用於綴合生物分子的新試劑和方法

2023-09-19 22:57:30 3

專利名稱：用於綴合生物分子的新試劑和方法
用於綴合生物分子的新試劑和方法本發明涉及用於綴合生物分子特別是蛋白和肽的新試劑和新方法。許多治療活性分子例如蛋白不具有實現臨床醫用效力所需的性質。例如，許多天 然蛋白不能形成好的藥物，原因是在對患者給藥時存在若干固有缺點，包括(1)蛋白被許 多存在於血液或組織中的內源和外源肽酶消化；( 許多蛋白具有某種程度的免疫原性； 以及C3)蛋白可通過腎臟超濾和內吞作用迅速排洩。可能在藥物中作為活性治療劑使用的 某些分子具有全身毒性或者缺少最佳生物利用率和藥代動力學。當蛋白從血液中迅速清除 時，通常不得不頻繁地將其給予患者。頻繁給藥還增加毒性危險，特別是免疫引起的毒性。水溶性合成聚合物特別是聚亞烷基二醇廣泛地用於綴合治療活性分子例如蛋白、 肽和低分子量藥物。這些治療綴合物已被證明可有利地通過延長循環時間和降低清除率來 改變藥代動力學，降低全身毒性，並且在多種情況下呈現臨床效力的提高。將聚乙二醇PEG 共價綴合於蛋白的方法通常稱為「聚乙二醇化」。對於使效力最優化並確保劑量與劑量一致重要的是對於每種分子，每個蛋白綴 合的聚合物分子的數量相同；並且每個聚合物分子特異地共價綴合於每個蛋白分子的相同 胺基酸殘基。在沿蛋白分子的位點上的非特異性綴合可導致綴合產物以及通常非綴合蛋白 的分布，從而產生純化困難且昂貴的複雜混合物。對於硫醇特異性綴合，通常使用具有一端以馬來醯亞胺基團終止的PEG鏈的聚乙 二醇化試劑。許多出版物例如WO 2004/060965描述了這樣的試劑。馬來醯亞胺終止的試 劑可市購獲得。然而，許多PEG-馬來醯亞胺在貯存和與藥物候選物綴合的過程中是水解不 穩定的。具體地，在綴合之前和之後均會發生馬來醯亞胺環的很大程度的水解。我們現在已經發現一種類型的聚乙二醇化試劑，所述試劑可用於將包括蛋白和肽 的分子經單個親核殘基例如硫醇基團綴合於聚合物，並且所述試劑優於這類市售試劑。因此，本發明提供一種使含有硫醇或氨基基團的分子綴合於聚合物的方法，該方 法包括使所述分子與如下通式的化合物反應X- [Q-ff- (CH = CH) n_ (CH2) 2_L] m (I)其中X代表一個聚合物；Q代表一個連接基團；W代表一個吸電子基團；η代表0或 1-4中的一個整數；L代表一個離去基團；m代表1-8中的一個整數。由本發明方法獲得的直接產物通常可由如下通式表示
X- [Q-ff- (CH = CH) n_ (CH2) 2_Z] m (IIa)其中X、Q、W、η和m具有上面給出的意義，Z代表通過一個硫醇或氨基基團綴合的 所述分子。如果需要，可使所獲得的式IIa的化合物轉變為任何其他所需的產物。具體地， 可使獲得的通式IIa的化合物轉變為通式II的化合物X-[Q-W' -(CH = CH) n-(CH2)2-ZJm (II)其中W'代表一個吸電子部分或一個可通過還原吸電子部分製備的部分。通式(I)的化合物是新化合物，本發明因此還提供了這些化合物本身。特別優選 的式(I)的新化合物是如下定義的式(Ia)的化合物。通式(II)的化合物式也是新化合物，本發明因此還提供了這些化合物本身。特別優選的式(II)的新化合物是如下定義的式(nb)的化合物。m代表1-8例如1-6、優選1-4中的一個整數，例如1。當m為1時，單個分子與所 述聚合物綴合。當m大於1時，可實現多於一個分子與聚合物的綴合。2-8個-Q-W' -(CH =CH)n-(CH2)2-Z或-Q-W-(CH = CH)n-(CH2)2-L基團連接於所述聚合物，並且每個所述基團 的變量Q、W、W'、n、L和Z可相同或不同。可獲得多官能聚合物化合物，例如可使用可從 NOF獲得的商標名為「Simbright」的多臂(multi-arm)化合物作為起始材料將多個基團連 接在一起，所述多臂化合物例如式C[CH2O(CH2CH2O)n-Y]4的4臂產物，其中Y可為多種不同 末端基團中的一種。多聚體綴合物可導致協同和加合益處。例如，如果m為1，那麼獲得的 綴合物在遠離所述綴合分子的PEG鏈末端上必然具有一個末端基團。這通常為烷氧基或類 似基團，並且已表明這種基團在用於藥物應用時可造成不想要的免疫原性效應。如果m大 於1，綴合的分子可連接於所述PEG鏈的兩端，從而不需末端基團例如烷氧基。聚合物X可為例如聚亞烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯例如聚丙烯醯嗎 啉、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺或聚甲基丙烯醯胺例如聚羧甲基丙 烯醯胺，或者HPMA共聚物。另外，X可為一種易於酶降解或水解降解的聚合物。這種聚合 物包括例如聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亞胺酯)和聚醯胺例如聚(氨 基酸)。聚合物X可為均聚物、隨機共聚物或結構確定的共聚物例如嵌段共聚物。例如，X 可為由兩種或更多種烯化氧、或者來源於聚(烯化氧)與聚酯、聚縮醛、聚(原酸酯)或聚 (胺基酸)的任一種的嵌段共聚物。可用的多官能聚合物包括二乙烯基醚馬來酸酐和苯乙 烯-馬來酸酐的共聚物。也可使用天然聚合物，例如多糖類例如幾丁質、葡聚糖、糊精、殼聚糖、澱粉、纖維 素、糖原、聚(唾液酸)及其衍生物。也可使用蛋白作為所述聚合物。這使得一種蛋白例如 抗體或抗體片段可與另一種蛋白例如酶或其他活性蛋白綴合。同時，如果使用含有催化序 列例如糖基轉移酶的0-多糖受體位點的肽，那麼其允許納入後續酶反應的底物或靶標。也 可使用聚(胺基酸)例如聚穀氨酸或聚甘氨酸，也可使用來源於天然單體例如糖類或氨基 酸和合成單體例如環氧乙烷或甲基丙烯酸的雜合聚合物。如果所述聚合物為聚亞烷基二醇，那麼優選含有C2和/或C3單元的聚亞烷基二 醇，特別是聚乙二醇。聚合物特別是聚乙二醇可含有單條直鏈，或其可具有由許多短或長鏈 構成的分支形態。所謂的Pluronics (聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物)是一種重要的PEG 嵌段共聚物類型。它們衍生自環氧乙烷和環氧丙烷嵌段。可使用被取代的聚亞烷基二醇， 例如甲氧基聚乙二醇。在本發明的一個優選實施方案中，單鏈聚乙二醇由合適的基團例如 烷氧基如甲氧基、芳氧基、羧基或羥基開始，並在鏈的另一末端連接於連接基團Q。所述聚合物X可任選地以任何所需的方式衍生或官能化。反應基團可連接於所述 聚合物末端或末端基團，或通過突出的接頭沿所述聚合物鏈連接；在這種情況下，所述聚合 物為例如聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或馬來酸酐共聚物。 這種官能化的聚合物提供了製備多體綴合物(即其中所述聚合物綴合於多於一個分子的 綴合物)的另一可能性。根據需要，可使用常規方法使所述聚合物連接於固體支持物。