靶向代謝物的檢測的製作方法

2023-09-19 20:48:50

專利名稱：靶向代謝物的檢測的製作方法
靶向代謝物的檢測相關申請本申請是國際PCT申請，其要求2010年7月7日提交的美國臨時申請第61/362，193號的優先權。前述申請的整個文本在此通過引用全文併入。
背景技術：
使用複合式生物/無機設備來快速且靈敏地生物感測核酸和蛋白對識別生物醫學的病原體和生化恐怖分子重要性提供法庭證據以及用於識別已知的基因型至關重要。Fl-ATP酶最近已經用於構建能夠用於單分子檢測(美國專利第6，989，235號)的納米尺度旋轉設備(美國專利公布第2006/0110738號)。這些文件證明了使用生物分子來利用由顯微鏡可見的檢測信號提供DNA的單分子檢測的可行性。本發明涉及可以用於檢測感興趣的特定的蛋白的靶的檢測方法。發明簡述本發明提供了用於高度靈敏地檢測感興趣的代謝物的方法和組合物包括使用包括錨固部件、橋連部件以及 信號產生部件的納米檢測設備，其中錨固部件是分子馬達，信號產生部件是納米棒且橋連部件是特異性地結合於感興趣的代謝物的蛋白。在第一實施方案中，本發明涉及納米檢測設備，其包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中:(a)錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子單位的N端上的組氨酸標籤(his-tag)和Fl-Y子單位上的半胱氨酸，其中多個Fl-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述F1-γ子單位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述橋連部件包括結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在的蛋白，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的Fl-Y子單位連接於所述錨固部件；以及(C)所述信號產生部件包括電磁檢測探針，所述電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下，被特異性地結合於所述橋連部件的所述蛋白的部分官能化。 更具體地，所述橋連部件內的所述蛋白是轉錄調控蛋白，所述轉錄調控蛋白包括針對特異性DNA序列的結合位點和針對該小分子代謝物的結合位點且所述信號產生部件包括已知結合所述轉錄調控因子的特異性DNA序列。例如，所述轉錄調控蛋白是轉錄激活蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄激活蛋白時出現所述設備的組裝僅發生在所述小分子代謝物結合於所述轉錄調控蛋白的存在下。可選擇地，所述轉錄調控蛋白是轉錄阻遏蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄阻遏蛋白時出現所述設備的組裝且所述電磁檢測探針在所述小分子代謝物的存在下與所述蛋白分離。
在另一個可選擇方案中，所述橋連部件內的所述蛋白是信號轉導蛋白，所述信號轉導蛋白包括針對該小分子代謝物的結合位點，其中所述信號轉導蛋白在結合於所述小分子代謝物時改變構象，且所述信號產生部件包括檢測所述信號轉導蛋白的所激活的構象的抗體。在又一個可選擇方案中，所述橋連部件內的所述蛋白是DNA證明蛋白(proofingprotein)，其識別DNA序列中的修飾鹼基，且所述信號產生部件包括對待檢測的DNA序列是互補的DNA序列，其中當待檢測的所述DNA與固定於所述電磁檢測探針的所述DNA序列進行DNA鹼基配對時發生所述設備的組裝。在本文描述的任一個納米檢測設備中，電磁指示器包括至少一個光顆粒、磁顆粒和熱顆粒。在特別優選的實施方案中，電磁指示器是金屬納米棒，優選金納米棒。在某些實施方案中，電磁指不器包括包含至少一個突光珠和光散射顆粒的光指不器。 在優選的納米檢測設備中，電磁指示器是來自元素金屬組的膠態顆粒。還設想了使用方法。例如，本發明描述了一種用於檢測分子是否結合了轉錄調控蛋白的激活因子的方法，包括:(a)製備納米檢測設備，其中所述設備包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中:i)錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子單位的N端上的組氨酸標籤和Fl- Y子單位上的半胱氨酸，其中多個Fl-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl- Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述F1-γ子單位上的所述半胱氨酸被生物素化；ii)所述橋連部件包括結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在的蛋白，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的Fl-Y子單位連接於所述錨固部件；以及iii)所述信號產生部件包括電磁檢測探針，所述電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下，被特異性地結合於所述橋連部件的所述蛋白的部分官能化；(b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸；(c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl- Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP ；以及(d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的增強表明所述代謝物結合於所述轉錄調控蛋白。還設想了一種用於檢測結合阻遏蛋白的分子的方法，包括:(a)製備納米檢測設備，其中所述設備包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中，所述橋連部件內的所述蛋白是轉錄調控蛋白，所述轉錄調控蛋白包括針對特異性DNA序列的結合位點和針對該小分子代謝物的結合位點且所述信號產生部件包括已知結合所述轉錄調控因子的特異性DNA序列；(b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸；(c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl- Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP ；以及 (d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的減弱表明所述代謝物結合於所述阻遏蛋白。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用於檢測分子結合於信號轉導蛋白的方法，包括:(a)製備本發明的納米檢測設備，其中所述橋連部件內的所述蛋白是信號轉導蛋白，所述信號轉導蛋白包括針對小分子代謝物的結合位點，其中當所述信號轉導蛋白結合於所述小分子代謝物時改變構象，且所述信號產生部件包括抗體，所述抗體檢測所述信號轉導蛋白的激活構象；(b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸；(c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl- Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP ；以及(d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的增強表明所述代謝物結合於所述信號轉導蛋白。在另一個實施方案中，本發明提供了一種證明DNA的方法，包括:(a)製備本發明的納米檢測設備，其中所述橋連部件內的所述蛋白是DNA證明蛋白，所述DNA證明蛋白識別DNA序列中的修飾鹼基，且所述信號產生部件包括對待檢測的DNA序列是互補的DNA序列，其中當待檢測的所述DNA與固定於所述電磁檢測探針的所述DNA序列進行DNA鹼基配 對時發生所述設備的組裝；(b)使所述設備與待證明的DNA序列接觸；(c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl- Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP ；以及(d)通過在待證明的DNA存在下，測定由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁探針產生的信號來測定待證明的DNA序列中存在修飾DNA，其中當與固定於所述電磁檢測探針的DNA序列進行DNA鹼基配對時產生信號。在本文描述的任一種使用方法中，測定/檢測步驟優選地包括使用暗視場顯微鏡的可視檢測來檢測由所述信號產生部件產生的信號。更具體地，該方法包括測定來自檢測探針的一個或多個波長下的光的強度振蕩。本文還教導了用於識別靶向代謝物的存在的試劑盒，所述試劑盒包括(a)蛋白，其特異性地結合感興趣的小分子代謝物，其中所述蛋白以不幹擾所述感興趣的小分子代謝物的方式被生物素化；(b) Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有組氨酸標籤以有利於Fl-ATP酶附著於固體載體且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及(C)金納米棒，其被結合於分子，這在所述蛋白被結合於感興趣的小分子代謝物時識別(a)內的所述蛋白。在具體的實施方案中，試劑盒還包括固體載體。在另外其他的實施方案中，試劑盒還包括親和素。
