一種基於可控釋放技術的穀胱甘肽螢光傳感器及其製備方法與流程
2023-09-19 11:12:30 2
本發明涉及一種基於可控釋放技術的穀胱甘肽(GSH)螢光傳感器及其製備方法，具體涉及一種可在生物體內細胞及組織當中用於檢測穀胱甘肽的螢光傳感器及其製備方法。
背景技術：
穀胱甘肽(GSH)是一種由穀氨酸、半胱氨酸、甘氨酸構成的三肽化合物，來自於半胱氨酸殘基中的巰基使它成為具有重要意義的生物活性物質。GSH廣泛存在於動、植物細胞，是細胞內含量最豐富的非蛋白巰基物。GSH在人體各種組織及細胞中的含量以及與各種疾病的關係備受關注，至今一直是廣泛研究的熱點。GSH參與生物體內多種生化反應，具有非常重要的生理作用，如胺基酸的轉運，蛋白、核酸的合成，抗氧化作用等等。作為機體中廣泛存在的重要抗氧化劑，GSH在防衛機體免受自由基傷害、抗腫瘤及抗衰老等方面發揮了重要作用。特別是GSH所具有的抗突變作用，有利於抑制誘發癌症基因的突變，對肝癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌等多種癌細胞病變有一定的抑制作用，據稱，GSH是人體內最有效的抗癌物。
生物體內細胞及組織當中GSH及相關巰基物濃度的改變與多種重大疾病相關聯。因此，GSH的含量是衡量機體內抗氧化能力大小的重要指標。報導稱，如果GSH在體內的含量低於正常水平，將導致像糖尿病、酒精肝中毒、白內障、癌症、帕金森症候群、心血管疾病、阿耳茨海默氏病(Alzheimer，早老性痴呆)等一系列病症在人體的發生。因此，常規診斷利用GSH及相關巰基物的濃度檢測作為某些疾病診斷的重要依據。由此可見，建立高效、靈敏、經濟的GSH及相關巰基化合物的檢測方法不僅有助於重大疾病的臨床診斷與治療，同時，對於生物、醫學、生命科學、食品、醫藥等諸多領域的研究與應用均具有重要意義。
目前，發展了多種測定GSH的檢測技術，包括化學的、儀器的，諸如紫外/可見分光光度法、螢光法、酶循環法、電化學法、化學發光法、電致化學發光法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等多種方法，每種方法在靈敏度、選擇性、穩定性、檢測時間、成本、儀器等方面都各有其優缺點，目前還沒有一種既快速、穩定、特異，又十分靈敏、經濟的測定方法。影響了它們在高通量的常規臨床檢測及生物研究中的應用。根據GSH檢測技術的發展趨勢來看，迫切需要提高檢測靈敏度以實現微量樣品的高靈敏、高特異性的檢測要求。
近年來，現代分子生物學技術及納米技術的快速發展為GSH的高靈敏、特異性生物傳感檢測技術提供了新的思路和技術。作為金納米粒子家族中的新材料，金納米籠一經問世便得到了廣泛的關注和研究。研究表明，作為還願型物質的GSH能夠與含有雙硫鍵(—S—S—)的物質發生特異性反應，可將其中的雙硫鍵切斷並分別將其還原為巰基(—SH)，同時，自身被氧化，生成氧化型產物GSSG。本發明根據GSH的這一反應特性，將其巧妙地應用到基於納米材料的生物傳感的設計與應用領域，為GSH的高靈敏檢測提供了新型、特異、高效的檢測平臺。採用金納米籠作為納米載體，利用含有雙硫鍵的生物分子構建基於可控釋放的螢光傳感器檢測GSH的技術還未見文獻報導。
技術實現要素：
為了克服現有技術存在的不足，針對基於可控釋放的螢光傳感器檢測GSH的技術未見報導，因此，本發明的第一目的：提出並構建一種新型的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器，具體是利用中空多孔的金納米籠作為納米載體，將含有雙硫鍵的生物分子組裝到金納米籠表面，一方面起到分子生物門的作用封堵金納米籠孔內物質的外洩，另一方面作為分子識別探針與待測靶分子發生特異性的分子識別反應。如有待測靶分子GSH的存在，組裝在金納米籠表面的含有雙硫鍵的生物分子將會與之發生特異性的分子識別反應，導致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的生物分子從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，並將金納米籠內的客體分子如螢光分子釋放出來，實現螢光信號的增強與檢測。因此，可由體系螢光強度的增加來指示GSH的存在及其濃度大小。利用該螢光傳感器，能夠實現對GSH的高靈敏、高選擇性檢測，為重大疾病的臨床診斷與治療、食品、醫藥等諸多領域的研究與應用提供新技術和新方法；本發明的第二目的：提供一種檢測GSH的螢光傳感器的製備方法。將本發明提出的螢光傳感器用於GSH的螢光檢測，能夠顯著地提高檢測靈敏度和特異性。