所述聚合物的最佳分子量當然應取決於預計的應用。優選地，其數均分子量為 250g/摩爾到約75，OOOg/摩爾。當打算將通式II的化合物用於醫用並且使其離開循環系 統並穿透組織時，例如用於治療惡性腫瘤、感染或自免疫疾病或者創傷引起的炎症，使用範圍在2000-30，OOOg/摩爾的較低分子量的聚合物可能是有利的。對於打算使通式II的化 合物保留在循環系統中的應用，使用例如範圍在20，000-75，OOOg/摩爾的更高分子量的聚 合物可能是有利的。應選擇要使用的聚合物以使所述綴合物可溶於適合其預計應用的溶劑介質中。對 於生物學應用，特別是對哺乳動物臨床治療給藥的診斷應用和治療應用，所述綴合物應可 溶於水性介質中。然而，許多生物分子，例如蛋白如酶，具有工業用途例如催化化學反應。 對於打算用於這些用途的綴合物，所述綴合物需要可溶於水性或有機介質的一種或兩種之 中。所述聚合物當然不應過分損害要綴合的分子的預計功能。優選地，所述聚合物是合成聚合物，並且優選是水溶性聚合物。使用水溶性聚乙二 醇對於許多應用是特別優選的。連接基團Q可為例如直接鍵合、一個亞烷基基團(優選C1,亞烷基基團)或者一 個任選被取代的芳基或雜芳基基團，所述基團的任一種都可被一個或多個如下原子或基團 終止或中斷氧原子、硫原子、-NR基團(其中R代表一個氫原子或一個烷基(優選C^6烷 基)、芳基(優選苯基)或烷基-芳基(優選Cp6烷基-苯基)基團)、酮基團、-0-C0-基 團、-C0-0-基團、-O-CO-O、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-和 / 或-NR. CO-基團。所述芳基 和雜芳基基團Q構成本發明的一個優選實施方案。合適的芳基基團包括苯基和萘基基團， 而合適的雜芳基基團包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、噠嗪、嘌呤和嘧啶。特別 合適的連接基團Q為雜芳基或者特別是芳基基團，特別是苯基基團，所述連接基團Q在鄰近 聚合物X處被NR. CO-基團終止。與所述聚合物的連接可通過一個易水解的鍵或通過一個 不易水解的鍵。可存在於任選地被取代的芳基或雜芳基基團上的取代基包括例如一個或多個 相同或不同的選自如下基團的取代基烷基(優選任選被OH或CO2H取代的Cy烷基， 特別是甲基)、-CN、-NO2、-CO2R, -COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R, _SR、-SOR、-SO2 R、-NHC0R、-NRC0R、NHCO2R, -NR. CO2R, -NO、-NH0H、-NR. OH、-C = N-NHCOR、-C = N-NR. COR、-N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R,滷素如氟或氯、-C = CR、-C = CR2 和-C = CHR，其中每個 R均獨立地代表一個氫原子或一個烷基(優選CV6烷基)、芳基(優選苯基)或烷基-芳基 (優選Cp6烷基-芳基)基團。吸電子取代基的存在是特別優選的。優選的取代基包括例 如 CN、NO2, -OR、-0C0R、_SR、-NHC0R、-NR. COR、-NHOH 和-NR. COR。W可例如表示一個酮基團C0、一個酯基團-0-C0-或一個碸基團-S02-，並且W'可 代表這類基團或者通過還原這類基團得到的基團，例如CH. OH基團、醚基團CH. 0R、酯基團 CH. 0. C (0) R、胺基團 CH. NH2、CH. NHR 或 CH. NR2,或者醯胺 CH. NHC (0) R 或 CH. N (C (0) R) 2。優選地，η是0。離去基團L 可例如代表-SR、-SO2R, -OSO2R, -N+R3-N+HR2, -N+H2R,滷素或一Ο0,其 中R具有上文給出的意義，並且0代表一個含有至少一個吸電子取代基的被取代芳基特別 是苯基基團，所述吸電子取代基例如-CN、_而2、-C02R、-C0H、-CH20H、-COR、-OR、-0C0R、-OCO2R 、-SR、-S0R、-S02R、-NHC0R、-NRC0R、-NHC&R、-NR，CO2 R、-NO、-NHOH、-NR，OH、-C = N-NHCOR,-C =N-NR，COR、-N+R3, -N+HR2, -N+H2R,滷素特別是氯或氟、-C = CR、-C = CR2 和-C = CHR,其 中每個R均獨立地具有上文給出的意義之一。如果m代表2-8中的一個整數，那麼不同的L基團可視需要存在。通過選擇不同活性的L基團提供了一種在連續反應中使不同分子綴合於聚合物X的可能性。優選地，本發明方法使用如下通式的試劑X-[NH-CO-Ar-ff-(CH = CH) n-(CH2)2-SO2R' ]m (Ia)其中Ar代表未被取代或被取代的芳基基團特別是苯基基團，其中任選的取代基 選自上文對在連接基團Q中含有的芳基基團所提到的取代基；R，代表氫原子或任選被取代 的烷基(優選C^6烷基)、芳基(優選苯基)或烷基-芳基(優選烷基-芳基)基團； 並且W和m具有上面給出的意義；以產生如下通式的新綴合物X-[NH-CO-Ar-ff' -(CH = CH) n-(CH2) 2-Z] m (lib)在這些優選化合物Ia和IIb中，優選η是0，並且優選m代表1_4中的一個整數， 特別是1。優選每個W均代表CO基團，並且W'代表CO基團或CH. OH基團。優選R'代表 任選被取代的烷基基團，例如一個任選被羥基取代的CV4烷基基團，例如-CH2CH2OH,或特別 是CV4烷基-芳基基團，特別是對甲苯基。優選Ar是一個未被取代的苯基基團。優選X是 聚亞烷基二醇，特別是聚乙二醇。式I的化合物，特別是式Ia的化合物，被認為是意料不到穩定的，並且對含有硫醇 或氨基基團的分子具有高活性。本發明的綴合過程被認為通過形成如下通式的中間化合物 而進行X-[Q-ff- (CH = CH)n-CH = CH2Jm V其中X、Q、W和m具有上文給出的含義。要通過本發明方法綴合的分子可為任何所需的分子。其可為例如天然分子或來源 於天然分子的分子，或者其可為具有生物活性的任何分子，例如任何藥物，條件是其含有硫 醇(-SH)或氨基(-NHR)基團。例如，其可為蛋白或肽在整個此說明書中，為了方便將使用 術語「蛋白」，除非上下文另有要求，否則提及蛋白應理解為是指「蛋白或肽」。所述分子通過其連接的所述硫醇或氨基基團是一種能夠與試劑I反應、除去離去 基團L的親核試劑。這種基團可存在於天然生物分子中，或可在綴合之前引入生物分子中。兩個硫醇基團可通過還原可位於鏈內或鏈間的天然的或設計的二硫(半胱氨酸) 鍵生成。一個生物分子可含有一個或多個二硫鍵，可進行生成游離巰基部分的還原，以還原 一個或多個二硫鍵。根據二硫鍵還原的程度和所用多聚體綴合試劑的化學計量比，可能將 一個或多個聚合物分子綴合於所述生物分子。如果需要還原少於總數的二硫鍵，那麼可使 用固定化的還原劑，也可使用不同反應條件或加入變性劑進行部分還原。或者，硫醇基團可為單個半胱氨酸殘基或者非源於二硫鍵的其他硫醇基團。單個 半胱氨酸可通過合成方式引入，以提供合適的結合點。這一方法特別可用於綴合肽。胺基團可為例如賴氨酸或組氨酸殘基。這些基團可存在於天然生物分子中，或通 過合成引入。例如，組氨酸殘基可通過組氨酸標籤(his-tag)的方式引入，組氨酸標籤是一 種通過合成方法結合於蛋白的連續組氨酸殘基短鏈，例如含有多至12個組氨酸殘基，但通 常含有5或6個組氨酸殘基。組氨酸標籤強結合於鎳和鈷，使得它們可結合於在稱為固定 化金屬親和色譜的分離方法中使用的含有鎳或鈷的色譜柱。組氨酸標籤被廣泛使用，它們 結合於大量蛋白和肽，以使所述蛋白和肽或者其來源的產物將來可從混合物中分離。當所述分子為蛋白時，其可為例如肽、多肽、抗體、抗體片段、酶、細胞因子、趨化因 子、受體、血液因子、肽激素、毒素、轉錄蛋白或多聚體蛋白。