本發明還設想一種用於檢測至少一種靶向小分子代謝物的方法，包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中:(a)所述錨固部件包括分子馬達，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子；(b)所述橋連部件包括至少一個生物組分或合成組分，所述至少一個生物組分或合成組分結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在，其中所述橋連部件通過共價的或高親和性結合的相互作用被連接於所述錨固部件；(C)信號產生部件，所述信號產生部件包括至少一個電磁檢測探針，所述至少一個電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下被特異性地結合於所述橋連部件或與所述橋連部件分離的部分官能化。在另一個實施方 案中，本發明涉及一種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括:(a)使多個分子馬達中的每一個結合於選定的橋連部件，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子，且所述橋連部件是結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件；(b)在由所述橋連部件組裝所述分子馬達後，將所述多個分子馬達錨固到固體載體；(C)將對所述橋連部件是特異性的電磁檢測探針結合於固定的橋連設備，其中所述橋連部件在不存在靶向代謝物下具有對所述探針的高親和性；且其中靶向代謝物結合於所述橋連部件導致探針對所述橋連部件的親和性減弱；(d)應用疑似含有對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品；(e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及(f)通過顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，其中由探針的電磁特性的變化標示的在存在的所述樣品內存在平移或旋轉運動表示所述樣品內缺乏靶向代謝物，而由探針的電磁特性缺乏變化標示的在存在的所述樣品內不存在平移或旋轉運動表示所述樣品內存在靶向代謝物。本發明的另一個實施方案涉及一種納米檢測樣品中的靶分子的存在的方法，包括:(a)使多個分子馬達中的每一個結合於選定的橋連部件；其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子，且所述橋連部件是結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件；(b)在由所述橋連部件組裝所述分子馬達後，將所述多個分子馬達錨固到固體載體；(C)應用疑似含有在不存在所述電磁探針下對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品；(d)結合對所述橋連部件是特異性的電磁探針，其中所述橋連部件在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物被結合於所述橋連部件時具有對所述探針的高親和性；(e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及(f)通過監測所述探針的電磁特性的變化由顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，
其中由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的增強標示的所述探針對所述橋連部件的增強的親和性表明所述樣品內存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物，而由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的減弱標示的所述探針對所述橋連部件的減弱的親和性表明所述樣品內不存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物。在又一個實施方案中，存在一種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括:(a)使多個分子馬達中的每一個結合於固體載體，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子；(b)使多個分子馬達中的每一個連接至橋連部件，所述橋連部件包括結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件；(c)將對所述橋連部件是特異性的電磁檢測探針結合於固定的橋連設備，其中所述橋連部件在不存在靶向代謝物下具有對所述探針的高親和性；且其中靶向代謝物結合於所述橋連部件導致所述探針對 所述橋連部件的親和性減弱(d)應用疑似含有對所述橋連部分是特異性的所述靶分子或靶向代謝物的樣品；(e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及(f)通過顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，其中由探針的電磁特性的變化標示的在存在的所述樣品內存在平移或旋轉運動表示所述樣品內缺乏靶向代謝物，而由探針的電磁特性缺乏變化標示的在存在的所述樣品內不存在平移或旋轉運動表示所述樣品內存在靶向代謝物。在本發明的又一個實施方案中，存在一種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括:(a)使多個分子馬達中的每一個結合於固體載體，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子；(b)使多個分子馬達中的每一個連接至橋連部件，所述橋連部件包括結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件；(c)應用疑似含有在不存在所述電磁探針下對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品；(d)結合對所述橋連部件是特異性的電磁探針，其中所述橋連部件在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物被結合於所述橋連部件時具有對所述探針的高親和性；(e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及(f)通過監測所述探針的電磁特性的變化由顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，其中如由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的增強標示的所述探針對所述橋連部件的增強的親和性表明所述樣品內存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物，而如由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的減弱標示的所述探針對所述橋連部件的減弱的親和性表明所述樣品內不存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物。應理解在上述方法中可以在步驟(d)之前、之後或與步驟(d)同時執行步驟(C)。在本發明的任一種方法中，所述橋連部分是轉錄調控蛋白，所述轉錄調控蛋白包括針對特異性DNA序列的結合位點和針對該小分子代謝物的結合位點且所述信號產生部件包括已知結合所述轉錄調控因子的特異性DNA序列。優選地，所述轉錄調控蛋白是轉錄激活蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄激活蛋白時出現所述設備的組裝，這僅發生在所述小分子代謝物結合於所述轉錄調控蛋白的存在下。可選擇地，所述轉錄調控蛋白是轉錄阻遏蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄阻遏蛋白時出現所述設備的組裝且所述電磁檢測探針在所述小分子代謝物的存在下與所述蛋白分離。在一些實施方案中，所述橋連部件是信號轉導蛋白，所述信號轉導蛋白包括針對該小分子代謝物的結合位點，其中所述信號轉導蛋白在結合於所述小分子代謝物時改變構象，且所述信號產生部件包括檢測所述信號轉導蛋白的所激活的構象的抗體。所述橋連部件可以是DNA證明蛋白，所述DNA證明蛋白識別DNA序列中的修飾鹼基，且所述信號產生部件包括對待檢測的DNA序列是互補的DNA序列，其中當該待檢測的DNA與固定於所述電磁檢測探針的所述DNA序列進行DNA鹼基配對時發生所述設備的組裝。在本發明中，電磁指示器或探針包括至少一個光顆粒、磁顆粒和熱顆粒。例如，所述電磁指示器或探針包括包含至少一個螢光珠和光散射顆粒的光指示器。在示例性的實施方案中，所述電磁指示器或探針是來自所述元素金屬組的膠態顆粒。若干副圖的簡述

圖1:用於納米檢測代謝物的暗視野顯微鏡裝置。圖2A到2C:當納米棒被相對於偏光濾光器定位在0°、45°和90°時，通過偏光濾光器看到的從單個金納米棒散射的光的顯微照片。該圖顯示了金納米棒附著於Fl-ATP酶的旋臂(Y子單位)。在位置A(0° )，顏色是綠色，在位置C，顏色是紅色。在位置B，顏色不是橙色而是從納米棒散射的綠光和紅光強度的混合。圖3:柱圖描述了基於在30個連續視野內觀察到的納米棒的數目，檢測細胞上清液中的Stx2毒素蛋白，使用包含產生大腸桿菌EDL933Stx2的菌株(圖3A、3C)或產生大腸桿菌MG1655的非毒素的菌株(圖3B、3D)的細胞上清液。圖3C和圖3D中的納米設備是對照，其省略了捕獲(抗_S tx2B)抗體。圖4:柱圖描繪了檢測含有純化毒素的樣品或來自含有EDL933(產毒素菌株)或MG1655(產非毒素菌株)的唾液樣品中的Stx2毒素蛋白。圖5:柱圖描繪了在10個連續視野中由納米設備組件測得的細胞上清液中的Stx2毒素蛋白的檢測限值(藍色)對10個(紅色柱)或30個(綠色柱)連續視野內的旋轉納米棒的數目。圖6:柱圖描繪了在10個連續視野中測定的純化的Stx2毒素蛋白的基於旋轉的檢測限制，且數據表示為隨樣品內的靶分子的數目(圖6A)或靶濃度(圖6B)變化。圖7:用於識別和量化數位相機視野內的紅色、綠色、藍色和黃色納米棒的算法中使用的標準的概述。圖8:描繪了用於多像素檢測同一樣品孔內的Stx2毒素蛋白(左側，紅色納米棒)和stxl基因DNA序列(右側，綠色納米棒)的自組裝納米設備。圖9:柱圖描繪了使用紅色和綠色納米棒同時測定分別在含有來自大腸桿菌EDL933(+毒素)或MG1655(-毒素)的上清液的孔中的同一樣品內的Stx2蛋白和stx2基因DNA序列。圖10:描繪了使用轉錄激活蛋白進行代謝物檢測。圖10A，靶向代謝物(cAMP)結合於被固定在F1分子馬達的旋臂上的激活蛋白(CAP)。圖1OB描繪了 cAMP結合於CAP誘導構象變化，這產生針對DNA受體序列的高親和性結合位點。圖1OC描繪了塗覆有特異性DNA受體序列的金納米棒將CAP-cAMP複合物結合於複合的納米設備組件且通過顯微鏡實現代謝物檢測。圖11:組裝好的部件(左側，包括F1、親和素、CAP以及DNA)的晶體結構且描繪了使用轉錄調控蛋白作為檢測代謝物的致動子(actuator)的納米設備部件。圖12:描述了使用轉錄阻遏蛋白檢測代謝物。圖12A描述了結合於固定在Fl分子馬達的旋臂上的阻遏蛋白(NRP)的靶向代謝物(NADH)。圖12B描繪了 NADH結合於NRP置換了 NAD+且誘導了消除針對DNA受體序列的結合位點的構象變化。圖12C描繪了塗覆有特異性DNA受體序列的金納米棒通過洗滌被去除且代謝物通過顯微鏡載玻片上結合的納米棒數目的減少被檢測。圖13:描述了用於使用NADH檢測代謝物的有序的納米設備陣列。圖14:描述了使用電子束光刻來在顯微鏡載玻片上以受控尺寸的圖案構建納米尺度鎳島。