一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法

2023-09-20 02:20:15

專利名稱：一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測技術，尤其涉及一種基於受體傳感器用於液相環境中檢測苦味物質地那的方法。
背景技術：
苦味物質檢測在食品科學、生物醫學、環境保護等領域具有重要的應用，具有十分廣闊的應用前景和市場開發價值。苦味化合物的種類多樣、結構各異，給檢測帶來諸多困難。傳統的檢測方法是基於質譜分析技術，所需儀器昂貴、操作複雜、分析檢測周期長，難以滿足當今對苦味物質現場、快速檢測的需求。新興的生物傳感器為解決這一難題提供了新的技術途徑。但是目前用於苦味物質檢測的生物傳感器多是利用類脂膜、溴化物等材料作為敏感元件，存在特異性差、靈敏度低和不穩定的缺點，其應用難以滿足特異性苦味物質檢測的要求。因此，如何獲得高度特異的敏感元件，並實現敏感元件與二級傳感器的穩定耦合是目前苦味物質檢測傳感器進一步發展亟需解決的難題。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，該方法包括以下步驟:
(1)製備苦味受體蛋白T2R4;
(2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面製成受體傳感器；
(3)將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩定的狀態後，再將含有某一確定濃度的苦味物質地那的溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩定後，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應值，最後再泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin後，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩定後，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質地那的溶液進行下一次檢測；重複上述步驟，可以得到一系列苦味物質地那的濃度對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線；
(4)對於未知濃度的苦味物質地那，首先將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩定的狀態Ftl後，再將含有未知濃度的苦味物質地那的待測溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩定到F1後，得到諧振頻率改變量F1- F0,最後根據上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度，實現液相中苦味物質地那的濃度檢測。進一步地，所述步驟(I)包括以下子步驟:
(1.0構建表達載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號肽序列全長cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構建苦味受體基因22的表達載體過程如下:首先，設計相應的引物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，並對苦味受體基因進行適當的修飾，上遊引物序列如SEQ ID N0.2所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈式反應使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，溫度循環首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最後是20 0C降溫20秒；擴增後的產物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達載體的構建，並通過測序對基因序列進行鑑定得表達載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示；
(1.2)人胚胎腎細胞HEK-293的培養和轉染:HEK_293細胞培養液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青黴素(100 U/mL)和鏈黴素(100 μ g/mL)的DMEM，培養條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱；轉染之前一天，HEK-293細胞被接種於六孔培養皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細胞500 μ L，在不含抗生素的培養液裡生長至轉染前90-95%的融合度；轉染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構建好的表達載體pCEP4/rho-T2R4-hise轉染HEK-293細胞；每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清培養液稀釋到50 μ L，混勻；再用無血清細胞培養液稀釋10 UL的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養液的孔中，前後搖板混勻後，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細胞膜表面表達；