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下面給出一些根據所需應用可用於本發明的具體蛋白。酶包括碳水化合物特異性 酶、蛋白水解酶等。對於工業(基於有機的反應)和一般性生物應用特別是治療應用，感興 趣的酶包括US 4，179，337公布的氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和連接酶。 感興趣的具體酶包括天冬醯胺酶、精氨酸酶、腺苷脫氨酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、糜 蛋白酶、脂酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷 脂酶、葡萄糖醛酸酶和穀氨醯胺酶。用於通式I化合物的蛋白包括例如血液蛋白如白蛋白、轉移蛋白、因子VII、因子 VIII或因子IX、von Willebrand因子、胰島素、ACTH、胰高血糖素、生長抑素、生長素、胸腺 素、甲狀旁腺激素、色素激素、生長調節素、促紅細胞生成素、促黃體激素、下丘腦釋放因子、 抗利尿激素、催乳素、白細胞介素、幹擾素、集落刺激因子、血紅蛋白、細胞因子、抗體、抗體 片段、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲狀腺激素和組織型纖溶酶原激活因子。某些上述蛋白例如白細胞介素、幹擾素和集落刺激因子也以非糖基化形式存在， 通常由重組蛋白技術製備產生。所述非糖基化形式可用於本發明。^ftk^T^ffiS S Mi Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990)6 315-365公開的變應原蛋白，這些蛋白在與聚合物例如聚(烯化氧)綴合時已降低 了變應原性並因此適合用作耐受誘導物。在這些變應原中，公開的有Ragweed抗原E、蜂毒 (honeybee venom)、蟎變應原等。對糖聚肽例如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂酶、葡糖腦苷脂酶、凝集素、組織型纖溶酶 原激活因子、糖基化白細胞介素、幹擾素和集落刺激因子感興趣，也對免疫球蛋白例如IgG、 IgE、IgM、IgA、IgD及其片段感興趣。特別感興趣的是在用於診斷和治療目的的臨床藥物中使用的受體和配體結合蛋 白以及抗體和抗體片段。所述抗體可單獨使用或可共價綴合(「加載」)於另一原子或分 子例如放射性同位素或細胞毒性/抗感染藥物。表位可用於疫苗接種以產生免疫原性聚合 物-蛋白綴合物。如果需要，可將所述生物分子衍生化或功能化。具體而言，在進行綴合前，可先使 所述分子例如天然蛋白與多種阻斷基團反應以保護其上的敏感基團；或者可先使用本發明 方法或使用其他方法將所述分子與一種或多種聚合物或其他分子綴合。所述分子可為分子量相對低的合成分子。例如，它可以是綴合對其有利的任何藥 物。對於許多這類分子，必須插入攜帶硫醇或氨基基團以使其可與本發明試劑綴合的合適 接頭。典型藥物包括例如卡託普利、兩性黴素B、喜樹鹼、紫杉醇、伊立替康及其衍生物如 SN38、多烯紫杉醇和利巴韋林。可使用本發明方法綴合的其他感興趣的分子包括在WO 2004/060965中列出的那些。本發明方法可在全部反應物在其中可溶的溶劑或溶劑混合物中進行。可使要綴合 的分子，例如蛋白，在水性反應介質中直接與通式I的化合物反應。此反應介質也可根據親 核基團(硫醇或胺)的PH需要被緩衝。在許多情況下，所述反應的最佳pH為至少6.0，通 常為約6. 8到約8. 5，例如約7. 0-8. 0，優選約7. 5-8. 0 ；但在其他情況下，可使用低至4. 0的 PH，特別是當需要與多組氨酸標籤綴合時，致使可用pH範圍是4. 0-8. 5。如果優選在存在要 綴合的分子的情況下原位生成上式V的化合物，那麼適合在整個過程中使用較高PH。或者，如果優選在單獨步驟中生成上式V的化合物並隨後加入要綴合的分子，那麼所述第一步驟 適合在相對較高PH (例如7. 5-8. 0)下進行，而所述隨後步驟適合在更低pH (例如6. 0-6. 5) 下進行。本發明試劑的一個優點是其可成功地在較寬範圍的PH條件下使用。3-37°C之間的反應溫度通常是合適的如果綴合反應在可發生蛋白的降解、聚集 或變性的溫度下進行，那麼蛋白可能發生這些損害功能和/或反應效率的過程。在有機介 質(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中進行的反應通常在最高至室溫的溫度下進行。與許多其他試劑不同，使用等於化學計量或稍微過量的所需試劑可使所述分子與 試劑有效綴合。然而，由於所述試劑與用於溶劑合物例如蛋白的水性介質不發生競爭性反 應，因此可以用化學計量過量的試劑進行綴合反應。過量的試劑和產物可通過常規純化過 程中的離子交換色譜，或者在存在組氨酸標籤時可通過使用鎳進行分離容易地分離。如果所述分子通過其進行綴合的基團為硫醇基團，本發明方法可如下進行原位 地部分還原來源於所述生物分子中兩個半胱氨酸的二硫鍵，隨後所還原產物與式(I)化合 物反應。二硫鍵可通過常規方法用例如二硫蘇糖醇、巰基乙醇或三(羧乙基)膦進行還原。本發明方法的中間產物是其中W'為吸電子基團的通式II化合物。這些化合物本 身是有用的因為本發明方法在合適的條件下是可逆的，其中W'為吸電子部分的式(II) 化合物可用於需要所述分子從綴合物中釋放的應用中，例如直接的臨床應用中。然而，吸電 子基團W'可被還原以生成阻止所述分子釋放的部分，並且這種化合物還可用於許多臨床、 工業和診斷應用中。因此，例如，含有酮基團的W'基團可被還原為含有CH(OH)基團的W'部分；醚基 團CH. OR可通過羥基基團與醚化試劑的反應得到；酯基團CH. 0. C(O)R可通過羥基基團與醯 化試劑的反應得到；胺基團CH. NH2, CH. NHR或CH. NR2可通過還原性胺化從酮或醛製備；或 者醯胺CH. NHC(O)R或CH. N(C(O)R)2可通過胺的醯化形成。