發明詳述在本發明中，提供了一種用於使用採用了固定的F1-ATP酶的納米檢測方法來檢測靶向代謝物的方法。存在多種轉錄調控蛋白，每一種結合具有高親和性和特異性的小分子。由於結合到特異性DNA序列，因而這樣的轉錄調控蛋白負責用於激活或阻遏DNA轉錄。這些調控蛋白中的大多數僅結合至呈二聚型的DNA，這是由於被單分子佔據而發生的。對於轉錄激活蛋白，代謝物結合引發二聚作用並形成高親和性結合位點以結合DNA。在阻遏蛋白中，代謝物的結合具有反面作用。調控蛋白的實例包括但不限於結合環狀AMP的分解代謝產物激活蛋白、結合樹膠醛糖的樹膠醛糖轉錄調節因子、尿嘧啶依賴性轉錄調節因子、GTP和異亮氨酸應答調控因子、色氨酸阻遏蛋白以及麥芽糖轉錄調控因子、抗葡萄糖澱粉酶調控因子。靶向代謝物包括但不限於胺基酸、碳水化合物、核苷酸、核苷、激素、有機酸以及將特異性地結合於轉錄調控蛋白的任何小分子。可以基因修飾調控蛋白以改變代謝物的特異性。在一個實施方案中，樹膠醛糖轉錄調節因子可以被突變，使得其對結合葡萄糖而取代樹膠醛糖變得是特異性的。 在本發明中，提供了可以用於檢測特異性代謝物的納米級檢測設備。示例性的這樣的設備通過將F1-ATP酶的分子安裝到顯微鏡載玻片的表面上且定位成旋轉的Y -子單位軸遠離表面來構建。這將通過在F1的α和/或β子單位的C端上存在組氨酸標籤來實現，這具有結合至顯微鏡載玻片的未被修飾或已被官能化而包含鎳-NTA的表面的高親和性。Fl-ATP酶Y-子單位被基因修飾以包含半胱氨酸，半胱氨酸將被共價修飾以包含生物素部分，經由如生物素-馬來醯亞胺。將提供檢測靶分子(代謝物)的特異性的轉錄調控蛋白將被基因修飾以包含用於生物素化的半胱氨酸，其被定位成不會干擾二聚作用或DNA結合位點。生物素化的調控蛋白和生物素化的Fl-ATP酶隨後使用親和素被組裝。在顯微鏡下可見的檢測探針的表面包括但不限於金納米棒，其將被官能化以包含雙螺旋DNA且序列對調控蛋白是特異性的。當靶分子(代謝物)結合於調控蛋白時進行檢測，這包括引發二聚作用並形成高親和性結合位點以結合DNA。隨後添加官能化的納米棒將使納米尺度的檢測設備的複雜組件僅用於已經結合代謝物的調控蛋白。檢測可以通過比較在靶向代謝物存在下與在靶向代謝物不存在下結合在顯微鏡載玻片上的納米棒的數目來進行。使用納米設備的組件的檢測限制是納米設備的靶向特異性組件的數目未明顯增加到高於非特異性地結合於顯微鏡載玻片的表面的金納米棒的數目的點。在這些限制條件下，添加ATP為Fl-ATP酶分子馬達提供了燃料以引起旋轉。唯一旋轉的納米棒是特異性地結合於正確組裝的包含靶向代謝物的納米設備的那些納米棒。ATP的檢測可以通過將金納米棒直接附著於Fl-ATP酶Y-子單位來進行，原因是ATP的存在將引起旋轉。類似的方式，ADP的存在可以使用偶聯酶測定由高濃度的丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸來進行。類似地，與Fl-ATP酶組裝的抗葡萄糖澱粉酶調控因子可以用於經由酶偶聯測定由己糖激酶和ATP來檢測葡萄糖，以將葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸鹽(G-6-P)。G-6-P隨後結合至調控蛋白以促進由DNA-官能化的金納米棒進行組裝以便用於檢測。使用阻遏蛋白進行的檢測通過由Fl-ATP酶和DNA官能化的納米棒組裝阻遏蛋白二聚體來實現。在此情形中，阻遏蛋白二聚體在靶向代謝物不存在下具有對DNA的高親和性。靶向代謝物結合於阻遏蛋白造成複合物離解，這被檢測為所觀察到的結合於顯微鏡載玻片的表面的納米棒 數目的減少。為了有利於量化結合的靶向代謝物的數目，納米設備可以按納米陣列圖案以特定的間隔被組裝在顯微鏡載玻片表面上。這將產生納米棒的網格圖案，該網格圖案在結合靶向代謝物時被幹擾。通過添加靶向代謝物之前和之後所觀察到的納米棒的數目來測定量化。在另一個實施方案中，使用信號轉導蛋白激酶構建設備來檢測靶向代謝物。通過結合特異性代謝物來激活若干蛋白激酶。具體實施方案是蛋白激酶A，其中激酶催化活性因結合環狀AMP而被激活。蛋白包含兩個催化子單位和兩個結合環狀AMP的調控子單位。環狀AMP結合至調控子單位誘導造成催化子單位分解和激活的構象變化。為了使用這些激酶中的一種檢測靶向代謝物，激酶的調控子單位將經由使用生物素-親和素鏈已經被生物素化的基因修飾的半胱氨酸被附著於生物素化的F1-ATP酶。此組裝將被設計成使得催化子單位遠離F1-ATP酶。當結合靶向代謝物時，催化子單位將分解，由此暴露調控子單位的先前螯合的區域。將已經被單克隆抗體官能化的金納米棒添加至調控子單位的在激活時暴露的那個部分將允許組裝納米設備，且由此實現檢測。在另一個實施方案中，設備被構建，使得形成納米棒/納米顆粒與Fl-ATP酶之間的橋的蛋白組分是用於檢測修飾DNA的DNA校對蛋白。DNA中的半胱氨酸甲基化是主要的表觀遺傳信號，該信號在細胞分裂期間的增殖染色質狀況中起到重要作用。校對蛋白特異性地結合於包含修飾鹼基如5-甲基胞嘧啶的DNA序列。例如，類似泛素的，含有PHD和無名指域(UHRFl) SRA域是DNA複製叉處CpG維護甲基化所需要的。此蛋白特異性地結合於DNA序列中的5-甲基胞嘧啶並使鹼基翻出DNA螺旋。負責結合於特異性修飾的DNA的校對蛋白將經由親和素-生物素鏈附著於F1-ATP酶。包含修飾鹼基的單鏈靶向DNA將被引入此檢測複合物中，或將被雜交到稱為檢測探針鏈的互補的DNA鏈中。此互補的鏈將被修飾以包含在任一端以共價方式附著於塗覆親和素的金納米棒的生物素以便組裝納米設備而實現檢測。因而本發明提供了新穎的設備和用於使用這樣的設備來極其靈敏地檢測給定樣品內的靶向代謝物的方法。本文所公開的方法檢測靶向小分子代謝物，在於該待檢測的小分子代謝物與結合蛋白的相互作用，僅在待檢測的特異性小分子代謝物的存在下，該結合蛋白才特異性地結合該小分子代謝物並在設備內產生信號。結合於該感興趣的小分子代謝物的特異性蛋白用於橋連錨固到固體表面的分子馬達與檢測探針。然而，橋僅在蛋白被結合於待檢測的小分子代謝物時才形成。當此結合發生時，通過揭示了由分子馬達賦予的運動至橋連部件的檢測探針進行揭示，該運動表示待檢測的小分子代謝物結合於橋連部件內的蛋白。賦予探針的運動通過合適地選擇來自檢測探針的信號的檢測工具被觀察。本發明的方法能夠檢測待檢測的小分子代謝物的單個分子，且因而提供用於具有多種應用的靶檢測的極其靈敏的技術，這些應用包括但不限於臨床診斷、法庭分析、基因表達分析、DNA排序和證明以及DNA計算。本發明所使用的裝置可以被描述為由三個單獨的部分構成:錨固部件、橋連部件以及信號產生部件。錨固部件將是將整個組件錨固至顯微鏡載玻片並允許基於顯微鏡檢測所產生的信號的部分。錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在F1-Ci或？^^子單位的N端上的組氨酸標籤和F1-Y子單位上的半胱氨酸，其中多個F1-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個F1-ATP酶分子被定位成所述F1- Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述F1-Y子單位上的所述半胱氨酸被生物素化。橋連部件包括結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的F1-Y子單位連接於所述錨固部件；以及所述信號產生部件包括電磁檢測探針，所述電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下，被特異性地結合於所述橋連部件的所述蛋白的部分官能化。待檢測的小分子代謝物可以是能夠結合於感興趣的蛋白的任何分子，其中蛋白被用作分子馬達與檢測馬達引起的運動的檢測探針之間的橋內的蛋白且被用於形成對待檢測的那個小分子代謝物是特異性的那個橋的工具。待檢測的小分子代謝物可以是能夠結合於感興趣的蛋白的任何分子，其中蛋白被用作分子馬達與檢測馬達引起的運動的檢測探針之間的橋內的蛋白且被用於形成對待檢測的那個小分子代謝物是特異性的那個橋的工具。執行待檢測 的小分子代謝物的檢測的樣品可以是感興趣的任何樣品，包括但不限於合成核酸、基因組DNA、細胞裂解物、組織勻漿、法醫樣品、環境樣品以及從細胞、組織或完整的生物體分離出的核酸樣品。此外，樣品可以來自可以用於識別結合於是橋連部件的一部分的蛋白的劑的小分子庫。這樣，可以識別形成設備的橋連部件的蛋白的新的調節物。本領域的技術人員可以容易地實現對用於在由此待檢測的小分子代謝物將結合於設備的橋連部件內的蛋白的條件下，使含有或疑似含有待檢測的小分子代謝物的樣品接觸納米檢測設備的條件進行優化。A.錨固部件納米檢測設備的錨固部件包括分子馬達，其是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的任何生物分子或合成分子。在優選的實施方案中，分子馬達包括生物分子馬達。這樣的生物分子馬達的非限制性示例包括Fl-ATP酶、肌動球蛋白、纖毛軸絲(ciliaryaxoneme)、細菌鞭毛馬達、驅動蛋白/微管以及核酸解螺旋酶和聚合物酶。在優選的實施方案中，分子馬達包括Fl-ATP酶。Fl-ATP酶在其鹼基結構內包括α-子單位和β_子單位。鹼基結構是不旋轉的且被優先錨固或附著於表面。表面可以是DNA微陣列、載玻片或其他電介質基材的一部分。舉個例子，Fl-ATP酶上的旋轉子單位包括Y子單位和ε子單位，而α子單位、β子單位以及δ子單位並不旋轉。因而，若Fl-ATP酶被用作分子馬達，那麼優選地第一親和性標籤(直接地或間接地)結合於y子單位和/或s子單位，而分子馬達經由官能部分諸如組氨酸標籤通過α子單位、β子單位或δ子單位被附著於底物。在優選的實施方案中，Fl-ATP酶旋轉生物分子馬達是α3β3γ子單位的複合物。此複合物提供了 Fl-ATP酶最佳地結合於固體載體且Y子單位結合於DNA。Fl-ATP酶組件、子單位組成以及Fl-ATP酶旋轉的引起對本領域技術人員是眾所周知的；例如參見，US20030215844 ；Yoshida 等人，Journal of Biological Chemistry, 252:3480-3485(1977) ；Du 等人，Journal of Biological Chemistry,276:11517-11523(2001) ；Bald 等人，Journalof Biological Chemistry,275:12757-12762(2000) ;Kato_Yamada 等人，Journal ofBiological Chemistry, 273:19375-19377(1998), Kato 等人，Journal of BiologicalChemistry, 272:24906-24912 (1997) ;Tucker 等人，Journal of Biological Chemistry,279:47415-8(2004) ;Tucker 等人，Eur.J.Biochem.268:2179-86(2001)以及 Du 等人，Journal of Biological Chemistry,276:11517-23(2001).