(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉染後的HEK-293細胞用PBS清洗，並從六孔板收集；收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然後16000 g離心40 min ;浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉澱，沉澱物和尿素標本緩衝液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然後，將尿素樣品緩衝液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達於細胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細胞膜組分用於構建石英晶體微天平傳感器，細胞膜的疏水環境有利於保持苦味受體的結構和功能。所述步驟(2)具體為:本發明的苦味受體傳感器製備過程如下；在乾淨的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的Hi s6-tag標籤的自組裝巰基化單鏈DNA適配體，該適配體由5』末端共價修飾了 HS-(CH2)6基團的SEQ ID N0.5所示的基因序列組成,反應條件為室溫下反應I小時；用質量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白T2R4的細胞膜均勻塗覆在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，並放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白通過融合表達的His6_tag與適配體發生特異性的結合，實現在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS衝洗，除去未結合的多餘物質；完成石英晶體微天平傳感器的構建。本發明的有益效果，本發明採用苦味受體蛋白作為傳感器的敏感元件，克服了傳統的苦味物質檢測傳感器中所採用的類脂膜、溴化物等材料存在的特異差、靈敏度低的缺點，可以實現液相環境中特異性苦味物質地那的檢測。該傳感器採用自組裝適配體固定苦味受體蛋白，不僅可以形成高度穩定的自組裝敏感膜，提高傳感器的穩定性，而且由於適配體和苦味受體蛋白間特異性的相互作用，可以實現膜受體的片上純化，細胞膜上其它蛋白由於缺乏與適配體的親和力，在製備傳感器的過程中會被衝洗去除，進而有利於提高受體蛋白在傳感器表面的固定效率和分布密度，最終有助於提高傳感器的靈敏度、特異性和穩定性。該檢測方法檢測腔小，可以大大節約檢測試劑，顯著減少樣品的消耗量。此外，該傳感器採用石英晶體微天平作為二級傳感器，可以實現對苦味物質的實時、快速檢測，克服了基於質譜的檢測方法存在的檢測周期長、檢測流程複雜、無法實現現場檢測的缺點，適合應用於進一步開發可攜式苦味物質檢測傳感器。以上這些優點和功能可以滿足液相環境中特異性苦味物質的實時快速檢測，可廣泛用於生物醫學、環境保護和食品行業等相關領域。


圖1是本發明用於特異性苦味物質檢測傳感器的檢測腔體結構 圖2是本發明苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面的結構示意圖
圖3是本發明製備苦味受體蛋白的基因表達結構 圖4是本發明製備苦味受體蛋白的RT-PCR檢測結果 圖5是本發明表達有苦味受體蛋白的HEK-293細胞在可見光視野下的圖片。圖6是與圖5同一視野下的表達有苦味受體蛋白的HEK-293細胞螢光照片。圖7是本發明的傳感器檢測不同苦味物質的結果 圖8是本發明的傳感器檢測不同濃度地那的結果 圖中，注射泵1、第一矽膠導管2、第二矽膠導管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11、脂質雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體\B、Kpn /酶切位點19、Μ /酶切位點20、rho-tag信號肽21，苦味受體基因22、His6-tag 標籤基因 23。
具體實施例方式下面詳細介紹以苦味受體蛋白T2R4作為敏感元件的石英晶體微天平傳感器檢測苦味物質的基本原理以及具體步驟。本發明基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，包括以下步驟:
1、製備苦味受體蛋白T2R4，該步驟包括以下子步驟:
1.1表達載體的構建 含有苦味受體基因22 (人苦味受體基因T2R4)和rho-tag信號肽21序列全長cDNA的質粒的基因序列如SEQ ID N0.1。採用基因工程技術，對苦味受體基因22進行適當改造，構建苦味受體基因22的表達載體。首先，設計相應的引物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，並對苦味受體基因進行適當的修飾。上遊引物序列如SEQ ID N0.2所示:5』 -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3，，其中下劃線部分為 kozak序列，有助於提高受體蛋白的表達量；下遊引物序列如SEQ ID N0.3所示:5』 -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3』，其中下劃線部分為序列23的反向互補序列，用於苦味受體蛋白13的標記以及與二級傳感器的耦合。聚合酶鏈式反應(PCR)使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，包括IyL pCEP4/rho~T2R4質粒，I μ L上遊引物，I μ L下遊引物，4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR ，10 μ L PCR緩衝液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水；溫度循環首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環的95°C變性30秒、58 V退火30秒、72°C延伸60秒，最後是20 V降溫20秒。擴增後的產物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點命/7 /和/之間，完成苦味受體的表達載體的構建，並通過測序對基因序列進行鑑定得表達載體的基因序列如SEQ ID N0.4所示。1.2人胚胎腎細胞HEK-293的培養和轉染