使用氫硼化物，例如硼氫化鈉、 氰基硼氫化鈉、硼氫化鉀或三乙醯氧基硼氫化鈉作為還原劑是特別優選的。其他可用的還 原劑包括例如氯化亞錫、醇鹽例如烷醇鋁以及氫化鋁鋰。通式(I)的化合物可通過使通式(III)的化合物與通式(IV)的化合物反應而制 備 A-Q-W-(CH = CH)n_(CH2)2~L (III)其中Q、W、n和L具有上文給出的含義X-Bm (IV)其中X代表聚合物；選擇基團A和B使得化合物(III)和(IV) —起反應以得到所 需的式(I)化合物。通式II的化合物具有多種應用。例如，它們可用於對患者的直接臨床應用，從而 本發明還提供了一種包含通式II的新化合物和可藥用載體的藥物組合物。本發明還提供 一種在治療中使用的通式II的新化合物，以及治療患者的方法，該方法包括對患者給予藥 物有效量的式II的新化合物或本發明的藥物組合物。通過合適地選擇生物分子可得到任 何所需的藥學效應，例如創傷治療、酶替代、蛋白替代、傷口護理、排毒、抗炎、抗感染、免疫 調節、疫苗接種或抗癌。通式II的化合物可包括顯像劑，例如放射核苷酸，以能夠在體內追 蹤所述化合物。通式II的化合物還可用於非臨床應用中。例如，許多生理活性化合物例如酶能夠在有機溶劑中催化反應，通式II的化合物可用於這些應用中。此外，通式II的化合物還可 用作診斷工具。下面的實施例對本發明進行了舉例說明。在附圖中

圖1示出了實施例1步驟1的反應路線。圖2示出了實施例1步驟2的反應路線。圖3示出了實施例1步驟3的反應路線。圖4示出了實施例1步驟4的反應路線。圖5示出了實施例2產物的SDS-PAGE分析結果。圖6示出了實施例3產物的SDS-PAGE分析結果。圖7示出了實施例5產物的SDS-PAGE分析結果。圖8示出了實施例6中反應的反向色譜分析。圖9示出了實施例7產物的SDS-PAGE分析結果。圖10示出了實施例8中反應的陽離子交換色譜分析。圖11示出了實施例8的ELISA結果。圖12示出了實施例9產物的SDS-PAGE分析結果。圖13示出了實施例11時間過程聚乙二醇化的色譜圖。圖14示出了在實施例10和11中提到的化合物9、10和11的互變。圖15示出了實施例11的轉變結果。圖16示出了實施例12的反向色譜結果。圖17示出了實施例13的穩定性結果。圖18示出了實施例17中間產物的SDS-PAGE分析結果。圖19示出了實施例17終產物的SDS-PAGE分析結果。圖20示出了實施例17的吸光度結果。圖21示出了實施例19的反應路線。圖22示出了實施例20的反應路線。實施例1 :PEG試劑合成IOkDa PEG試劑R的合成。步驟1，對羧基-3-哌啶基苯丙酮鹽酸鹽^的合成。此步驟的反應路線示於圖1。在一個250ml圓底燒瓶中裝入對乙醯基苯甲酸(15.0g，l)、ll. Ilg哌啶鹽酸鹽和 8.23g多聚甲醛。然後加入無水乙醇(90ml)和濃鹽酸(Iml)，將得到的懸液在氬氣下攪拌 回流加熱10小時。在停止回流後，加入丙酮(150ml)並使反應混合物冷卻至室溫。將所得 白色沉澱在一個玻璃過濾器(G!3)上分離並用預冷的丙酮洗滌兩次。然後將所得固體在真 空下乾燥以得到白色結晶粉末(2,9. 72g) ο 1H NMR(400MHz,DMS0-d6) δ 1. 79,2. 96,3. 45 (br m,哌啶部分的 CH2)，3. 36 (t, 2H, COCH2)，3. 74 (t, 2H, NCH2)，8. 09 (m, 4H, ArH)。步驟2 :4-(3-(對甲苯基硫)丙醯)苯甲酸互的合成。此步驟的反應路線示於圖2。將對羧基-3-哌啶基苯丙酮鹽酸鹽2(1. Og)和4-甲基苯硫酚(417mg，出懸浮在 無水乙醇(7. 5ml)和甲醇(5ml)的混合物中。然後加入哌啶(50 μ 1)並將所得懸液在氬氣 下攪拌回流加熱6小時。將冷卻至室溫得到的白色沉澱用玻璃過濾器(G!3)過濾，用冷丙酮小心洗滌並真空乾燥以得到 5 (6Hmg)。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 2. 27 (s，3H，苯基-CH3)， 3. 24，3. 39 (t，2 χ 2Η, CH2), 7. 14,7. 26 (d, 2 χ 2Η，甲苯基部分的 ArH)，8. 03 (m，4Η，羧酸基團 的 ArH)。步驟3，4-(3-甲苯磺醯基丙醯)苯甲酸6的合成。此步驟的反應路線示於圖3。將4-(3-(對甲苯基硫)丙醯)苯甲酸5(160mg)懸浮在水(IOml)和甲醇(IOml) 的混合物中。在冰浴中冷卻後，加入過氧硫酸氫鉀(oxone) (720mg,Aldrich)並使反應混合 物升溫至室溫伴隨攪拌過夜(15小時)。將所得懸液另外用水GOml)稀釋從使得其近乎勻 質，然後將混合物用氯仿(共100ml)萃取3次。將合併的氯仿萃取物用鹽水洗滌，然後用 MgSO4乾燥。於30°C在真空下蒸發揮發性物質，得到白色固體6(149mg)。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 2. 41 (s, 3H,苯基-CH3)，3. 42 (t, 2H, CO-CH2)，3. 64 (t, 2H, SO2-CH2) ,7. 46, 7. 82 (d, 2x 2H，甲苯基部分的ArH)，8. 03 (m, 4H，羧酸部分的ArH) ·步驟4，聚乙二醇化4-(3-甲苯磺醯基丙醯)苯甲酸——PEG試劑9的合成。此步驟的反應路線示於圖4。將4-(3-甲苯磺醯基丙醯)苯甲酸6 (13;3mg)和0-(2-氨基乙基)-0'-甲基-PEG 8 (MW IOkDa, 502mg,BioVectra)溶解於幹甲苯(5ml)中。將溶劑在真空下不加熱除去，然後 將幹固體剩餘物在氬氣下重新溶解於幹二氯甲烷(15ml)中。在氬氣下向在冰浴中冷卻的 所得溶液中緩慢加入二異丙基碳化二亞胺(DIPC，60mg)。然後將反應混合物在室溫下攪拌 過夜(15小時)。然後在真空下除去揮發性物質(30°C，水浴)以得到固體剩餘物，將所述 固體剩餘物伴隨輕微加熱(35°C )重新溶解在丙酮OOml)中。將所述溶液用不吸水脫脂棉 過濾以除去不溶物質。然後將所述溶液在乾冰浴中冷卻以得到白色沉澱，將所述沉澱通過 離心G600rpm，30分鐘)分離。傾去液相，將此沉澱步驟重複三次。然後將所得灰白色固 體在真空下乾燥，得到 PEG試劑 9 (437mg)。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 2. 46 (s, 3H,苯基-CH3)， 3. 38 (s，3H, PEG-OCH3)，3. 44-3. 82 (br m, PEG) ,7. 38, 7. 83 (d, 2 χ 2Η,甲苯基部分的 ArH)， 7. 95(111，4!1，羧酸部分的六州)。