可以用於本發明的方法和組合物中的Fl-ATP酶子單位的示例性的非限制性示例對本領域技術人員來說是已知的且包括以下述基因銀行登錄號被保藏的那些:基因銀行登錄號NM128864 ;基因銀行登錄號NM121348 ;基因銀行登錄號NM104043 ;基因銀行登錄號D14699 ;基因銀行登錄號D14700 ；AB095026 ;基因銀行登錄號BT000409 ;基因銀行登錄號AY136289 ;基因銀行登錄號AY114540 ;基因銀行登錄號AJ487471 ;基因銀行登錄號M20929 ;基因銀行登錄號A F034118 ;基因銀行登錄號D10491 ;基因銀行登錄號X05366 ；基因銀行登錄號AY072309 ;基因銀行登錄號AY062627 ;基因銀行登錄號U61392 ;基因銀行登錄號U61391 ;基因銀行登錄號X05970 ;基因銀行登錄號AB044942 ;基因銀行登錄號AF052955 ;基因銀行登錄號D37948 ;基因銀行登錄號AB022018 ;基因銀行登錄號AB007034 ;基因銀行登錄號D15065 ;基因銀行登錄號D00022 ;基因銀行登錄號J05397 ；AF134892 ;基因銀行登錄號Z00018 ;基因銀行登錄號U46215 ;基因銀行登錄號X53537 ;基因銀行登錄號X03559 ;基因銀行登錄號AF010323 ;基因銀行登錄號AB003549 ;基因銀行登錄號D88377 ;基因銀行登錄號D88376 ;基因銀行登錄號D88375 ;基因銀行登錄號D88374 ；基因銀行登錄號D10660 ;基因銀行登錄號X68691 ;基因銀行登錄號X56008 ;基因銀行登錄號X55389 ;基因銀行登錄號X59066 ;基因銀行登錄號L13320 ;基因銀行登錄號X51422 ；基因銀行登錄號Z00026 ;基因銀行登錄號X07745 ；X55963 ;基因銀行登錄號X68690 ;基因銀行登錄號X56133 ;基因銀行登錄號V00312 ;基因銀行登錄號U37764 ;基因銀行登錄號M65129 ;基因銀行登錄號J03218 ;基因銀行登錄號M16222 ;基因銀行登錄號J02603 ；以及基因銀行登錄號U09305。Fl-ATP酶優選地被固定用於旋轉可視化技術或如果檢測取決於局部環境的擾動，諸如微電流或阻抗。一系列分子馬達，相同的或兩個或更多不同的分子馬達，可以被固定在表面上以產生本發明的納米檢測設備的陣列。如果每一個Fl-ATP酶被附著於設備的橋連部件內的不同的蛋白，且不同的設備被用不同的標籤標記，那麼此分子馬達陣列可以用於以類似於使用基因晶片的方式來檢測多個小分子代謝物。正如本文中使用的，「陣列」包括固體表面，且分子馬達附著於所述表面。在一些實施方案中，陣列是附著於固體表面的多個本發明的納米檢測的隨機陣列，其中設備檢測相同的或不同的小分子代謝物(即，納米檢測設備的橋連部件內的蛋白檢測不同的小分子)。在其他實施方案中，陣列是「可編址的」陣列，其中包含特異性蛋白的特定納米檢測設備的位置是給出的陣列上的具體位置，且該位置由不同的顏色或允許特定分子馬達的位置被精確定位的其他選定的標記標示。陣列通常包括連接於不同捕獲基團的多個分子馬達，捕獲基團連接於不同的已知位置內的基材的表面。例如，存在若干娃燒衍生物以將多個官能團附著於玻璃表面。正如本文中使用的，術語「固體表面」指的是具有剛性或半剛性表面的材料。這樣的材料將優選地呈小片、板、載玻片、蓋玻片、小珠、球丸、盤的形式或其他便利的形式，但是也可以使用其他形式。這些表面通常被塗覆有親和性靶。這樣的固體表面可以以任何方式被塗覆，改善了對其表面的期望結合和/或使非特異性結合於其表面為最少。在優選的實施方案中，使用鎳-次氮基三乙酸(N1-NTA)親和樹脂(Sigma-Aldrich產S#P6611)。在另一實施方案中，可添加乙醯基化BSA以減少非特異性結合。可以使用如電子束光刻來製造陣列。Fl-ATP酶的Y子單位被分子偶聯於鹼基結構並定位成朝上垂直於基材的表面。Fl-ATP酶作為分子馬達那樣操 作，且α子單位和β子單位引起Y子單位臂的旋轉。因而，Y子單位表現為驅動臂，定位成朝上，垂直於酶所附著的表面，並應答於α子單位和β子單位的活性而旋轉。在顯微鏡下難以直接看到Y子單位臂的旋轉，且因此Y子單位被偶聯於信號產生部件。B.信號產生部件和信號的檢測在本發明的納米檢測設備的信號產生部件中存在檢測探針。檢測探針可以是能夠附著於設備的橋連部件並提供檢測由分子馬達產生的運動的工具的任何物，諸如金屬納米顆粒(棒、球、量子點等)、螢光染料以及被螢光染料標籤的納米顆粒。在優選的實施方案中，元素金屬納米棒被使用，包括但不限於金、銀、鋁、鉬、銅、鋅以及鎳。在一個實施例中，能夠通過顯微鏡目視觀察的金棒檢測探針被官能化以具有經由生物素-親和素結合附著於其上的部分，當橋連部件的蛋白被結合於待檢測的小分子時，該部分結合於該蛋白。金納米棒被用蛋白或其它結合分子，諸如親和素，附著於Y子單位臂。Y子單位臂可以附著於金納米棒的任何部分，如任一端，在中間，或之間的任一點。結合分子將納米棒連接於Y子單位臂，使得Y子單位臂的旋轉運動被賦予金納米棒。金納米棒藉助Y子單位臂的旋轉運動而旋轉。在另外的實施例中，金納米棒被塗覆有抗-DIG抗體(親和性靶)，這特異性地結合於DIG (地谷新配基)第二親和性標籤。金屬納米顆粒諸如金納米棒是光的有效的吸收劑和散射體，原因是它們的稱為表面等離子體振子的導電電子的統一振蕩。表面等離子體振子帶的數目、位置和形狀由金屬種類、顆粒的尺寸和形狀以及周圍介質的介電常數決定。非球形的納米顆粒具有多表面等離子體振子模式。例如，棒形的納米顆粒表現出兩種共振模式，分別對應於它們的長軸和短軸。金納米棒被成形為具有圓端或扁平端的棒、軸或圓柱形。金納米棒直徑約15_40nm且沿著對稱軸的長度是約60-80nm。在其他實施方案中，金納米棒具有2.5: I到20:1之間的長徑比。棒形納米顆粒通常由鹼基片或球生長。金納米棒表現出光學各向異性，在於其具有對應於軸的直徑和長度的兩種表面等離子體振子共振。短軸對應於棒的橫向等離子體振子共振。長軸對應於棒的縱向等尚子體振子共振。金納米棒的短軸和長軸散射隨各自尺寸的變化將入射白光散射出不同波長的光。長軸具有比短軸大的表面積。金納米棒的短軸或端表面因較少的表面積而散射較短波長的光，而金納米棒的長軸或側表面因其較大的表面積而散射較長波長的光。在一個實施方案中，金納米棒的短軸散射具有約520-570nm波長的綠光，而長軸散射具有685-730nm波長的紅光。金納米棒的其他相對尺寸將入射白光散射兩種不同波長的光。金納米棒的光散射特徵連同其由Y子單位臂賦予的旋轉運動允許觀察和測量納米尺度的分子結構的物理特徵和行為現象。以簡化的觀點，全光譜，白光源通常指向在參考方向。白光光子撞擊金納米棒作為波函數，且根據金納米棒相對於偏光濾光器的入射角的方位，一些波長的光將被散射。對給定尺寸的金納米棒來說，當納米棒被對齊，使得短軸平行於偏光器(位置A)，綠光的散射最大且紅光的散射最小。當納米棒的長軸與偏光方向(位置B)對齊時，紅光的散射最大且綠光的散射最小。這可以在圖2中看到。從金納米棒散射的光被偏振。紅光和綠光共振的強度取決於納米棒相對於入射光的偏振面的相對方位。由於其連接至自旋的Fl-ATP酶分子馬達，金納米棒的旋轉性質產生閃現的或閃爍的交替的綠光和紅光的可觀察的光。紅光和綠光的閃爍強度和速率隨Y子單位的旋轉速度變化。通過觀察金納米棒的閃爍的紅光和綠光，可以檢測並測量Fl-ATP酶的旋轉運動。可見的閃爍光比物理旋轉結構本身更易於觀察。此外，散射的波長的偏光性質使金納米棒在位置A-D之間變暗。閃現的綠光和紅光是使用暗視野顯微鏡可檢測的、可觀察的和可測量的。圖1顯示了用以檢測、觀察和測量來自金納米棒30的散射光的暗視野顯微鏡儀器裝置。來自光源38的全光譜白光被入射至暗視野聚光器和透鏡40，這又改變了光路以產生相對於金納米棒30的長軸和短軸方位的傾斜角度。附著金納米棒30的Fl-ATP酶放置於載玻片表面20。Fl-ATP酶10和旋轉的金納米棒30被暴露於白光。