HEK-293細胞培養液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青黴素(100 U/mL)和鏈黴素(100 μ g/mL)的DMEM，培養條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱。轉染之前一天，HEK-293細胞被接種於六孔培養皿中，每孔接種0.5 2X105 cells/mL濃度的細胞500μ L，在不含抗生素的培養液裡生長至轉染前90-95%的融合度。轉染試劑為Iipofectamin2000 (Invitrogen,美國)，使用步驟1.1構建好的表達載體轉染HEK-293細胞。每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清DMEM培養液稀釋到50UL,混勻。再用無血清細胞培養液稀釋10 μ L的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 μ L,在室溫下孵育5 min。接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin 2000混合(總體積為100 μ L),搖勻，室溫孵育20 min。把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養液的孔中，前後搖板混勻後，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱孵育24 h-48 h。含有特異性抗融合表達的His6-tagl4的苦味受體蛋白13即可在細胞膜表面表達，苦味受體蛋白13即為苦味受體蛋白T2R4。1.3逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)
採用RT-PCR的方法檢測苦味受體蛋白T2R4在mRNA水平的表達。HEK-293細胞轉染48 h後，按Trizol —步法提取細胞總RNA。首先，取出六孔板細胞至已滅好菌的超淨工作檯中，吸棄培養基，磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)洗一次。每孔加入0.5 mL Trizol試劑，用移液器吹打細胞，使細胞脫落，裂解。再將上述細胞的Trizol裂解液轉入1.5 mL EP管中，在室溫(15°C 30°C)下放置5 min。在上述EP管中，按照每I mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15 S，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3min後，12000 g(2°C 8°C )離心18 min ;樣品分為三層，底層為黃色的有機相，上層為水相和一個中間層。取上層水相置於新1.5 mL EP管中，按照每I mL Trizol加0.5 mL異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置10 min, 12000 g (2°C 8°C )離心10 min。棄上清，按照每I mL Trizol加I mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500 g (2°C 8°C)離心5 min，棄上清。讓沉澱的RNA在室溫下自然乾燥。用不含RNA酶的水溶解RNA沉澱，提取的RNA放在-70°C冰箱保存。取5 yL RNA溶液在260 nm及280 nm波長下檢測紫外吸光度，估計其純度，並計算核酸含量(RNA 260 nm吸光度為I相當於40 μ g/mL)。將RNA溶液稀釋為0.2 yg/yL，取11 μ L RNA溶液，I yL隨機六聚引物，混勻，短暫離心數秒，70°C溫育5 min ;於冰浴下冷卻，依次加入4 μ L逆轉錄緩衝液、I μ LRnasin (20 U)和 2 μ L dNTP,混勻,短暫離心,25°C溫育 5 min ;加入 I μ L PrimeScript RTase (200 U/ μ L)逆轉錄酶，混勻，短暫離心，總量為20 μ L的反應體系於30°C溫育10min ；42° C反應45 min，在95°C條件下放置5 min停止反應。立即置冰上。產物放在_20°C保存。然後在50 μ L反應體系中加入2 μ g的逆轉錄產物作為模板進行PCR擴增，上遊引物序列如 SEQ ID N0.2 所示:5』 -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3』 ；下遊引物序列如 SEQ ID N0.3 所示:5』 -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3』 ；冰浴下，取2.5 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μ L。0嫩模板、5.0 μ L PCR緩衝液、4.0 uL MgCl2U-O yL dNTP、上下遊引物各0.4 Ug及去離子水35.5 μ L混勻，短暫離心；總量為50 μ L的反應體系於94°C預變性30 S，再以29個循環的95°C變性30秒、58°C退火30秒、720C延伸60秒擴增，最後20 V降溫20秒。稱取I g瓊脂糖，加入96 mLTBE緩衝液加熱使溶解，加入4 μ L 1% DNA green，配成質量百分比為I %的瓊脂糖凝膠；取標準DNA marker和PCR產物於瓊脂糖凝膠上點樣；110 V電壓下電泳30 min ;電泳後通過紫外成像系統觀察電泳條帶。1.4細胞免疫螢光鑑定
通過使用帶有突光標記的特異性抗His6-tagl4的單克隆抗體檢測融合了 His6-tagl4的苦味受體蛋白13在HEK-293的表達及其細胞膜上的分布情況。為進行螢光顯微鏡的觀察，先將轉染孵育好的細胞接種在六孔板中，370C，體積百分比濃度為5%的CO2恆溫培養箱中培養12 h。再用0-4°C甲醇在_20°C靜置20 min，用PBS洗2遍，每次5 min。用體積百分比為10%的胎牛血清(FBS)封閉，37°C恆溫培養箱，封閉30 min，PBS洗2遍，每次5 min。取出蓋玻片，在保溼盒中孵育一抗(His6-tag兔抗一抗，CST公司)，4°C過夜(一抗按1:500的比例稀釋，用體積百分比10% FBS/PBS稀釋)。用體積百分比為10%的FBS/PBS洗3次，每次5 min。隨後進行二抗孵育:FITC標記的二抗(FITC-抗兔二抗，1:200用體積百分比為10%的FBS/PBS稀釋)在室溫或4°C側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時，避光，之後用體積百分比為的10%的FBS/PBS洗3遍，每次5min。最後是封片:將蓋玻片取出，放在乾淨的載玻片上，體積百分比為90%的甘油封片，用指甲油封片固定四周。封片後就可以使用雷射共聚焦顯微鏡觀察，激發波長為492 nm，最大發射波長為520 nm。1.5苦味受體蛋白T2R4的提取
轉染後的HEK-293細胞用PBS (pH 7.4)清洗，並從六孔板收集。收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然後16000 g離心40 min。浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分。浮在表面的部分用丙酮沉澱，沉澱物和尿素標本緩衝液混合。小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min。然後，將尿素樣品緩衝液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達於細胞膜上的苦味受體蛋白13。含有苦味受體蛋白13的細胞膜組分用於構建石英晶體微天平傳感器8，細胞膜的疏水環境有利於保持苦味受體蛋白13的結構和功能。本步驟I中，子步驟1.3和1.4用於驗證苦味受體13已在細胞膜表面成功表達，並非本步驟I的必要子步驟。2、苦味受體蛋白T2R4在石英晶體微天平傳感器表面的固定
