。
2.根據權利要求
1所述的方法，進一步包括將所述樣品與至少一種與所述靶擴增產物雜交的探針進行接觸。
3.根據權利要求
1所述的方法，其中，所述擴增引物集包含多個擴增引物對，其中，在至少兩個CTX-M基因的核酸的存在下，所述多個擴增引物對共同地與所述至少兩個CTX-M 基因的核酸雜交，並製備靶擴增產物，所述至少兩個CTX-M基因來自於至少兩個CTX-M組， 所述至少兩個CTX-M組選自於由CTX-M-I、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25所組成的組中。
4.根據權利要求
5所述的方法，其中，在所述CTX-M基因的核酸的存在下，所述多個擴增引物對共同地與所述CTX-M基因的核酸雜交，並製備靶擴增產物，所述CTX-M基因來自於 CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9 和 CTX-M-25 的組。
5.根據權利要求
1所述的方法，其中，所述擴增引物集包含多個擴增引物對，其中，在 CTX-M異構體1 82的存在下，所述多個擴增引物對共同地與所述CTX-M異構體1 82雜交，並製備靶擴增產物。
6.根據權利要求
1所述的方法，其中，所述擴增引物集包含多個擴增引物對，其中，在來自於表1列出的每個菌株的CTX-M核酸的存在下，所述多個擴增引物對共同地與所述來自於表1列出的每個菌株的CTX-M核酸雜交，並製備靶擴增產物。
7.根據權利要求
2所述的方法，其中，所述探針選自於由分子信標探針、TAQMAN 螢光探針和蠍型螢光探針所組成的組中。
8.根據權利要求
5所述的方法，進一步包括在標準PCR條件下將所述樣品與至少一種與所述靶擴增產物雜交的探針接觸，所述靶擴增產物來自於至少兩個CTX-M組靶擴增產物。
9.根據權利要求
5所述的方法，進一步包括在標準PCR條件下將所述樣品與一種以上的探針接觸，其中，所述一種以上的探針共同地與來自於CTX-M組CTX-M-I、CTX-M-2、 CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25的靶擴增產物雜交。
10.根據權利要求
5所述的方法，進一步包括在標準PCR條件下將所述樣品與至少一種以上的探針接觸，其中，所述一種以上的探針共同地與來自於CTX-M組CTX-M-1、CTX-M-2、 CTX-M-8、CTX-M-9、和CTX-M-25的靶擴增產物雜交。
11.根據權利要求
1所述的方法，其中，所述擴增引物集包含至少兩個引物，其中，每個引物包含選自於由下列序列組成的組中的至少12個保守核苷酸CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO 1)； TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO 2)； GGTMTGCCGAAATSffTGG(SEQ ID NO 3)； CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO 4)； TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO 6)； GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO 7)； TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO 8)； AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO 9)； 或它們的互補序列。
12.根據權利要求
11所述的方法，進一步包括將所述樣品與至少一種探針接觸，其中， 所述至少一種探針包含選自於由 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO 33組成的組中的至少12個保守核苷酸。
13.根據權利要求
1所述的方法，其中，所述擴增引物集包含至少兩個引物，其中，每個引物包含選自於由下列序列組成的組中的至少12個保守核苷酸CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO 1)； TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO 2)； GGTMTGCCGAAATSffTGG(SEQ ID NO 3)； CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO 4)； TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO 27)； GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO 28)； TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO 29)； AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO 30)； 或它們的互補序列。
14.根據權利要求
13所述的方法，進一步包括將所述樣品與至少一種探針接觸，其中， 所述至少一種探針包含選自於由 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO 33組成的組中的至少12個保守核苷酸。
15.用於檢測和/或鑑定樣本中具有CTX-M超廣譜β-內醯胺酶的微生物存在的試劑盒，其包括擴增引物集，其中，所述擴增引物集包含至少一對引物對，並且其中，所述引物集包含一個以上的具有通用鹼基的引物，其中，所述至少一對引物對與位於CTX-M超廣譜β -內醯胺酶基因內的靶序列側翼的核酸或包含部分CTX-M超廣譜β-內醯胺酶基因的靶序列側翼的核酸雜交。
16.根據權利要求