Fl-ATP酶10的旋轉運動和金納米棒30的相應旋轉使紅光和綠光波長的入射光根據納米棒的方位散射。當長軸暴露於白光時，紅光 散射，而當短軸暴露於白光時，綠光散射。未散射的光繼續進入物鏡42，在此處由虹膜44阻擋。由金納米棒30散射的光的波長穿過虹膜或孔44。偏光濾光器46被定位在物鏡42的出口且穿過與偏光濾光器對齊的散射光的波長，且進一步阻擋任何未與偏光濾光器對齊、散射的或未散射的光，。與偏光濾光器46對齊的散射的紅光穿過濾光器。類似地，與偏光濾光器46對齊的散射的綠光穿過濾光器。散射的紅光和綠光的強度相對於偏光角度變化且當金納米棒30的適當的軸線平行於偏振面時具有最大值。當從金納米棒30的長軸散射的光與偏光濾光器46對齊時，那麼紅光被通過。當從金納米棒30的短軸散射的光與偏光濾光器46對齊時，那麼綠光被通過。沒有其他光通過偏光濾光器46,即偏光濾光器46的其他的輸出是暗的。紅光和綠光強度由光學處理設備48收集，這使紅光和綠光分成個別通道。可使用MetaVue軟體來分離、檢測、觀察以及測量紅光和綠光的強度。當閃爍的紅光和綠光通過偏光濾光器46時，觀察到Fl-ATP酶引起的旋轉，這是因為金納米棒30的表面等離子體振子共振。交替閃爍的紅光和綠光已經提供了 Fl-ATP酶10的物理和行為特徵的可觀察的且可量化的表示，就如紅光和綠光的閃爍速率隨Fl-ATP酶10的旋轉速度變化。納米顆粒可以是橢圓形的、棒形的或其他各向異性的形狀。納米顆粒可以由純金屬或合金製備，且可以被塗覆有不同類型的金屬或其他材料如玻璃。納米顆粒可以是如通過電子束光刻被圖案化到金屬化表面上的扁平結構。通過本領域的關於給定分子馬達的標準方法引起分子馬達的運動。例如，Fl-ATP酶的運動通過使用標準技術添加ATP來引起(Noji，H.，Yasuda, R.，Yoshida, M.和Kinosita, K.(1997)Nature386，299-302)。用於本發明的方法中的合適的ATP濃度的範圍在IpM到2mM ;優選在200 μ M到ImM之間。Fl-ATP酶的選擇速度可以通過所使用的ATP濃度得到控制。例如，一些檢測方法能夠比另一些方法檢測更大的旋轉速率，且因而所使用的ATP的特定濃度將部分取決於所採用的檢測技術。本領域的技術人員能夠使用類似的已公開的方案測定如何引起其他已知的分子馬達的運動。本發明的特定方面是被檢測到的唯一運動將源於被連接於檢測探針的分子馬達且此連接依賴於待檢測的小分子代謝物結合於分子的橋連部件內的蛋白，或者此連接只有在待檢測的小 分子代謝物結合於分子的橋連部件內的蛋白時才發生。由於該連接將取決於結合於橋內的蛋白的待檢測的小分子代謝物的存在，這源於待檢測的小分子代謝物和蛋白的特異性結合，所以觀察到此運動將確認存在待檢測的小分子代謝物。通過檢測探針檢測分子馬達的運動可以通過任何合適的方式來實現。在一個實施方案中，使用直接目視運動。在優選的實施方案中，能夠通過顯微鏡目視觀察的元素金屬棒檢測探針被附著於設備的橋連部件。其他觀察工具包括但不限於單分子螢光共振能量轉移、螢光壽命各向異性以及原子力顯微鏡。除了顯微鏡外，其他方法可以用於觀察檢測探針的旋轉，包括但不限於(I)將分子馬達附著到納米電極上並測量因旋轉產生的微電流變化或阻抗變化；(2)將螢光標籤諸如Pacific blueTM(分子探針)附著到分子馬達的不旋轉部分上；以及(3)單分子各向異性測量。在另一個可選擇方案中，旋轉可以通過螢光信號的周期性猝滅由猝滅物檢測探針觀察。在另外的實施方案中，表面等離子共振生物傳感器可以用於測量金屬納米棒旋轉期間的表面等離子共振變化。在最優選的實施方案中，金屬(諸如金)納米棒被用可見光(400-700mm波長範圍)來檢測旋轉，以提供改進的檢測能力(參見，如W02004/053501)。從納米棒散射的光分別被從棒的長軸和短軸散射的更長的波長和更短的波長偏振。當通過偏光濾光器觀察時，散射光的強度取決於棒相對於濾光器方向的角度。觀察從棒的長軸和短軸散射的光以使這些軸平行於濾光器的方向時具有最大值，而垂直於濾光器時具有最小值。例如，如果散射光的長波長和短波長分別是紅色和綠色時，紅光強度將在綠光是最小時是最大的。因而，通過偏光濾光器看到的金屬納米棒的旋轉將顯示出閃爍的紅色和綠色。在此實施方案中，監測納米棒旋轉時紅光和綠光兩者的強度振蕩提供了棒發生旋轉的獨立構象。在另外優選的實施方案中，測量了只有一種波長的光強度的振蕩，這進一步改善了信噪比。在這些實施方案中，可以使用兩種波長的光(如使用分束器或彩色照相機)或僅使用一種波長的光(如使用綠光或紅光偏光器)來進行測量。就數位照相機仍足夠靈敏地測量由旋轉納米棒產生的強度振蕩的幀速率(數據採集的速度)而言，限制了一些數位照相機。單光子計數器可以用於進行振蕩測量。針孔可以起到暗箱的作用且一次僅可以測量一個棒的振蕩；能夠以高得多的信噪比以大得多的幀速率進行。數位相機可以一次採集許多納米棒的振蕩數據，而相機的速度和靈敏度僅需要足以捕捉棒旋轉的速率。優選的振蕩速率是藉助用於進行測量的檢測設備易於測量的速率。在採用元素金屬納米棒的這些實施方案中，暗視場顯微鏡檢查是優選的檢測方法，因為只有從納米棒散射的光被觀察到，這進一步改善了信噪比。在另一個實施方案中，使用亮視場顯微鏡檢查來進行檢測。由於本發明的方法能夠檢測待檢測的小分子代謝物的單個分子，因而他們提供了量化樣品中存在的待檢測的小分子代謝物的量的精確方式。在一個實施方案中，通過目視來確定旋轉分子的數目且計算所看到的全部樣品的份數。用目前與DNA微陣列一起使用的螢光檢測方法是不可能這樣做的。

雖然在具體的實施方案中，錨固部件通過生物素/親和素被連接於相鄰的橋連部件，但其他結合對也可以用於獲得此鏈。其他這樣的結合對實例的非限制性示例包括地谷新配基(DIG)/抗-地谷新配基抗體和其他抗原/抗體對。抗原決定基標籤，諸如組氨酸標籤以及針對抗原決定基標籤(或其片段)的抗體是用於與本發明的方法一起使用的結合對的另外的示例。本領域技術人員將理解本文所列出的某些實施方案是親和性標籤的間接結合且分子馬達或檢測探針也可以用於直接結合的實施方案。C.橋連部件在本發明中，在納米顆粒與Y子單位之間存在由結合於或以其他方式應答於待檢測的代謝物存在的蛋白構成的連接、橋連或偶聯部分。如本文中上面所述的，蛋白可以是轉錄調控蛋白、信號轉導蛋白、DNA證明蛋白或起到結合感興趣的代謝物的蛋白作用的任何其他蛋白。示例性的轉錄調控蛋白包括JNKl (C-jun激酶I ;分裂素激活的蛋白激酶8 ;MAPK8) ;P38激酶(分裂素激活的蛋白激酶 14 ；MAPK14 ；p38MAP KINASE ；p38-ALPHA) ;ATF2、MEF2C以及MAX，細胞循環調控因子CDC25B、腫瘤抑制劑p53 ;基因編碼cdc2、基因編碼Cyclin (Cyclin A、Cyclin D、Cyclin E)、cdc25C、WAFl (野生型 p53 激活的片段 I)、INK4、⑶K (⑶K1XDK2、⑶K4、⑶K6)、Rb蛋白以及E2F。示例性的轉錄阻遏蛋白包括如四環素(tet)阻遏蛋白。如上所述，可以使用的特異性信號轉導蛋白是蛋白激酶A。可以使用的其他蛋白激酶包括Ras、A-Raf、B-Raf和Raf-1以及類似蛋白激酶。D.試劑盒和示例性的實施方案在另一個方面，本發明提供了用於檢測小分子代謝物的試劑盒，包括(a)蛋白，其特異性地結合感興趣的小分子代謝物，其中所述蛋白以不幹擾所述感興趣的小分子代謝物的方式被生物素化；(b)分子馬達，諸如3個子單位或5個子單位的Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有組氨酸標籤以有利於Fl-ATP酶附著於固體載體且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及(c)金納米棒，其被結合於分子，這在所述蛋白被結合於感興趣的小分子代謝物時識別(a)內的所述蛋白。該試劑盒還可包括固體載體和生物素。在優選的實施方案中，試劑盒還包括結合於橋連部件的分子馬達和/或結合於橋連部件的檢測探針。