不同PEG分子量的類似PEG試劑通過相同的通用方法製備。因此，20kDa PEG通過 使碸 6 (20. 8mg)、0- (2-氨基乙基)-O『-甲基-PEG (20kDa, 250mg, Fluka)和 DIPC (8. 7mg, 7)在幹二氯甲烷(15ml)中反應製備，在丙酮沉澱純化過程後得到灰白色固體Q45mg)。 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 2. 46 (s, 3H,苯基-CH3)，3. 38 (s, 3H, PEG-OCH3)，3. 44-3. 82 (br m, PEG) ,7. 38, 7. 83 (d，2 χ 2Η，甲苯基部分的 ArH)，7. 95 (m，4H，羧酸部分的 ArH) ·實施例2 用分子量5、10和20kDa的PEG試劑9對具有單一鉸鏈二硫鍵(兩個硫 醇)的Fab抗體片段進行的聚乙二醇化。向 100 μ 1 的 Fab 溶液(Abeam cat. no. AB6520, lmg/ml)中力口入 5 μ 1 的 DTT 儲液 (IOOmM的去離子水溶液)，使所得溶液在室溫下靜置30分鐘。將所述溶液用95 μ 1 pH 7. 8 的含有0. 15M NaCl和IOmM EDTA的50mM磷酸鹽緩衝液稀釋至200 μ 1，然後加載至經pH7. 8 的含有0. 15M NaCl和IOmM EDTA的50mM磷酸鹽緩衝液預平衡的illustra NAP-5柱(GE Healthcare cat. No. 17-0854-01)上。將該 NAP-5 柱用 5 X 300 μ 1 的 pH 7. 8 的新鮮磷酸鹽 緩衝液洗脫。對於全部級分測量^Onm下的UV吸光度，其中還原的Fab被鑑定出主要存在 於級分3中，並且蛋白濃度估計為0. 23mg/ml。
將分子量為5kDa、IOkDa和20k Da的三種PEG試劑溶解於pH 7. 8的磷酸鹽緩衝 液中，分別得到0. 5mg/mlUmg/ml和ang/ml的溶液濃度。對於每個聚乙二醇化反應，使用了 5.0μ1的還原Fab溶液(0. 23mg/ml)和 0.42μ1的PEG溶液(還原的鉸鏈二硫鍵硫醇的1摩爾當量)。所述Fab反應溶液也用 4.6μ1的pH 7. 8的磷酸鹽緩衝液稀釋，得到終體積10 μ 1。將反應溶液在4°C下孵育12小 時。然後使用NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris 凝膠 Qnvitrogen cat. No. NP0321B0X)禾Π NuPAGE MES SDS 電泳緩衝液 Gnvitrogen cat. No. NP002)對反應溶液 進行SDS-PAGE分析。將所述凝膠用hstantBlue (Expedeon cat. No. ISB1L)染色。在下 圖5中示出結果。以蛋白分子量標準來看，PEG在SDS-PAGE分析上的電泳情況是其實際大 小的約兩倍，因此5kDa PEG的電泳情況如同IOkDa蛋白。Fab是一種約50kDa的蛋白，並 在SDS-PAGE凝膠上的電泳情況在未還原時為約50kDa處的單條帶，或者對於還原形式為約 25kDa處的兩條帶。所述兩條帶是在還原條件和SDS孵育下不再通過鉸鏈二硫鍵保持在一 起的重鏈和輕鏈。因此，儘管在溶液中Fab可被雙聚乙二醇化，從而單個PEG連接於還原的 鉸鏈二硫鍵的兩個半胱氨酸中的每一個，然而SDS-PAGE分析顯示了 25kDa重鏈和輕鏈的單 聚乙二醇化。在標記為1的泳道中是蛋白分子量標準(Novex sharp protein standards, Invitrogen cat. No. LC5800)。泳道2示出了 Fab本身。標記為4的泳道中示出了被DTT 還原的Fab (約25kDa)。泳道5示出了 5kDa聚乙二醇化結果，主要產物是對應聚乙二醇化 Fab的35kDa處的帶。只有少量還原Fab仍為25kDa，表明Fab大都被聚乙二醇化。泳道6 示出了 IOkDa聚乙二醇化結果，主要產物是對應IOkDa聚乙二醇化Fab的在40kDa分子量 標準之上的帶。泳道7示出了 20kDa的結果，主要產物是對應20kDa聚乙二醇化Fab的在 60kDa分子量標準之上的帶。泳道3示出了無在先還原步驟的未果聚乙二醇化的結果無 聚乙二醇化產物的事實說明聚乙二醇化的反應位點是還原的二硫鍵。實施例3.天門冬醯胺酶以5kDa PEG試劑9的聚乙二醇化向 Iml 的 lmg/ml 天門冬醯胺酶(Sigma cat. no A3809)在 pH 7. 8 的含有 150mM NaCl和5mM EDTA的20mM磷酸鈉緩衝液中的溶液中加入DTT (15. 4mg)，震蕩數秒後將所得 溶液在室溫下放置40分鐘。然後將這Iml溶液加入經pH 7.8的含有150識NaCl和5mM EDTA 的 20mM 磷酸鈉緩衝液預平衡的 PD-IO 柱(GE Healthcare cat. No. 17-0851-01)中， 收集洗脫液作為上樣級分。然後將該柱用5X Iml的新鮮磷酸鹽緩衝液洗脫。將級分3和 4合併得到anl。在去離子水中製備5kDa PEG試劑9的10mg/ml溶液，並向ΙΟΟμ 1還原的天門冬 醯胺酶中加入2. O μ 1 (游離硫醇的1. 5當量的PEG)。將所述溶液震蕩數秒，然後置於4°C 下過夜，之後取樣進行SDS-PAGE分析。結果示於圖6。泳道1示出了用於估計MW的蛋白分 子量標準，泳道2示出了聚乙二醇化之前的天門冬醯胺酶，泳道3示出了還原的天門冬醯胺 酶與5kDa PEG試劑的反應溶液。觀察到對應於兩個半胱氨酸都被聚乙二醇化的強帶，作為 恰好在60kDa蛋白分子量標準之上的主要產物。第二條較低MW的帶恰好在50kDa蛋白分 子量標準之上，該帶對應予兩個半胱氨酸中僅之一被聚乙二醇化。在30和40kDa蛋白分子 量標準之間僅有對應還原的天門冬醯胺酶的非常微弱的帶，表明幾乎全部蛋白都被PEG試 劑9聚乙二醇化。
實施例4，以分子量5、10和20kDa的PEG試劑9對具有游離單半胱氨酸的 G-CSF(粒細胞集落刺激因子)的聚乙二醇化以及與以具有馬來醯亞胺官能團的5kDa PEG 的比較。將GCSF 儲液(0. 66mg/ml 在 pH 6. 2 的含有 150mM NaCl 和 IOmM EDTA 的 50mM 的 磷酸鈉緩衝液中)分為每份100 μ L的5部分(天然G-CSF和用於聚乙二醇化反應的4部 分)。將所述部分與相對於G-CSF的1摩爾當量PEG試劑在4°C下孵育過夜。對於5kDaPEG 試劑9和對於5kDa PEG馬來醯亞胺(Fluka cat. no. 63187)，這包括加入3. 5 μ 1的5mg/ml 的PEG的去離子水溶液。對於IOkDa PEG試劑9，這包括加入7 μ 1的5mg/ml的PEG的去離 子水溶液。對於20kDa PEG試劑9，這包括加入14. 0 μ 1的5mg/ml的去離子水溶液。這些 聚乙二醇化反應物通過SDS-PAGE (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris凝膠、MES緩衝液，均 來自 hvitrogen，以及 hstant-Blue 染色劑(Expedeon cat. No. ISBlL))進行分析。未加 入PEG試劑的G-CSF呈現為在15和20kDa蛋白分子量標準之間的帶。對於試劑9的5kDa 聚乙二醇化，可見一條對應於5kDa單聚乙二醇化GCSF的在約30kDa處的帶。對於試劑9的 IOkDa聚乙二醇化，可見一條對應於IOkDa單聚乙二醇化G-CSF的在40kDa之下的帶。對於 20kDaPEG的結果，可見一條對應於20kDa單聚乙二醇化G-CSF的在50和60kDa之間的帶。 對於5kDa PEG馬來醯亞胺反應物，除了未反應的G-CSF之外未見其他帶，表明用此試劑時 無反應發生。實施例5.用IOkDa和20kDa PEG試劑9對在C端含有8個組氨酸序列的IFN α-2b
中的組氨酸的聚乙二醇化。向 20μ1 IFN α-2b 的溶液(1. 13mg/ml 在 pH 7. 5 的含有 2mM EDTA 和 150mM NaCl 的IOmM磷酸鈉緩衝液中)中加入1摩爾當量的IOkD PEG試劑9 (1. 8 μ 1的6mg/ml的去離 子水溶液)，並將所得溶液在室溫下孵育過夜。用1摩爾當量的20kD PEG試劑9(3.3μ1的 6. 6mg/ml的去離子水溶液)重複上述過程。然後將這兩個樣品均通過SDS-PAGE (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠、MES 電泳緩衝液，均來自 hvitrogen，以及 hstant-Blue 染 色劑(Expedeon cat. No. ISBlL))進行分析。結果示於圖7中。在標記為1的泳道中是蛋 白分子量標準。泳道2中僅起始IFN。泳道3示出了 IOkDa PEG試劑9反應的結果。在30 和160kDa蛋白分子量標準之間有對應於綴合有1-5條PEG鏈的IFN的5條可區分帶。泳道 4示出了 20kDa PEG試劑9反應的結果。在60和IlOkDa蛋白分子量標準之間有對應於綴 合有1-3條PEG鏈的IFN的3條可區分帶。標記為5的泳道是未染色的20kDa PEG試齊lj， 因此無可見帶。標記為6的泳道是未染色的IOkDa PEG試劑，因此無可見帶。實施例6. 5kDa PEG試劑9對肽(瘦素(Leptin)片段，其結構中有單游離半胱氨 酸)的聚乙二醇化。將Img 瘦素片段 116-130 醯胺(小鼠)(Sigma cat. no. L6788)溶解在 Iml pH 7.8 的含有150mM NaCl和IOmM EDTA的50mM磷酸鈉緩衝液中。在pH 7. 8的相同緩衝液中制 備5mg/ml的5kDa PEG試劑9的溶液。向50 μ 1所述瘦素片段溶液中加入50 μ 1緩衝液和 96. 1 μ 1所述PEG溶液(相對於半胱氨酸上的游離硫醇3摩爾當量的PEG)。將所述溶液 震蕩數秒，然後置於4°C下過夜，之後對樣品進行RP-HPLC分析。RP-HPLC由連接於JASCO HPLC系統的分析柱Source 5RPC 4. 6/150 (Amersham bioscience cat. no. 17511601)構成。 緩衝液A為水+0.05%三氟乙酸(Fisher scientific，HPLC級)，緩衝液B為乙腈(Fisherscientific, HPLC級)。方法為緩衝液A以Iml/分鐘的流速在30分鐘內從100%到0%o 在214ηπ^Π^0ηπι監測HPLC譜。瘦素片段、PEG試劑和反應溶液的結果示於圖8中。所述瘦素片段具有11. 4分鐘的保留時間。在所述反應混合物中，此峰消失並被 16. 5分鐘處的峰代替，表明此片段已被成功衍生化。實施例7 分子量20kDa的PEG試劑9對帶有多組氨酸標籤的結構域抗體片段的 聚乙二醇化及該片段的生物活性。向2.7ml抗TNF-α結構域抗體片段溶液(蛋白序列取自專利WO 2005/035572，為 圖12中作為TAR1-5-19列出的序列，並表達為在該蛋白C端帶有6組氨酸的標籤；1. 5mg/ ml在pH 7. 5的50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉和350mM咪唑溶液中)中加入0. 3ml PEG試劑 的去離子水溶液(40mg/ml，相對於蛋白1.9摩爾當量)。將所述溶液轉移到D-Tube 透 析儀(Novagen, cat. No. 71508-3)中，並在4°C下相對IL pH 6. 2的緩衝液(50mM磷酸鈉、 150mM氯化鈉、20mMEDTA)透析16小時。使用在30分鐘內從pH 4. 5的20mM乙酸鈉到pH 4. 5的含有700mM氯化鈉的20mM乙酸鈉的線性梯度，將所得反應溶液在Resource S柱(GE Healthcare, cat. No. 17-1178-01)上純化。收集級分，並用SDS-PAGE分析，結果示於圖9中。使用了 NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 111 (Invitrogen cat. No. NP032IB(K)和 NuPAGE MES SDS 電泳緩衝液 (Invitrogen cat. No. NP002)，並且以 InstantBlue (Expedeon cat. No. ISB1L)染色凝膠。 以蛋白分子量標準來看，PEG在SDS-PAGE分析上的電泳情況是其實際大小的約兩倍，因此 20kDa PEG的電泳情況如同40kDa蛋白。所述結構域抗體片段是一種約12. 7kDa的蛋白。在 標記為1的泳道中是蛋白分子量標準(Novex sharp protein standards, Invitrogen cat. No.LC5800)。泳道2示出僅該蛋白。標記為3的泳道是反應溶液。53kDa處的帶對應於單 聚乙二醇化的蛋白。雙PEG-蛋白被一條約SOkDa的帶所表示，並且在泳道頂端有微量的多 聚乙二醇化的蛋白。泳道4以沒有來自未聚乙二醇化蛋白汙染的單條帶示出了純化單聚乙 二醇化結構域抗體片段。實施例8. 20kDa PEG試劑9對抗TNF- α的親合體(af f ibody) (1個游離硫醇半胱 氨酸)的聚乙二醇化和ELISA結合。向 Iml 的 lmg/ml 抗 TNF-α 的親合體(Affibody AB cat. no 10. 0841. 01)在 pH 7. 8的含有150mM NaCl和20mM EDTA的50mM磷酸鈉緩衝液中的溶液中加入DTT (3. Omg) 以還原任何二硫鍵，在震蕩數秒後將所得溶液置於室溫下30分鐘。然後將這Iml溶液加 載至經pH 6. 2的緩衝液(50mM磷酸鈉、150mM NaCl和20mM EDTA)預平衡的PD-10柱(GE Healthcare cat. No. 17-0851-01)中。然後將該柱用5 X Iml的pH 6. 2的新鮮磷酸鹽緩衝 液洗脫。280nm的測量值表明級分3和4含有還原蛋白，將這兩個級分合併得到anl。向所 述蛋白溶液中加入10 μ 1對苯二酚飽和水溶液並充分混合。在去離子水中製備20mg/ml的 20kDa PEG試劑9溶液並將73 μ 1 (相對於游離半胱氨酸硫醇1摩爾當量的PEG)加入DTT 處理的親合體中。將所述溶液震蕩數秒，然後置於室溫下3小時，之後取樣進行SDS-PAGE 分析。在3小時後，大量的聚乙二醇化的蛋白已經形成，因此純化此聚乙二醇化反應物 而不使此反應進行完全。純化使用Resource S陽離子交換色譜柱(GE Healthcare, cat. No. 17-1178-01)實現，使用以pH4. 5的20mM乙酸鈉作為流動相經30分鐘的線性鹽梯度