本發明的受體傳感器製備過程如下；在乾淨的石英晶體微天平傳感器的金電極表面17通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的His6-tagl4的巰基化單鏈DNA適配體16，該適配體16的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價連接組成:(5，-HS-(CH2)6-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3』)，反應條件為室溫下反應I小時；用體積百分比為1%的牛血清白蛋白15封閉石英晶體微天平傳感器的金電極17表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白13的細胞膜均勻塗覆在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面，並放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白13通過融合表達的His6-tagl4與適配體16發生特異性的結合,實現在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面特異性固定和純化苦味受體蛋白13的目的。石英晶體微天平傳感器的金電極17表面用磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.0)衝洗，除去未結合的多餘物質。完成用於苦味物質地那檢測的受體傳感器的構建。3、苦味物質地那的檢測
3.1石英晶體微天平傳感器原理
石英晶體微天平傳感器是一種質量敏感型傳感器，其基本原理是石英晶體的諧振頻率與其表面的表面微小的壓力變化相關，通過記錄石英晶體諧振頻率的變化監測石英晶體表面微小的壓力變化。基於這一原理，石英晶體表面微小的質量變化也可以通過監測石英晶體諧振頻率的變化來檢測。因此，可以利用這個原理構建生物傳感器，用來測定敏感元件與待測物質的特異性吸附作用。當苦味物質被固定於石英晶體表面的苦味受體蛋白特異性吸附時，石英晶體表面的質 量發生變化，這一變化將引起石英晶體諧振頻率的改變，而且頻率的改變與石英晶體表面質量的改變成正比，滿足公式:^ F=KA &其中J A為石英晶體諧振頻率的變化量(Hz)，^為石英晶體表面的質量變化(g)，f為相關係數，F為石英晶體的初始頻率(MHz)，A為電極總的表面積(cm2)，r為晶體的密度(g/cm3)， 為晶體的厚度(cm)。因此，通過監測石英晶體諧振頻率的變化可以計算出其表面的質量變化，獲得苦味物質與表面受體蛋白相互作用信息，最終實現對苦味物質的檢測。3.2檢測過程
石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的信號通過傳感器電極接口 10傳送到QCM200系統，用於記錄石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的改變。由注射泵I通過第一矽膠導管2將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達到一個穩定的狀態後，再由注射泵I將濃度確定的含有苦味物質地那的待測溶液通過第一矽膠導管2泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率再次穩定後，諧振頻率的改變量即為對應濃度的傳感器響應值。最後再由注射泵I通過第一矽膠導管2泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程。至少間隔IOmin後，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩定後可泵入待測溶液到檢測腔進行下一次檢測。重複上述步驟，可以確定一系列濃度的苦味物質地那對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線。對於未知濃度的苦味物質地那，首先由注射泵I通過第一矽膠導管2將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達到一個穩定的狀態Ftl後，再由注射泵I將待測未知濃度的苦味物質地那通過第一矽膠導管2泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩定到F1後，得到諧振頻率改變量F1- F0,根據上述步驟得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線推算出待測苦味物質地那的濃度，實現液相中苦味物質的檢測。
下面結合附圖和實施例進一步說明本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。如圖1所示，本發明用於特異性苦味物質檢測傳感器的檢測腔體結構圖，包括:圖中，注射泵1、第一矽膠導管2、第二矽膠導管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11。其中，由腔蓋
5、上環狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8和傳感器底座11的側壁組成一個密閉的檢測腔，通過固定柱6實現腔蓋5與傳感器底座11的連接和固定。注射泵I通過第一矽膠導管2向檢測腔泵入溶液，檢測廢液由第二矽膠導管3輸出到廢液缸4。石英晶體微天平傳感器8通過上環狀墊圈7和下環狀墊圈9固定於檢測腔底部。石英晶體微天平傳感器8通過傳感器電極接口 10與外圍檢測系統連接。苦味受體表達載體的構建如圖3所示，使其更加適合應用於構建生物傳感器，包括在苦味受體基因22的5』端引入rho-tag信號肽基因21，以利於表達的受體蛋白定位於細胞膜上；在苦味受體基因22的3 』端引入Hi s6-tag標籤基因23，用於表達Hi s6-tag標籤，通過與適配體16特異性結合,實現苦味受體蛋白13的固定和純化。其中，5』端的治7/7 J酶切位點19和3』端的Afoi /酶切位點用於將苦味受體基因亞克隆到表達載體的多克隆位點區域。圖4是本發明製備苦味受體蛋白13的RT-PCR檢測結果圖，提示苦味受體蛋白13在mRNA水平上有顯著表達。