15所述的試劑盒，進一步包括與所述靶序列雜交的至少一種探針。
17.根據權利要求
15所述的試劑盒，其中，所述擴增引物集包含多個擴增引物對，並且其中，在標準PCR條件下，在至少兩個CTX-M基因的核酸的存在下，所述多個擴增引物對能夠共同地與所述至少兩個CTX-M基因的核酸雜交，並製備靶擴增產物，所述至少兩個 CTX-M基因來自於至少兩個CTX-M組，所述至少兩個CTX-M組選自於由CTX-M-I、CTX-M-2、 CTX-M-8、CTX-M-9、和 CTX-M-25 所組成的組中。
18.根據權利要求
17所述的試劑盒，其中，在標準PCR條件下，在CTX-M基因的核酸的存在下，所述多個擴增引物對能夠共同地與所述CTX-M基因的核酸雜交，並製備靶擴增產物，所述 CTX-M 基因來自於 CTX-M-I、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9 和 CTX-M-25 組中。
19.根據權利要求
15所述的試劑盒，其中，所述擴增引物集包含多個擴增引物對，其中，在標準PCR條件下，在CTX-M異構體1 82的存在下，所述多個擴增引物對能夠共同地與所述CTX-M異構體1 82雜交，並製備靶擴增產物。
20.根據權利要求
23所述的試劑盒，其中，所述探針選自於由分子信標探針、TAQMAN 螢光探針和蠍型螢光探針所組成的組中。
21.根據權利要求
17所述的試劑盒，進一步包括至少一種能在標準PCR條件下與所述靶擴增產物雜交的探針，所述靶擴增產物來自於至少兩個CTX-M組靶擴增產物。
22.根據權利要求
19所述的試劑盒，進一步包括一種以上的探針，其中，所述一種以上的探針能在標準PCR條件下共同地與來自於CTX-M組CTX-M-l、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9 和CTX-M-25的靶擴增產物雜交。
23.根據權利要求
15所述的試劑盒，其中，所述擴增引物集包含至少兩個引物，其中， 每個引物包含選自於由下列序列組成的組中的至少12個保守核苷酸CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO 1)； TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO 2)； GGTMTGCCGAAATSffTGG(SEQ ID NO 3)； CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO 4)； TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO 6)； GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO 7)； TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO 8)； AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO 9)； 或它們的互補序列。
24.根據權利要求
23所述的試劑盒，進一步包括至少一種探針，其中，所述至少一種探針包含選自於由 SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 10, SEQ IDNO :31、SEQ ID NO 32 禾 P SEQ ID NO: 33組成的組中的至少12個保守核苷酸。
25.根據權利要求
15所述的試劑盒，其中，所述擴增引物集包含至少兩個引物，其中， 每個引物包含選自於由下列序列組成的組中的至少12個保守核苷酸CYGCTTCCTGGGTTGTGG(SEQ ID NO 1)； TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG(SEQ ID NO :2)； GGTMTGCCGAAATSffTGG(SEQ ID NO :3)； CGCAGCCAGAAHATCCCGAC(SEQ ID NO :4)； TGTRTGCSCAGGCGAACG(SEQ ID NO :27)； GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG(SEQ ID NO :28)； TTTATGCGCAGACGAGTG(SEQ ID NO :29)； AAAGCACCTGCGTATTATCT(SEQ ID NO :30)； 或它們的互補序列。
26.根據權利要求
25所述的試劑盒，進一步包括至少一種探針，其中，所述至少一種探針包含選自於由 SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 10,SEQ IDNO :31、SEQ ID NO 32 禾P SEQ ID N0:33組成的組中的至少12個保守核苷酸。
27.根據權利要求
15所述的試劑盒，進一步包括擴增引物對，其中，所述擴增引物對與位於碳青黴烯酶基因內的靶序列側翼的核酸或包含部分碳青黴烯酶基因的靶序列側翼的核酸雜交。
專利摘要
本發明這裡所公開的實施方式涉及用於檢測和/或鑑定攜帶有超廣譜(extended spectrum)β-內醯胺酶基因的微生物的組合物。具體地，本發明提供寡核苷酸、探針以及包含它們的試劑盒，用於檢測細菌的CTX-M序列。本發明還提供用於檢測和/或擴增存在於微生物的超廣譜β-內醯胺酶基因(包括CTX-M型超廣譜β-內醯胺酶基因)的方法。
文檔編號C12P19/34GKCN102388150SQ201080015156
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月19日
發明者伊莎貝爾·迪託, 凱薩琳·利佩, 塞麗娜·羅歇-達爾貝特 申請人:吉恩奧姆科技公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan