一種基於代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量的判別方法

2023-09-19 20:56:45

一種基於代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量的判別方法
【專利摘要】本發明提供了一種對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量進行判別的方法。利用新鮮菸葉中磷脂醯乙醇胺(18:3/18:3)與甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值對代謝組學研究中的新鮮菸葉質量進行判別，該法操作簡單快速、結果準確可靠，可為菸草代謝特徵分析及相關菸草代謝組學研究提供借鑑。
【專利說明】-種基於代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量的判別方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分析化學領域，是一種基於新鮮菸葉中的脂類物質含量對代謝組學研 究中的新鮮菸葉樣品質量進行判別的方法。

【背景技術】
[0002] 植物代謝組學是通過考察植物受刺激或擾動後其代謝產物的變化或其隨時間的 變化，來研究植物體系的一種技術。通過對植物體內小分子化合物代謝的輪廓分析可直接 獲得植物的生理生態變化。在植物代謝組學研究中，樣品的質量決定著分析數據的真實可 靠性；而樣品的保存條件決定樣品質量的好壞。對於不能在取樣後立刻進行代謝組學分析 的植物樣品，通常建議超低溫保存；即在-8(TCW下的極低溫度環境下保存生物樣品。在超 低溫環境下植物樣品的代謝過程會大大減緩，W此來保持樣品的穩定性。
[0003] 菸草作為模式生物和重要的經濟作物，近幾年來針對菸草的代謝組學研究越來越 多。但由於菸草樣品保存不當而導致的質量發生變化而導致代謝物含量失真的情況時有發 生。急需一種簡單、快速的分析方法對植物代謝組學研究中的菸草樣品質量進行判別。
[0004] 脂類是菸草中一類重要物質，具有重要的生物學功能。它是菸草代謝過程中所需 燃料的膽存形式，可作為能源；類脂(主要是磯脂）是構成生物膜的主要成分，膜的不可通透 性、對各種物質的擴散與運輸功能等，均與其有關；脂類作為細胞的表面物質，與細胞識別、 組織免疫等有密切關係。近年來有關植物中脂類化合物的提取、檢測等方法的報導也是層 出不窮，但未曾有人提出將新鮮菸葉中的脂類物質含量或含量比值用於代謝組學新鮮菸葉 樣品質量的判別。


【發明內容】

[0005] 本發明目的在於提供了一種對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量進行判別的 方法。利用新鮮菸葉中磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量的 比值對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量進行判別，該法操作簡單快速、結果準確可靠。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明技術方案為：
[0007] -種基於代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量的判別方法，通過檢測新鮮菸葉中 磯脂醜己醇胺與甘油H醋含量，計算其比值，對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量進行 判別。
[0008] 將得到磯脂醜己醇胺與甘油H醋含量的比值作為區分代謝組學正常樣品、變質樣 品及部分變質樣品的標準，其中待測品種中磯脂醜己醇胺與甘油H醋含量的比值在1. 8及 W上的為正常樣品，可用於代謝組學分析，磯脂醜己醇胺與甘油H醋含量的比值在0. 1 W 下的為變質樣品，磯脂醜己醇胺與甘油H醋含量的比值在0. 1-1. 8之間的為部分變質樣 品。
[0009] 其具體方法為：
[0010] 1)稱取一定量的新鮮菸葉樣本，加入含內標的甲醇，潤旋0. 5-1. 5分鐘；再加入甲 基叔下基離，潤旋0. 5-1. 5分鐘；最後加入水，潤旋0. 5-1. 5分鐘；靜置後離也，將上清液稀 釋2-4倍，移至進樣瓶中用於HPLC-MS分析。
[0011] 2)HPLC具體參數：色譜柱；Waters T3;柱溫；55°C;進樣量4uL;柱流速；0. 26血/ min ;流動相A ;6/4己膳/水冷lOmM己酸饋）；流動相B ;9/1異丙醇/己膳冷lOmM己 酸饋）；洗脫梯度 0-0. Olmin ;0-30%B，0. 01-1. 5min ;30%-54%B，1. 5-4. Omin ;54-55〇/〇B, 4. 0-14. Omin ;55-80%B，14-17. Omin ;80-85%B，17-17. 5min ;85-100%B，17. 5-22. 5min : 100%-30%B，22. 5-27. 5min ;30%B ;MS具體參數：電噴霧離子源巧SI)，採用正離子模式檢測； 使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，乾燥氣溫度35CTC，乾燥氣流速為9m L/min，霧化氣壓 45psig ;離子源溫度35(TC，毛細管電壓為4000V，溶劑化離子去簇電壓230V，錐孔電壓65V， 質也（Centroid)模式採集質譜數據；質量掃描範圍m/z400?1000。
[0012] 所述內標及其含量為；磯脂醜己醇胺0. 02-0. 04g/L及甘油H醋0. 002-0. 004g/ L；
[0013] 所述菸草鮮葉、含內標的甲醇溶液、甲基叔下基離和水按質量/體積比加入量為 =10 ?30:0. 1 ?0. 3 ;0. 5 ?0. 7 ;0. 1 ?0. 15。
[0014] 本發明研究人員經過大量新鮮菸葉樣品的分析研究，發現新鮮菸葉如果保 存不當，其脂類物質的含量會發生較大變化，磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋 (16:0/16:0/16:0)含量的比值也會明顯降低，此類樣品將不能用於代謝組學分析。因此可 磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量的比值作為一個標準 對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量進行判別。
[0015] 本發明研究人員利用新鮮菸葉樣品中磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋 (16:0/16:0/16:0)含量的比值和樣品質量的相關性，對代謝組學新鮮菸葉樣品進行質量判 另IJ。本發明的優點：操作簡單快速，結果準確可靠；樣品用量少；適用於不同生育期的新鮮 菸葉。本方法可為菸草代謝特徵分析及相關菸草代謝組學研究提供借鑑。

【具體實施方式】
[0016] 下面實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用於說明本發明而不是限制本發 明。
[0017] 本發明將磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量的比值 作為區分代謝組學正常樣品、變質樣品及部分變質樣品的標準。即待測品種中磯脂醜己醇 胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量的比值在1.8及W上的為正常樣品，可 用於代謝組學分析，磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量的比值 在0. 1 W下的為變質樣品，磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)含量 的比值在0. 1-1. 8之間的為部分變質樣品。
[0018] 磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)是植物中廣泛存在的 兩種脂類物質，本實驗採用高效液相色譜質譜聯用法（HPLC-MS)對新鮮菸葉樣品中的磯脂 醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋（16:0/16:0/16:0)進行相對定量分析。分析步驟如下：
[0019] 1)稱取一定量的新鮮菸葉樣本（10mg-30mg)，加入含內標磯脂醜己醇胺 (15:0/15:0) (0.02-0. 04g/l，avanti)及甘油H醋（15:0/15:0/15:0) (0.002-0. 004g/ L avanti )的純甲醇（100-300 y L, Merk)，潤旋0. 5-1. 5分鐘；再加入甲基叔下基離 巧00-700 y L sigma)，潤旋 0. 5-1. 5 分鐘；最後加入水（100-150 y L)，潤旋 0. 5-1. 5 分鐘； 靜置後離也，將上清液稀釋2-4倍，移至進樣瓶中用於HPLC-MS分析。
[0020] 2)HPLC(Agilentl200)具體參數：色譜柱；Waters T3( 1. 8 y m，2. 1 X 100mm);柱溫： 55°C ;進樣量4 y L ;柱流速；0. 26血/min ;流動相A ;6/4己膳/水(含lOmM己酸饋，sigma); 流動相B ;9/l異丙醇/己膳(含lOmM己酸饋，sigma);洗脫梯度0-0. Olmin ;0-30%B， 0. 01-1. 5min ;30〇/〇-54〇/〇B，1. 5-4. Omin ;54-55〇/〇B，4. 0-14. Omin ;55-80〇/〇B，14-17. Omin : 8〇-85〇/〇B，17-17. 5min ;85-100〇/〇B，17. 5-22. 5min ;100〇/〇-30〇/〇B，22. 5-27. 5min ;30〇/〇B。MS (Agilent QT0F6510)具體參數：電噴霧離子源巧SI),採用正離子模式檢測；使用高純N2 輔助噴霧電離與脫溶劑，乾燥氣溫度35(TC，乾燥氣流速為9m L/min，霧化氣壓45psig ; 離子源溫度35(TC，毛細管電壓為4000V，溶劑化離子去簇電壓230V，錐孔電壓65V，質也 (Centroid)模式採集質譜數據；質量掃描範圍m/z400?1000。
[0021] 在上述條件下可定性新鮮菸葉中的120種脂類物質，採用內標校正法對脂類物質 進行相對定量。
[0022] 磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)是一種物質，括號中表示的是脂肪酸鏈的鏈長；磯脂 醜己醇胺（15:0/15:0)是內標，用來校正分析過程中的誤差。兩者屬於同一個類別，但是脂 肪酸鏈長不同。
[0023] 實施例1
[0024] 本批待測樣本包括福建、貴州、湖南等7個省份、7個品種、15個產地，5個不同生育 期的36個點共206份菸草鮮葉樣本(每個點有5-7個生物學重複)。其中中部葉成熟時期 的福建龍巖雲煙87,貴州矜南的畢納1號、湖南張家界的K326等菸草鮮葉樣本及雲南大理 現蕾期中煙100及下部葉成熟期紅大，貴州遵義盛花期紅大樣本因液氮不足等原因已完全 褐化，河南許昌的樣本部分褐化，其他樣本保存完好。
[00巧]樣品分析步驟如下所述：
[0026] 1)稱取20mg的新鮮菸葉樣本，加入含磯脂醜己醇胺（15:0/15:0) (0.03g/L， avanti)及甘油H醋（15:0/15:0/15:0)(0. 003g/L avanti)的純甲醇 200 y L 潤旋 0. 5-1. 5 分鐘；再加入600 y L甲基叔下基離（sigma),潤旋0. 5-1. 5分鐘；最後加入120 y L水，潤旋 0. 5-1. 5分鐘；靜置後離也（15000巧m，10分鐘)，將上清液稀釋2-4倍(稀釋劑；異丙醇/己 膳/水：65/30/5)，移至進樣瓶中用於HPLC-MS分析。
[0027] 2)HPLC (Agilentl200)具體參數；色譜柱 Waters T3 (1.8ym，2. IXlOOmm); 柱溫；55°C ;進樣量4y L ;柱流速；0. 26血/min ;流動相A ;6/4己膳/水(含lOmM己酸饋， si卵a);流動相B ;9/1異丙醇/己膳(含lOmM己酸饋，sigma);洗脫梯度0-0. Olmin ;0-30%B, 0. 01-1. 5min ;30〇/〇-54〇/〇B，1. 5-4. Omin ;54-55〇/〇B，4. 0-14. Omin ;55-80〇/〇B，14-17. Omin : 80-85%B,17-17. 5min ：85-100%B,17. 5-22. 5min ： 100%-30%B,22. 5-27. 5min ：30%B〇 MS (Agilent QT0F6510)具體參數：電噴霧離子源巧SI),採用正離子模式檢測；使用高純N2 輔助噴霧電離與脫溶劑，乾燥氣溫度35(TC，乾燥氣流速為9m L/min，霧化氣壓45psig ; 離子源溫度35(TC，毛細管電壓為4000V，溶劑化離子去簇電壓230V，錐孔電壓65V，質也 (Centroid)模式採集質譜數據；質量掃描範圍m/z400?1000。
[0028] 該分析條件下獲得了上述206份新鮮菸葉中120種脂類物質的相對含量（即 每種脂質的質譜響應與內標響應的比值)，發現磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋 (16:0/16:0/16:0)含量的比值變化顯著，見表1。
[0029] 表1實施例1中所用實驗樣品信息及磯脂醜己醇胺（18:3/18:3)與甘油H醋 (16:0/16:0/16:0)含量的比值
[0030]

【權利要求】
1. 一種基於代謝組學研究中的新鮮菸葉樣品質量的判別方法，其特徵在於：通過檢測 新鮮菸葉中磷脂醯乙醇胺與甘油三酯含量，計算其比值，對代謝組學研究中的新鮮菸葉樣 品質量進行判別。
2. 根據權利要求1所述判別方法，其特徵在於：將得到磷脂醯乙醇胺與甘油三酯含量 的比值作為區分代謝組學正常樣品、變質樣品及部分變質樣品的標準，其中待測品種中磷 脂醯乙醇胺與甘油三酯含量的比值在1.8及以上的為正常樣品，可用於代謝組學分析，磷 脂醯乙醇胺與甘油三酯含量的比值在〇. 1以下的為變質樣品，磷脂醯乙醇胺與甘油三酯含 量的比值在0. 1-1. 8之間的為部分變質樣品。
3. 根據權利要求1或2所述方法，其特徵在於：其具體方法為： 1) 稱取一定量的新鮮菸葉樣本，加入含內標的甲醇，渦旋〇. 5-1. 5分鐘；再加入甲基 叔丁基醚，渦旋0. 5-1. 5分鐘；最後加入水，渦旋0. 5-1. 5分鐘；靜置後離心，將上清液稀釋 2-4倍，移至進樣瓶中用於HPLC-MS分析。 2. HPLC具體參數：色譜柱：Waters T3 ;柱溫：55°C;進樣量4 ii L ;柱流速：0. 26mL/min ; 流動相A :6/4乙腈/水(含10mM乙酸銨);流動相B :9/1異丙醇/乙腈(含10mM乙酸銨);洗 脫梯度 〇_〇? Olmin :0-30%B，0. 01-1. 5min :30%-54%B，1. 5-4. Omin :54-55%B，4. 0-14. Omin : 55-80%B,14-17. Omin ：8〇-85%B,17-17. 5min ：85-100%B,17. 5-22. 5min ：100%-30%B, 22. 5-27. 5min :30%B ;MS具體參數：電噴霧離子源（ESI)，採用正離子模式檢測；使用高純 N2輔助噴霧電離與脫溶劑，乾燥氣溫度350°C，乾燥氣流速為9m L/min，霧化氣壓45psig ; 離子源溫度350°C，毛細管電壓為4000V，溶劑化離子去簇電壓230V，錐孔電壓65V，質心 (Centroid)模式採集質譜數據；質量掃描範圍m/z400?1000。
4. 根據權利要求1或2所述方法，其特徵在於：其具體方法為：所述內標及其含量為： 磷脂醯乙醇胺0? 02-0. 04g/L及甘油三酯0? 002-0. 004g/L ; 所述菸草鮮葉、含內標的甲醇溶液、甲基叔丁基醚和水按質量/體積比加入量為=10? 30:0. 1 ?0? 3 :0? 5 ?0? 7 :0? 1 ?0? 15。
【文檔編號】G01N30/88GK104422750SQ201310401080
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】許國旺, 常玉瑋, 趙春霞, 李麗麗, 路鑫, 張俊傑, 趙燕妮 申請人:中國科學院大連化學物理研究所