圖5是本發明中表達有備苦味受體蛋白13的HEK-293細胞在可見光視野的照片；圖6是與圖5同一視野下的螢光照片；結果提示在蛋白質水平，苦味受體蛋白13有顯著表達，而且表達的苦味受體蛋白13主要分布在細胞脂膜。如圖2所示，本發明固定有苦味受體的石英晶體微天平傳感器結構示意圖，包括:脂質雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體18。上述石英晶體微天平傳感器8主要應用於液相環境中苦味物質的檢測。實驗中，採用不同的苦味物質測試傳感器的特異性，包括硫酸鎂(30 mM)、地那(I mM)、水楊素(D-(-)-salicin, I mM)和奎寧(I mM)。採用不同濃度的T2R4天然配體地那測試傳感器的靈敏度。圖7是傳感器檢測不同苦味物質的結果。採用不含苦味受體蛋白T2R4的HEK-293細胞膜作為陰性對照。其中，傳感器對不同苦味物質的響應以含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應進行了歸一化處理。結果表明，含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應顯著高於對奎寧的響應，也顯著高於不含苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應(*# < 0.0Ln = 6)。說明該傳感器檢測苦味物質地那具有良好的特異性。圖8是傳感器檢測不同濃度的地那的結果。傳感器對不同濃度地那的響應以傳感器對0.1 mM地那的響應進行了歸一化處理。在地那濃度為0.01 mM到0.3 mM的範圍內，該傳感器對地那具有濃度依賴的線性響應特徵。浙江大學〈120〉一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法
〈160〉5
PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉11193
〈212〉DNA
Homo sapiens
〈400〉 I
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac240
atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc600
gtcagatctc tagaagctgg gtaccgagag ccgcagccat gaacggcaca gagggcccca660
atttttatgt gcccttctcc aacgtcacag gcgtggtgcg gagccccttc gagcagccgc720agtactacct ggcggaacca tggcagttct ccatgcttcg gttattctat ttctctgcta780
ttattgcctc agttatttta aattttgtag gaatcattat gaatctgttt attacagtgg840
tcaattgcaa aacttgggtc aaaagccata gaatctcctc ttctgatagg attctgttca900
gcctgggcat caccaggttt cttatgctgg gactatttct ggtgaacacc atctacttcg960
tctcttcaaa tacggaaagg tcagtctacc tgtctgcttt ttttgtgttg tgtttcatgt1020
ttttggactc gagcagtgtc tggtttgtga ccttgctcaa tatcttgtac tgtgtgaaga1080
ttactaactt ccaacactca gtgtttctcc tgctgaagcg gaatatctcc ccaaagatcc1140
ccaggctgct gctggcctgt gtgctgattt ctgctttcac cacttgcctg tacatcacgc1200
ttagccaggc atcacctttt cctgaacttg tgactacgag aaataacaca tcatttaata1260
tcagtgaggg catcttgtct ttagtggttt ctttggtctt gagctcatct ctccagttca1320
tcattaatgt gacttctgct tccttgctaa tacactcctt gaggagacat atacagaaga1380
tgcagaaaaa tgccactggt ttctggaatc cccagacgga agctcatgta ggtgctatga1440
agctgatggt ctatttcctc atcctctaca ttccatattc agttgctacc ctggtccagt1500
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ccctttactc tccaggacat tctgttctca ttattatcac acatcctaaa ctgaaaacaa1620
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gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatcc1920ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag1980
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca ggcgtcagcg2040
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg aggtcgactc tagaggatcg atgccccgcc2100
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catttgccaa cactgagtgg ctttcatcct ggagcagact ttgcagtctg tggactgcaa2340
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tgtacctccc aggggcccag gaagactacg ggaggctaca ccaacgtcaa tcagaggggc2460
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cgtttagcta atagaataac tgctgagttg tgaacagtaa ggtgtatgtg aggtgctcga2880
aaacaaggtt tcaggtgacg cccccagaat aaaatttgga cggggggttc agtggtggca2940
ttgtgctatg acaccaatat aaccctcaca aaccccttgg gcaataaata ctagtgtagg3000
aatgaaacat tctgaatatc tttaacaata gaaatccatg gggtggggac aagccgtaaa3060gactggatgt ccatctcaca cgaatttatg gctatgggca acacataatc ctagtgcaat3120
atgatactgg ggttattaag atgtgtccca ggcagggacc aagacaggtg aaccatgttg3180
ttacactcta tttgtaacaa ggggaaagag agtggacgcc gacagcagcg gactccactg3240
gttgtctcta acacccccga aaattaaacg gggctccacg ccaatggggc ccataaacaa3300
agacaagtgg ccactctttt ttttgaaatt gtggagtggg ggcacgcgtc agcccccaca3360
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cgctaaccac tgcggtcaaa ccacttgccc acaaaaccac taatggcacc ccggggaata3480
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attacacaca cttgcgcctg agcgccaagc acagggttgt tggtcctcat attcacgagg3600
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atagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg3720
gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg3780
gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg3840
gtagtatatg ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctaat agagattagg3900
gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatata ctacccaaat atctggatag3960
catatgctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag4020
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tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag4140
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catatgctat cctcatgcat atacagtcag catatgatac ccagtagtag agtgggagtg4260ctatcctttg catatgccgc cacctcccaa gggggcgtga attttcgctg cttgtccttt4320
tcctgctggt tgctcccatt cttaggtgaa tttaaggagg ccaggctaaa gccgtcgcat4380
gtctgattgc tcaccaggta aatgtcgcta atgttttcca acgcgagaag gtgttgagcg4440
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tccgtcatca ccctccgcgg cagccccttc caccataggt ggaaaccagg gaggcaaatc4740
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ggccattcca aaggggagac gactcaatgg tgtaagacga cattgtggaa tagcaagggc4980
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ccaccctcct tttttgcgcc tgcctccatc accctgaccc cggggtccag tgcttgggcc5220
ttctcctggg tcatctgcgg ggccctgctc tatcgctccc gggggcacgt caggctcacc5280
atctgggcca ccttcttggt ggtattcaaa ataatcggct tcccctacag ggtggaaaaa5340
tggccttcta cctggagggg gcctgcgcgg tggagacccg gatgatgatg actgactact5400
權利要求
1.一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟: (1)製備苦味受體蛋白T2R4； (2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面製成受體傳感器； (3)將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩定的狀態後，再將含有某一確定濃度的苦味物質地那的溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩定後，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應值，最後再泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin後，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩定後，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質地那的溶液進行下一次檢測；重複上述步驟，可以得到一系列苦味物質地那的濃度對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線； (4)對於未知濃度的苦味物質地那，首先將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩定的狀態Ftl後，再將含有未知濃度的苦味物質地那的待測溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩定到F1後，得到諧振頻率改變量F1- F0,最後根據上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度，實現液相中苦味物質地那的濃度檢測。