本發明是通過以下技術方案實現發明目的的。本發明提出的檢測GSH的螢光傳感器是以金納米籠作為納米載體，利用其空心多孔的結構特性，在其內部裝載客體分子如螢光染料，為了防止螢光染料的外洩，利用含雙硫鍵的生物分子在金納米籠表面組裝具有可生物響應的分子門，實現對金納米籠孔的封堵，防止孔內物質的釋放；其中，所述的含雙硫鍵的生物分子是經過特別設計的、具有一定鹼基長度的含有雙硫鍵的核苷酸分子，其鹼基序列為5』-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3』，該生物分子作為靶分子的識別探針被組裝到金納米籠表面，同時，該識別探針也被用作封堵籠孔的分子門防止孔內物質的釋放。具有分子識別作用的探針分子門是通過在金納米籠表面修飾正電荷的方法而將其組裝到金納米籠表面，優選地採用聚二烯丙基二甲基氯化銨作為正電荷修飾劑在金納米籠表面修飾一層聚陽離子。
優選地，上述的GSH螢光傳感器，所述的螢光染料是羅丹明B。
一種製備本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器的製備方法，包括如下步驟：
(1)將磁珠與金納米籠溶液混合，37℃恆溫振蕩12h，磁分離，清洗，加入聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液，37℃恆溫振蕩12h，磁分離，清洗；
(2)加入羅丹明B溶液，37℃恆溫振蕩12h後加入GSH識別探針溶液，繼續37℃振蕩12h後磁分離，清洗，即製得GSH螢光傳感器；
其中，所述的GSH識別探針是經過特別設計的、具有一定鹼基長度的含有雙硫鍵的核苷酸分子，其鹼基序列為5』-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3』。
本發明的有益效果：本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器是將金納米籠與含有雙硫鍵的GSH識別探針相結合，通過靜電組裝作用在金納米籠表面形成具有可生物響應的分子門，利用識別探針與靶分子GSH之間發生的特異性的分子識別反應，導致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的生物分子從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，並將金納米籠內的客體分子如螢光分子釋放出來，實現了螢光信號的增強與檢測，該方法使GSH的檢測靈敏度得到顯著提高，可實現對靶分子GSH高靈敏、高選擇性的檢測。本發明提出的GSH螢光傳感器具有結構簡單、穩定性好、可控性強、螢光信號靈敏等優點，同時，不受其它常見幹擾物質如Mg2+，Na+，Fe3+，Ca2+，Zn2+等金屬離子的影響，具有高的選擇性，實驗結果表明，相比於其它非蛋白巰基物如硫氫化鈉(NaSH)、巰基己醇(MCH)、巰基乙酸(TA)、半胱胺酸(CYS)、二硫蘇糖醇(DTT)等物質，本發明提出的GSH螢光傳感器顯示出優異的選擇性和特異性，採用本發明提出的GSH螢光傳感器可在1.0×10-12～6.0×10-10M範圍內實現對GSH的高靈敏、高選擇性檢測，與文獻值相比，本發明對穀胱甘肽的檢測靈敏度提高近100倍。可以預見，該螢光傳感器及其製備方法和檢測技術具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景，將在重大疾病的早期診斷與治療、食品、醫藥等諸多領域發揮重要的作用。
附圖說明
圖1穀胱甘肽的濃度與螢光強度曲線圖。
具體實施方式
以下是本發明涉及的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步描述，但是本發明的保護範圍並不限於這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護範圍之內。
下面通過實施例具體地說明本發明，但本發明不受下述實施例的限定。
實驗儀器：THZ-82A氣浴恆溫振蕩器(金壇市醫療器械廠)；F-4600螢光分光光度計(日立，日本)；磁性分離架(天津倍思樂色譜技術開發中心)。