14(0-700mMNaCl)。結果示於圖10中。圖10中標記為1的泳道示出了用於估計MW的蛋白分 子量標準。標記為2的泳道示出了用DTT處理前的親合體溶液。DTT存在下的親合體示於 標記為3的泳道。泳道4示出了通過PD-10柱除去DTT後的親合體，可見對應於單體親合體 (可用於聚乙二醇化的游離硫醇半胱氨酸)和二聚體(不可用於聚乙二醇化的半胱氨酸) 親合體的兩條帶。標記為5的泳道示出了聚乙二醇化反應溶液。對於單聚乙二醇化的親合 體可見一條恰好在50kDa蛋白分子量標準之上的帶。陽離子交換色譜純化的單聚乙二醇化 的親合體在泳道6中顯示為沒有來自未聚乙二醇化的蛋白汙染的單條帶。所述純化的單聚乙二醇化產物與TNF-α的結合活性通過ELISA方法進行了分 析將TNF- α (10ug/ml 在 pH 9. 6 的 15mM Na2CO3>34. 9mM NaHCO3 溶液中)VX 100 μ 1/ 孔加入96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc)並在4°C下孵育過夜。然後除去TNF-α，以 100 μ 1/孔加入PBS/1% BSA並在室溫下孵育1小時。然後除去PBS/1% BSA，加入聚乙二 醇化抗-TNF- α 的親合體(以 0. 026,0. 13,0. 65,3. 25ug/ml 在 PBS/1 % BSA 中)並在室 溫下孵育1小時。不將聚乙二醇化親合體加入對照孔中。然後將所述板用300μ 1/孔的 PBS/0. 1% Tween 20 (PBS/T)洗滌三次。然後以 100 μ 1/孔加入抗-PEG兔抗體(Epitomics， cat no. 2061-1 ；1 1000稀釋於BSA/PBS中)並在室溫下孵育1小時。用PBS/T洗 滌3次後，以100 μ 1/孔加入辣根過氧化物酶綴合的抗-兔抗體(Abcam，cat no. ab6721 ； 1 1000稀釋於BSA/PBS中)並在室溫下孵育1小時。然後將孔用PBS/T洗滌3次， 以 100 μ 1/孔加入 3，3' ,5,5'四甲基聯苯氨底物(Sigma-Aldrich，cat no. T0440)。在 黑暗下孵育15分鐘後，以100 μ 1/孔加入終止試劑(Sigma-Aldrich, cat no. S5689)並在 650nm下讀取吸光度。示於圖11的ELISA結果表明聚乙二醇化的親合體對TNF-α的特異性結合，證實 該蛋白在聚乙二醇化後保持活性。在不存在TNF-α的情況下無抗-PEG抗體的結合。實施例9.使用20kDa PEG試劑9對在N端具有8組氨酸序列的幹擾素α -2b (IFN α -2b)的組氨酸序列的聚乙二醇化。經和不經氫化硼鈉還原的20kDa聚乙二醇化IFN的抗
病毒活性。向4. 67ml在N端具有8組氨酸序列的IFN α -2b的溶液(1. 07mg/ml在pH 7.4的 含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩衝液中)中加入2. 6摩爾當量的20kD PEG試劑
的60mg/ml的去離子水溶液)，並將所得溶液在室溫下孵育過夜。在SDS-PAGE (NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝膠、MES 電泳緩衝液，均來自 Invitrogen，以及 InstantBlue 染 色劑(Expedeon cat. No. ISB1L))分析後，對反應樣品進行高效陽離子交換色譜(連接於 Jasco HPLC 系統的 T0S0H DEAE 柱，S TSKgel DEAE-5PW, Supelco Cat No. 8-07164)以純化 單聚乙二醇化的IFN α -2b。將從所述離子交換色譜柱得到的(每個Iml)級分用SDS-PAGE 分析。將主要含單聚乙二醇化IFN的級分進行冷凍乾燥。將冷凍乾燥後得到的剩餘物溶解 於含有150mM NaCl和2mM硼氫化鈉的50mM磷酸鈉緩衝液中並仍置於室溫下1小時。然後將 所得溶液進行尺寸排阻色譜(HiLoad 16/60, Superdex 200，以50mM PBS作為洗脫液，流速 為1. 6ml/分鐘並在214nm下檢測)以分離單聚乙二醇化的IFN。將分離的樣品用SDS-PAGE 分析，結果示於圖12中。圖12標記為1的泳道中是蛋白分子量標準。標記為2的泳道示 出僅起始IFN。泳道3示出了對應於純化的20kDa單聚乙二醇化IFN α -2b的50和60kDa蛋白分子量標準之間的單條帶。抗病毒活性抗病毒測定對培養在含有青黴素和鏈黴素的DMEM/10%胎牛血清 (FCS)中的A549細胞進行。將A549細胞以0. 2X106細胞/ml的濃度懸浮在DMEM/10% FCS 中，並以50 μ 1/孔分裝到96孔微量滴定板中。第二天，以2倍稀釋液製備聚乙二醇化的 IFN樣品和天然IFN樣品，並將50 μ 1的每種稀釋液加入孔中。然後將所述板孵育M小時。 然後除去培養基並將細胞以在DMEM/5% FCS中配製的腦心肌炎病毒(EMCV)接種(50 μ 1/ 孔)。再將細胞孵育M小時，然後用300 μ 1/孔的PBS洗滌並用4%甲醛/0. 1 %甲基紫 (50 μ 1/ 孔；Sigma-Aldrich, cat no. 198099)染色 30 分鐘。然後將所述板用 300 μ 1/ 孔的 PBS洗滌兩次並空氣乾燥。用2% SDS溶液(50 μ 1/孔)增溶染料並在570nm下測量吸光 度。(A)未處理的或(B)用硼氫化鈉處理的20kDa聚乙二醇化IFN- α 2b分別顯示64pg/ml 和68pg/ml的活性。實施例10.與具有馬來醯亞胺官能團的市售PEG試劑相比PEG試劑9的穩定性。在pH 7. 4下通過核磁共振(WR)光譜法比較PEG試劑9 (5kDa和20kDa樣品)與 甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺-丙醯胺(Chirotech Technology Ltd，cat. no. 008-008， lot no. 223126001)和 α -甲氧基-ω -乙基-聚乙二醇(Iris Biotech cat. no. PEGl 146， lot no. 128512)的穩定性。