2.根據權利要求1所述苦味物質地那的檢測方法，其特徵在於，所述步驟I包括以下子步驟: (1.0構建表達載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號肽序列全長cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構建苦味受體基因22的表達載體過程如下:首先，設計相應的引 物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，並對苦味受體基因進行適當的修飾，上遊引物序列如SEQ ID N0.2所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈式反應使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，溫度循環首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最後是.20 0C降溫20秒；擴增後的產物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達載體的構建，並通過測序對基因序列進行鑑定得表達載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (1.2)人胚胎腎細胞HEK-293的培養和轉染:HEK_293細胞培養液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青黴素(100 U/mL)和鏈黴素(100 μ g/mL)的DMEM，培養條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱；轉染之前一天，HEK-293細胞被接種於六孔培養皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細胞500 μ L，在不含抗生素的培養液裡生長至轉染前90-95%的融合度；轉染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構建好的表達載體pCEP4/rho-T2R4~his6轉染HEK-293細胞；每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清培養液稀釋到50 μ L，混勻；再用無血清細胞培養液稀釋10 UL的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin/2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養液的孔中，前後搖板混勻後，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細胞膜表面表達；(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉染後的HEK-293細胞用PBS清洗，並從六孔板收集；收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然後16000 g離心40 min ;浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉澱，沉澱物和尿素標本緩衝液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然後，將尿素樣品緩衝液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達於細胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細胞膜組分用於構建石英晶體微天平傳感器，細胞膜的疏水環境有利於保持苦味受體的結構和功能。
3.根據權利要求1所述苦味物質地那的檢測方法，其特徵在於，所述步驟2具體為:本發明的受體傳感器製備過程如下:在乾淨的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的His6-tag標籤的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價連接組成；反應條件為室溫下反應I小時；用質量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白T2R4的細胞膜均勻塗覆在石英晶體微天 平傳感器的金電極表面，並放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白通過融合表達的His6-tag與適配體發生特異性的結合，實現在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS衝洗，除去未結合的多餘物質；完成用於苦味物質地那檢測的受體傳感器的構建。
全文摘要
本發明公開了一種基於受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，首先在HEK-293細胞表面表達了帶有His6-tag標籤的苦味受體蛋白T2R4，並提取苦味受體蛋白T2R4將其利用適配體有效地固定在石英晶體微天平表面構建成受體傳感器；通過測試一系列含已知確定濃度苦味物質地那的溶液，得到地那濃度-諧振頻率改變量標準曲線；然後測試含有未知濃度苦味物質地那的待測溶液，根據石英晶體微天平諧振頻率的改變量和地那濃度-諧振頻率改變量標準曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度。本發明方法所需儀器簡單、操作方便，解決了敏感元件苦味受體蛋白T2R4與石英晶體微天平的穩定耦合，實現了液相環境中苦味物質地那的快速檢測。
文檔編號G01N5/02GK103149110SQ20131006024
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月26日 優先權日2013年2月26日
發明者吳春生, 鄒玲, 杜立萍, 王平 申請人:浙江大學