實驗試劑：3-4μm巰基修飾磁珠(天津市倍思樂色譜技術開發中心)；羅丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；含有雙硫鍵的GSH識別探針的鹼基序列為：5』-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3』(上海生工生物工程股份有限公司)，PBS緩衝溶液為0.01M(pH 7.4,Na2HPO4-NaH2PO4)。
實施例1：
一種製備本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器的方法，包括如下步驟：
(1)20μL清洗後的巰基磁珠與400μL金納米籠溶液均勻混合，37℃恆溫振蕩12h，磁分離，清洗，在製得的金納米籠複合物中加入200μL聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液(11.664mg/mL)，37℃恆溫振蕩12h，磁分離，清洗；
(2)加入100μL羅丹明B溶液(1.0×10-5mol/L)，37℃恆溫振蕩12h後加入10μL GSH識別探針溶液(1.0×10-5M)，37℃振蕩12h，磁分離，清洗，即製得GSH螢光傳感器；
其中，所述的GSH識別探針是含有雙硫鍵的核苷酸分子，其鹼基序列為5』-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3』；所述的巰基磁珠是購買的商品(天津市倍思樂色譜技術開發中心)；所述的金納米籠按文獻方法獲得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang and Y.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762–4765)。
實施例2:
一種採用本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器檢測GSH的方法如下：
(1)將10μL待測GSH樣品溶液加入到本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器中，用PBS緩衝溶液(PH＝7.4)稀釋至100μL，37℃恆溫振蕩2h，識別探針與靶分子GSH之間發生特異性的分子識別反應，導致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的識別探針從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，並將金納米籠內的螢光分子羅丹明B釋放出來；
(2)磁分離，收集上清液及洗液進行螢光檢測，檢測條件：激發波長和發射波長分別為530、573nm。
圖1為GSH的濃度與螢光強度曲線圖，GSH的濃度分別為(a→l：0；1.0×10-12；5.0×10-12；1.0×10-11；4.0×10-11；8.0×10-11；1.0×10-10；2.0×10-10；4.0×10-10；6.0×10-10；2.0×10-9；1.0×10-8M)；結果表明，GSH濃度在1.0×10-12～6.0×10-10M時，螢光信號強度與GSH濃度呈現良好的線性關係，其線性方程為：FL＝220.464+0.805CGSH(10-12M)，線性相關係數為0.9939。
本發明將分子識別技術、可控釋放技術與納米技術相結合，通過特異性的分子識別反應，可實現對非蛋白巰基物GSH的高靈敏、高選擇性檢測。具體是將中空多孔的金納米籠與含有雙硫鍵的GSH識別探針相結合，使該螢光傳感器具有可生物響應的分子門，一旦有待測靶分子GSH的存在，則發生識別探針與GSH之間的特異性的分子識別反應，導致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的識別探針從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，金納米籠內的螢光分子羅丹明B得以釋放，實現螢光信號的增強與檢測，因此，利用該螢光傳感器，能夠實現對GSH的高靈敏、高選擇性檢測。
本發明提出的基於可控釋放技術的GSH螢光傳感器具有結構簡單，穩定性好，可控性強，螢光信號靈敏等優點，同時，不受其它常見幹擾物質如Mg2+，Na+，Fe3+，Ca2+，Zn2+等金屬離子的影響，具有高的選擇性，可用於微量樣品中低含量乃至極低含量GSH的高靈敏、高選擇性檢測，不但能夠為醫療衛生、食品、生命科學等領域的應用與研究提供全新高效的途徑和方法，尤為重要的是，基於本發明的可控釋放技術也將為腫瘤靶向、藥物輸送、重大疾病的早期診斷與治療帶來全新的方法和技術。