首先通過冷凍乾燥pH 7. 4的含有150mM NaCl和20mM EDTA的 50mM磷酸鈉水溶液並用重水重新配製至相同體積，製備pH 7.4的1)20溶液。將丙酮作為標 準物以1. 0 μ l/3ml加入所述緩衝液中。將PEG試劑的樣品以1 μ mol溶解於0. 75ml所述緩 衝液中，並且在4小時和25. 5小時後通過400MHz NMR光譜法分析。在使用2. 17ppm的丙 酮標準物的完整度標準化之後，通過比較6. 86ppm的完整度確定PEG馬來醯亞胺樣品的穩 定性。在使用2. 2Ippm的丙酮標準物的完整度標準化之後，通過比較7. 31、7. 40、7. 47、7. 73 和8. 03ppm的信號的總完整度來確定PEG試劑9的穩定性。7. 31,7. 47和8. 03ppm的峰來 自如預計從PEG試劑9形成的蛋白活性PEG試劑10(圖14)。在此實驗過程中，對於樣品 1和2，PEG試劑9與蛋白活性PEG試劑10的比在整個實驗過程中都介於1. 46-1. 77 I0 此穩定性研究結果示於表1中。在PH 7. 4下所述PEG馬來醯亞胺樣品經過21. 5小時降解 了 19-55%，而PEG試劑9在相同條件下未降解。表1.比較PEG試劑9與PEG馬來醯亞胺的NMR穩定性研究的結果。
權利要求
1.一種如下通式的化合物X- [Q-ff- (CH = CH) n- (CH2) 2-L] m (I)其中X代表一個聚合物；Q代表一個連接基團；W代表一個吸電子基團；η代表0或1-4 中的一個整數；L代表一個離去基團；m代表1-8中的一個整數。
2.權利要求1的化合物，其中Q代表直接鍵合、一個亞烷基基團或者一個任選被取代的 芳基或雜芳基基團，所述基團的任一種都可被一個或多個如下原子或基團終止或中斷氧 原子、硫原子、-NR基團(其中R代表一個氫原子或一個烷基、芳基或烷基-芳基基團)、酮 基團、-0-C0-基團、-C0-0-基團和/或-NR. CO-基團。
3.權利要求2的化合物，其中Q代表一個任選被取代的在鄰近所述聚合物X處被 NR. CO-基團終止的芳基或雜芳基基團。
4.前述權利要求任一項的化合物，其中X為聚亞烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸 酯、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、HPMA共聚物、聚 酯、聚縮醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亞胺酯)、聚醯胺、二乙烯基醚-馬來酸酐和 苯乙烯-馬來酸酐的共聚物、多糖或蛋白。
5.權利要求4的化合物，其中X為聚亞烷基二醇。
6.權利要求5的化合物，其中X為聚乙二醇。
7.前述權利要求任一項的化合物，其中W代表一個酮基團CO、一個酯基團-0-C0-或一 個碸基團-SO2-。
8.前述權利要求任一項的化合物，其中η是0。
9.前述權利要求任一項的化合物，其中L代表-SR、-S&R、-0S02R、-N+R3、-N+HI 2、-N+H2R、 滷素或-O0 ,其中R代表一個氫原子或一個烷基、芳基或烷基-芳基基團，0代表一個含有 至少一個吸電子取代基的被取代芳基。
10.前述權利要求任一項的化合物，其具有通式X-[NH-CO-Ar-ff-(CH = CH)n-(CH2)2-S02R' ]m (Ia)其中Ar代表一個未被取代或被取代的芳基基團，R』代表一個氫原子或一個未被取代 或被取代的烷基、芳基或烷基-芳基基團。
11.權利要求10的化合物，其中Ar代表任選被一個或多個相同或不同的選自如下基團 的取代基取代的苯基基團烷基，-CN、-NO2^-CO2R, -C0H、-CH2OH, -COR、-OR、-0C0R、-OCO2R,-SR、-S0R、-SO2R, -NHC0R、-NRC0R、-NHCO2R, -NR. CO2R, -NO、-NH0H、-NR. OH、-C = N-NHC0R、-C =N-NR. COR、-N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R,滷素、-C = CR、-C = CR2 和一 C = CHR，其中每個 R均獨立地代表一個氫原子或一個烷基、芳基或烷基-芳基基團。
12.權利要求11的化合物，其中Ar代表一個苯基基團，R』代表一個對甲苯基基團。
13.一種使含有硫醇或氨基基團的分子綴合於一種聚合物的方法，包括使所述分子與 前述權利要求任一項的化合物反應。
14.權利要求13的方法，其中所述分子為一種肽或一種蛋白。
15.一種通式II的化合物X-[Q-W' -(CH = CH) n-(CH2)2-ZJm (II)其中X、Q、η和m具有前述權利要求任一項給出的含義，Z代表通過一個硫醇或氨基基 團綴合的分子，W'代表一個吸電子部分或可通過還原吸電子部分製備的部分。
16.權利要求15的化合物，其具有通式X-[NH-CO-Ar-W' - (CH = CH) n-(CH2) 2_Z] m (IIa) 其中Ar代表一個未被取代或被取代的芳基基團。
17.權利要求16所要求的化合物，其中Ar代表任選被一個或多個相同或不同的選自如 下基團的取代基取代的苯基烷基，-CN、-NO2^-CO2R,-C0H、-CH2OH,-COR、-OR、-0C0R、-OCO2R 、-SR、-SOR、-SO2R、-nhcor、-NRCOR、-NHO)2R、-NR. (X)2R、-N0、-NH0H、-NR. OH、-C = N-NHC0R、-C =N-NR. COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R,滷素、-C = CR、-C = CR2 和-C = CHR，其中每個 R 均獨立地代表一個氫原子或一個烷基、芳基或烷基-芳基基團。
18.權利要求17的化合物，其中Ar代表一個苯基基團。
19.權利要求17或18的化合物，其中Z為一種肽或一種蛋白。
20.一種藥物組合物，包含權利要求15-19任一項的化合物和可藥用載體。
全文摘要
一種通式X-[Q-W-(CH＝CH)n-(CH2)2-L]m(I)的化合物，其中X代表一個聚合物；Q代表一個連接基團；W代表一個吸電子基團；n代表0或1-4中的一個整數；L代表一個離去基團；m代表1-8中的一個整數。所述化合物可用於綴合生物分子。
文檔編號A61K47/48GK102099058SQ200980128495
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月17日 優先權日2008年7月21日
發明者A·戈德溫 申請人:寶力泰銳克斯有限公司