在另一個實施方案中，分子馬達被結合於固體載體，諸如蓋玻片或其他合適的載體。載體可以以用於結合到分子馬達的任何合適的方式得到。本發明還提供了一種組合物，包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中:(a)錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子單位的N端上的組氨酸標籤和Fl-Y子單位上的半胱氨酸，其中多個Fl-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子單位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述橋連部件包括結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在蛋白，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的Fl-Y子單位連接於所述錨固部件；以及(c)所述信號產生部件包括電磁檢測探針，所述電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下，被特異性地結合於所述橋連部件的所述蛋白的部分官能化。
本發明還提供了一種組合物，包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中:(a)錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子單位的N端上的組氨酸標籤和Fl-Y子單位上的半胱氨酸，其中多個Fl-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子單位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述橋連部件包括轉錄調控蛋白，其包括當結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在時，針對特異性DNA序列的結合位點，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的Fl- Y子單位連接於所述錨固部件；以及(C)所述信號產生部件包括電磁檢測探針，當蛋白被結合於待檢測的所述代謝物時，所述電磁檢測探針已經被已知結合所述橋連部件的所述轉錄調控因子的特異性DNA序列官能化。本發明還提供了一種組合物，包括:(a)固體載體；和(b)附著於固體載體的多個分子馬達，其中多個分子馬達被附著於橋連部件，所述橋連部件包括對待檢測的小分子代謝物是特異性的蛋白。在優選的實施方案中，該些多個分子馬達包括超過一種類型的分子馬達。在另一個優選的實施方案中，載體上的不同類型的分子馬達包括橋連部件內的對待檢測的不同的小分子代謝物是特異性的不同的蛋白。在另一個優選的實施方案中，組合物還包括橋連部件內的第一蛋白，所述第一蛋白是轉錄激活蛋白，其通過生物素-親和素-生物素鏈將待檢測的小分子代謝物特異性地結合於分子馬達。在另一個優選的實施方案中，橋連部件內的蛋白是轉錄阻遏蛋白，其被結合於DNA分子，所述DNA分子通過具有親和性標籤諸如生物素-親和素鏈的鏈被結合於金納米棒。基於上面討論的那些原因，這樣的方法具有價值，原因是金納米棒優選用於檢測測定中，諸如本發明中描述的那些。F.實施例實施例1:在本發明的一個實施方案中，第一親和性標籤生物素被附著於將形成本發明的設備的橋連部件的一部分的蛋白上的半胱氨酸殘基。此生物素化的蛋白經由親和性標籤被用作分子馬達與用於檢測由馬達產生的運動的檢測探針之間的橋。橋連部件的生物素化的蛋白被附著於分子馬達的移動部件。當待檢測的靶向小分子代謝物存在時，橋連部件被連接於檢測部分，原因是橋連部件內的蛋白的構象被改變，使得檢測探針上存在的部分能夠結合於納米檢測設備的橋連部件。在具體的實施例中，檢測探針包括能夠通過顯微鏡被看到的金納米棒，附著於橋連部件內所結合或識別到蛋白的部分通過生物素親和素鏈被結合於納米棒。特定的金棒具有尺寸且被照射成有規律地改變顏色，從紅色到綠色(或黑色，如果僅僅是紅色)並變回，這典型地表明棒的旋轉。在Fl-ATP酶、橋連部件的組裝和納米棒檢測部分的製備後，Fl-ATP酶被固定到固體基材上諸如顯微鏡載玻片。此固定通過納米旋轉的Fl馬達結構組氨酸結合於鎳表面來實現。通過添加ATP引起分子馬達運動。將會被檢測到的唯一運動將源於被連接於所附著的檢測探針的馬達。由於該連接將取決於結合於橋內的蛋白的待檢測的靶向小分子代謝物的存在且因為在待檢測的靶向小分子代謝物被結合於橋連部件內的蛋白時才可以僅僅導致納米棒珠上的部分結合於橋連部件內的蛋白，因而觀察到此運動將確認樣品內存在待檢測的靶向小分子代謝物。實施例2:分別製備納米檢測設備的四個部件:(I)由針對待檢測的靶向小分子代謝物的特異性蛋白製造的蛋白橋；⑵修飾過的Fl-ATP酶；(3)鎳塗覆的蓋玻片；以及(4)塗覆的納米棒。在製備這些部件後，通過添加待檢測的靶向小分子代謝物將它們組裝成設備。只有當待檢測的靶向小分子代謝物存在而實現設備的組裝時才能觀察到附著於設備的納米棒旋轉。將被用作橋連蛋白的蛋白將被基因修飾以在將會是最佳地用於經由生物素-親和素-生物素鏈附著於分子馬達的位置中引入半胱氨酸。半胱氨酸的位置將被選擇成對橋連蛋白是特異性的以確保不改變橋連蛋白的官能特徵，且確保半胱氨酸並不會干擾用於附著可見的探針的DNA識別/結合位點的形成。橋連蛋白也可以被基因修飾以改變其對靶分子的特異性。在一個實施例中，可以對樹膠醛糖激活蛋白進行突變以增強其對葡萄糖而不是樹膠醛糖的親和性。在另一個實施方案中，DNA識別/結合位點可以通過蛋白的基因修飾而被改變，使得橋 連部件識別不同的DNA序列以完成納米設備的組裝。修飾過的Fl-ATP酶。從大腸桿菌菌株AB004中分離出的Fl-ATP酶包含全部5個子單位且具有化學計量α3β3γ δ ε。這些蛋白的序列對應於基因銀行登錄號:α，ΑΑΑ24735 ； β，ΑΑΑ24737 ； y，AAA24736 ； δ，ΑΑΑ24734 ;以及 ε，ΑΑΑ24738，且具有下面的變化。進行突變以用丙氨酸替代α、β、Υ、δ和ε子單位中的所有現有的半胱氨酸。α子單位被突變以用6個組氨酸延長N端。Y子單位被突變以用半胱氨酸替代賴氨酸-109，這起到使用生物素馬來醯亞胺進行生物素化的位點的作用。以3倍摩爾過量的EZLINKTM PEO馬來醯亞胺激活生物素(Pierce Endogen ;產品#21901)在室溫下溫育I小時且輕微搖動來進行生物素化。通過尺寸排阻凝膠過濾去除未結合的生物素。在此位點共價結合的生物素起到親和素的有效結合位點的作用，可以附著於此位點的其他生物素化的部分包括類似代謝物激活蛋白的橋連部件。y子單位的α、β域上的或ε子單位上的此半胱氨酸的替代可以被改變至並不幹擾ATP酶的活性和/或旋轉的任何暴露的位置。酶的這三個子單位α3β3γ子複合物也可以起到Fl-ATP酶的作用，正如5個子單位Fl-ATP酶能夠起到的作用，其中通過突變用丙氨酸替代6個子單位的半胱氨酸。由任何生物源純化而來的3個子單位或5個子單位Fl-ATP酶將滿足此任務的需要，只要進行組氨酸-標籤和半胱氨酸修飾。用於將Fl附著於蓋玻片的此組氨酸標籤可以可選擇地(或另外)在α子單位和/或β子單位上，只要其不幹擾ATP酶的活性。來自嗜熱菌PS3的Fl-ATP酶的α 3 β 3 Y子複合物也成功地用於類似的實驗中，α3β3γ子複合物包含β子單位上的IOX組氨酸標籤和有利於生物素化和DNA附著的位置內的半胱氨酸。也可以使用F1，如來自衣藻屬或菠菜葉綠體的Fl進行類似的工作構建。將生物素化的Fl添加到500 μ I的洗滌過的鎳-次氮基三乙酸(N1-NTA)親和樹脂(Sigma-Aldrich產品#Ρ6611)中，並在室溫下輕微地攪拌30分鐘以使6 X組氨酸標籤的Fl結合於N1-NTA樹脂。將結合有Fl的N1-NTA樹脂被裝載到注射器-柱中且用Iml的洗滌緩衝液衝洗柱。以lmg/ml的濃度且相對於初始Fl濃度約8到10倍的摩爾比溶解在洗滌緩衝液中的中性親和素(分子探針產品#A2666)被通過N1-NTA樹脂以允許中性親和素結合於生物素部分。在中性親和素處理後，用5ml的洗滌緩衝液衝洗N1-NTA樹脂以去除未結合的中性親和素，然後用Iml的洗脫緩衝液從柱釋放並收集生物素化且親和素化的Fl。以這種方式將親和素結合於Fl允許使用大量過量的親和素並確保所有Fl結合親和素。保持沒有親和素的任何Fl將降低檢測靈敏度。如果在Fl結合於蓋玻片後向Fl添加親和素，那麼這允許橋接部分的生物素化的蛋白直接結合於不存在Fl的蓋玻片。這樣的結合蛋白將結合納米棒，但將不能夠旋轉，且因而降低靈敏度且被計算為增加的背景。在Fl的生物素化和凝膠過濾步驟後，Fl的回收通常是起始量的5%。在生物素化的Fl結合於N1-NTA樹脂、親和素化、和從N1-NTA樹脂洗脫後，回收了起始Fl的約75%。生物素化且親和素化的Fl的ATP酶活性是起始活性的約90%。用於製備N1-NTA蓋玻片的過程。按照Kastner等人的程序(2003, BiophysicalJournal84:1651-1659)來制 備N1-NTA蓋玻片。在500°C下烘焙2小時來預清潔蓋玻璃(22X 22mm，VWR)。依次地，在90°C下的密封溶液(2% (V/V) 3-縮水甘油基氧基丙基-三甲氧基矽烷(Fluka，Buchs, Switzerland),0.01 % (V/V)乙酸)中溫育玻璃 3 小時；在 60°C下的塗覆溶液(2% (V/V)N, N 雙(羧甲基)-L-賴氨酸(Fluka, Buchs, Switzerland)、2mMKHCO3, ρΗΙΟ.0)中溫育16小時；以及在室溫下的Ni2+溶液(IOmMNiSO4, 5mM甘氨酸，pH8.0)中溫育至少2小時。每一次塗覆步驟後，用超純水洗滌玻璃。合成金納米棒並用親和素塗覆它們的方案。影響金納米顆粒的形狀和尺寸的因素包括鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB)濃度、Au晶種濃度、銀(AgNO3)的存在、NaOH、抗壞血酸濃度以及所有這些因素的合適組合。增加金納米棒相對於其他形狀的百分數的技術具有價值，原因是金納米棒優選地用於檢測測定，諸如本文描述的那些。在合成金納米棒的典型實驗中，CTAB塗覆的晶種溶液通過向IOml體積的CTAB(IOOmM)中添加25 μ I的Au溶液(50mM)，然後添加55 μ I的NaBH4 (30mM，冰冷卻的)且劇烈渦旋約2分鐘來製備。此晶種溶液可以立即被使用，但將保持活性至少一天。為了生長金納米棒，向IOml CTAB(IOOmM)中添加100 μ I的Au溶液(50mM)，然後添加AgNO3 (10mM，50-125 μ I)且輕微搖動。接著，添加85 μ I的抗壞血酸(IOOmM)且立即搖動，使溶液成為無色的。最後，添加24μ I的所製備的晶種溶液且輕微搖動。10-20分鐘內顯示出紫色與藍色的混合物。在高溫(55-100°C )下生長金納米棒導致溶液中更多的深藍色。在此方法中，晶種濃度對於增加納米棒的百分數來說是最重要的參數。
金親和素化的程序:使用1.5ml的金棒製備；此以4000rpm被離心10分鐘；棄去上清液且將小球重新懸浮在Iml的ImM CTAB中。以6000rpm將此混合物離心5分鐘，棄去上清液且小球再次重新懸浮在0.5ml的ImM CTAB中。採集吸光光譜且用ImM CTAB稀釋樣品，使得棒的吸光度峰值(A650)是約2.0。添加中性親和素至40μ g/ml的最終濃度；以及在室溫下溫育混合物且輕輕攪拌I小時。這產生能夠被存儲在室溫下或4°C下的親和素化的棒。各部分組裝成官能化的設備。將三羥甲基氨基甲烷緩衝液(50mM三羥甲基氨基甲烷，IOmM KCl，ρΗ8.0)中的5 μ I的親和素化的Fl (80g/ml)點樣到N1-NTA蓋玻片且溫育5分鐘。接著用三羥甲基氨基甲烷緩衝液洗滌蓋玻片30秒。接下來的步驟包括向蓋玻片添加4μ I的生物素化的蛋白橋且溫育5分鐘。然後用三羥甲基氨基甲烷緩衝液洗滌組件30秒。接著在將結合於組件的橋連部件的蛋白的小分子的存在下，用4μ I的親和素塗覆的金棒溫育組件。溫育混合物5分鐘並用三羥甲基氨基甲烷緩衝液洗滌30秒。為了在顯微鏡下觀察到旋轉，添加4μ I的三羥甲基氨基甲烷緩衝液。此緩衝液還將包含ImM的Mg2+-ATP以引起旋轉。

添加到蓋玻片的每一個部分的體積可以按照期望基於測定格式來改變。雖然此實施例顯示了添加ImM的Mg2+-ATP來引起旋轉，但只要添加0.4mM的Mg2+-ATP已顯示旋轉。在這些較低的ATP濃度下，旋轉速率較慢且因而記錄旋轉所需的幀速率並不需要太快。使用來自嗜熱菌PS3的Fl的三個子單位複合物，可以在低至2pM的ATP濃度下觀察到旋轉。下面描述了使用與生物素和DIG橋連的蛋白組裝設備使得DIG將結合於抗DIG塗覆的納米棒的可選擇的方案。此實驗還使用與上面描述的Fl不相同的F1，原因在於該Fl包含用於生物素化的YY215C的額外突變，使得親和素可以產生附著於Fl的兩個點。此實驗不同於上面描述的實驗，原因在於該實驗採用了流動池。因此，可以在添加ATP之前拍攝已組裝的設備的視頻，然後又在ATP添加之後引起旋轉後拍攝視頻。45 μ I的具有α3β3γ δ ε的組成的子單位且包括突變UK109C、YL215C)的
0.5nM Fl與8 μ I的蛋白混合以便形成橋。在室溫下溫育該混合物30分鐘。然後向樣品中添加相同體積的BSA(20mg/ml)。通過使用雙面透明膠帶將N1-NTA蓋玻片附著於載玻片來製備顯微鏡流動池。每一個流動池被填充有25 μ I的樣品且在室溫下溫育5分鐘。用300 μ I的含有10mg/mlBSA的洗滌緩衝液(50mM三羥甲基氨基甲烷，IOmM KCl，pH8)洗滌流動池。添加25 μ I的抗DIG塗覆的金納米棒並在室溫下溫育5分鐘，然後用洗滌緩衝液進行5X200 μ I的洗滌。在使流動池置於顯微鏡下之前，向流動池中添加100 μ I的旋轉緩衝液(50mM三羥甲基氨基甲烷，IOmMKCl，pH8、0.2mM ATP,0.2mM MgCl2,29.lmg/ml 的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1.25mg/ml的丙酮酸激酶(PK)、1.25mg/ml的乳酸脫氫酶(LDH)、4mg/ml的還原性煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH))。PEP、PK、LDH和NADH用於從ADP和磷酸鹽再生ATP以便在整個測量中保持濃度恆定。藉助或不藉助分束器以500幀每秒拍攝視頻。分束器允許測量視頻的每一幀內來自納米棒的紅色和綠色散射光兩者的強度振蕩。在不存在分束器時，紅光濾光器僅用於測量紅光振蕩。下面描述了振蕩分析。從納米棒散射的光強度的振蕩分析以確定納米棒是否旋轉。一步檢測程序。由完全組裝的納米檢測設備和溶液中存在的ATP製備載玻片。為了能夠區分布朗運動與實際的旋轉，優選以足夠快到能夠分開兩種變化源的速率收集數據。在優選的實施方案中，這通過使用單光子計數器來測量變化而實現，這允許實時可視化旋轉。多步程序。可以檢測旋轉的另一種方式是使用流動池和高速視頻照相機。這要求拍攝至少兩個視頻，但是優選三個。至少拍攝存在和不存在ATP時棒的視頻。在偏光透鏡旋轉時拍攝棒的視頻是有幫助的。這測定了如果該棒旋轉時，待預期的強度振蕩的深度。此對照增強了測定Fl依賴性旋轉的信心，然而這也可以無需額外的測量來證實。軟體:為實現同一目的而開發出的兩種不同的軟體是棒因Fl或不因Fl而旋轉。所收集的數據總是隨時間變化的強度。第一種方法包括分析來自高速照相機的數據的趨勢。軟體讀取數據，優選來自三個實驗:沒有ATP、沒有ATP同時旋轉偏光鏡以及有ATP。旋轉期間預期的動態範圍由偏光鏡控制來計算且可以用於確保正在檢測的分子實際上是金棒。接著，動態範圍與有和沒有ATP時的測量結果的標準差進行比較。如果有ATP的視頻不同於沒有ATP的視頻，且在整個所計算的全動態範圍內波動，那麼分子正在旋轉。軟體程序能夠對給定視域內的所有棒做這些。軟體是確定旋轉的優選方式，但是也可以手動收集和解釋信息來做出最終的確定。任一種方式來說，標準是相同的。可以由本領域技術人員使用標準技術來執行軟體。軟體具體地回答了視域內存在的所有棒是否在發生旋轉。為光子計數系統而開發的軟體計算了信號處理中常用的數值統計測量，包括周期、頻率、躍遷率、工作周期、超調、下超調、停留時間、傅立葉變換以及能譜。唯一需要的統計是能譜，儘管通常計算傅立葉變換來得到能譜。可以從能譜確定是否發生與布朗運動不同的旋轉。來自運動的額外分析的其他統計是有用的，但不需以之確定是否發生Fl依賴性旋轉。可以由本領域技術人員使用標準技術來執行軟體。實施例3:在本發明的一些實施方案中，納米檢測設備用於檢測蛋白靶。在一個實施例中，由大腸桿菌0157:H7菌株產生的Stx2Shiga毒素被用作蛋白祀。產生Shiga毒素的大腸桿菌(STEC)菌株產生稱為Stxl和STx2Shiga毒素的細胞毒素，其具有A，B5的子單位組成。為了檢測Stx2毒素，抗-Stx2A和抗-Stx2B單克隆抗體在檢測設備中被分別用作檢測和捕獲抗體。對蛋白檢測來說，生物素化的蛋白G被結合到附著於載玻片上的F1馬達的親和素。蛋白G將抗-Stx2B(「捕獲」)抗體結合併固定在載玻片的表面上。金納米棒被塗覆有未生物素化的蛋白G，「檢測」抗體，即抗-Stx2A被結合於該蛋白G。檢測和捕獲抗體對靶向蛋白(Stx2毒素)的不同域是特異性的。此納米設備可以檢測含有產生Stx2的大腸桿菌菌株(EDL933)的細胞上清液中的Stx2毒素(圖3A和3C)，與產生大腸桿菌非毒素的菌株(MG1655)進行比較(圖3B和3D)，正如通過測定30個連續視域內觀察到的納米棒的數目。圖3C和3D是對照；在圖3C中，捕獲抗體被省略且在圖3D中，Stx2毒素被省略。納米設備可以檢測唾液樣品中的Stx2毒素蛋白，與含有產毒素菌株(EDL933)或非毒素菌株(MG1655)的純化毒素進行比較，正如通過30個連續視域內觀察到的納米棒的數目所測量的，正如圖4顯示的。 圖5顯示了用於以每ml產毒素菌株的細胞形成單元(B卩，細菌細胞的數目)呈現的粗細胞上清液中的Stx2蛋白毒素的檢測限值。以納米設備組件的10個連續視域(藍色柱)對10個連續視域(紅色柱)或30個連續視域(綠色柱)內的旋轉納米棒的數目測量了檢測。通過對組裝的納米設備相對於10個連續視域內的非特異性結合的納米棒的數目進行計數獲得了 108cfu/ml的檢測限值。通過對同樣數目的視域內的旋轉納米棒的數目進行計數提高了檢測限值1000倍，且通過測量30個連續視域內的旋轉將檢測限值提高100，100倍至103cfu/ml。圖6顯示了使用純化的Stx2靶向蛋白的系統的基於旋轉的檢測限值。數據以隨樣品內存在的靶分子的數目(圖6A)或靶向濃度(圖6B)的變化表達。使用2μ I的樣品體積且僅計數10個視域，可以在IOfgmr1溶液中檢測到少至1000個靶分子。
實施例4:在本發明的一些實施方案中，納米檢測設備用於檢測樣品內的超過一個靶。在一些實施方案中，在一個樣品內可以檢測到多個靶，如蛋白靶和DNA靶。這可以通過使用不同顏色的納米棒而發生，如綠色、紅色或黃色，以對應於不同的靶分子。圖7描繪了用於確認和量化視域的數碼照片內的紅色、綠色、藍色和黃色納米棒的數目的算法中使用的標準的概述。這些包括給定範圍的紅色、綠色和藍色值內的相鄰像素的數目以及量化在具有給定顏色的納米棒的預期值的給定範圍內的同一顏色範圍內的相鄰像素的圓度和直徑的量度。具有足夠圓形的且具有對應於它們的直徑的紅色、綠色、藍色(RGB)值的共同範圍的唯一的連續像素的組被計數為特定顏色的納米棒，因而來自納米尺度的灰塵的光被去除。圖8描繪了用於Stx2毒素蛋白(紅色納米棒)和stx2基因DNA序列(綠色納米棒)的在單孔內多像素檢測的納米設備的部分。每一個孔內的載玻片表面包含被按照兩種方式中的一種所修飾的Fl。Fl分子的一列包含用於DNA檢測的暴露的親和素而Fl的第二疊加的列包含用於Stx2蛋白(抗-Stx2B抗體)的暴露的捕獲抗體。來自大腸桿菌0157:H7的上清液的樣品在孔內溫育，然後添加包含納米棒的溶液。紅色納米棒被用蛋白G和抗-Stx2A抗體官能化且綠色納米棒被用蛋白G和抗-FITC單克隆檢測抗體官能化。當stx2基因革巴存在時，其被轉化成用於納米設備組裝的3』生物素化，5』FITC-標籤的DNA。圖9描繪了以3次重複的平均值計的針對Stx2毒素和stxl基因的同時多像素檢測蛋白和DNA的結果。數據顯示出當在同一孔內同時探測時，特異性的蛋白和DNA靶可以被檢測且彼此區分。實施例5:在本發明的一些實施方案中，納米檢測設備用於包括作為致動子的轉錄激活蛋白的代謝物檢測。一個實施方案是可以檢測單個環腺苷酸(cAMP)分子的設備。cAMP已知為第二信使，因為其合成通過多種信號分子經由腺苷酸環化酶刺激和抑制G-蛋白-偶聯受體的激活和抑制來調控。結合於cAMP以形成活性構象的細菌蛋白，分解代謝產物激活蛋白(CAP)，將被用在納米設備中。乳糖操縱子的正性調控將涉及結合於cAMP的CAP結合於DNA。此細菌分解代謝產物激活蛋白(CAP)，優選大腸桿菌CAP將被修飾以在將允許由Fl-ATP酶馬達經由親和素的結合進行組裝的位置包含可開裂的組氨酸標籤(基於純化目的)和半胱氨酸(用於由生物素馬來醯亞胺進行生物素化)。半胱氨酸可以被添加到，如，但不限於大腸桿菌CAP的N端或殘基-109。含有能夠結合於CAP的激活構象的序列的DNA分子將被生物素化以便附著於親和素塗覆的金納米棒。納米設備包括Fl分子馬達、改變的CAP以及由DNA受體序列官能化的金納米棒，正如圖10描繪的。檢測激活納米設備的組裝的靶向CAMP將經由暗視場顯微鏡檢查從納米棒散射的光來完成。cAMP結合於CAP可以引起產生針對DNA受體序列的高親和性結合位點的構象變化。顯微鏡載玻片將被製備以包含結合的生物素化的Fl的陣列，生物素化的CAP將經由生物素-親和素鏈被固定至該生物素化的F1。靶向cAMP分子高親和性地結合於固定在載玻片上的F1分子的旋臂上的CAP (圖10A)將激活蛋白以產生針對其受體DNA序列的高親和性結合位點(圖10B)。納米設備的組裝隨後通過添加被具有特異性地結合於激活的CAP-cAMP複合物的序列的DNA分子的塗層官能化的金納米棒來完成(圖10C)。檢測激活納米設備的組裝的靶向cAMP將經由暗視場顯微鏡檢查從納米棒散射的光來完成，正如本文描述的。實施例6:在本發明的一些實施方案中，使用轉錄阻遏蛋白來完成代謝物檢測。在一個實施方案中，使用NADH阻遏蛋白(NRP)來製備檢測單個NADH分子的納米尺度的檢測設備。還原性煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是細胞能量通貨的主要形式。在磷酸化作用期間，線粒體氧化NADH以產生ATP，細胞NADH的水平可以提供對細胞能量儲備的了解。NRP充分表徵了轉錄阻遏蛋白。NRP將由包含具有可開裂的組氨酸標籤的NRP (以提供可以使用鎳珠純化的形式)的質粒表達。NRP序列也將被改變以包括不會干擾NRP功能，但可以經由生物素馬來醯亞胺被生物素化的半胱氨酸。NRP將經由親和素被固定在F1分子馬達的旋臂上。被親和素官能化的納米棒將被塗覆有對NRP結合位點是特異性的生物素化的DNA序列。由於在純化期間，用NRP結合NADH純化，此二核苷酸將通過酸性硫酸銨沉澱物被去除。接著，在NAD+的存在下除去硫酸銨允許被NAD+結合的NRP 二聚作用。為了檢測NADH，含有結合的NAD+的生物素化的NRP將被添加到已經被固定在顯微鏡載玻片上的親和素化的Fl-ATP酶中(圖12A-B)，且組裝將通過添加由對NRP是特異性的DNA官能化的金納米棒來完成(圖12C)。當靶結合造成誘導DNA離解的構象變化時，通過結合於顯微鏡載玻片的納米棒的數目的減少來進行NADH的檢測。因為NAD+或NADH總是結合於NRP，所以檢測系統能夠確定兩者的比。NRP也可以被用在NAD+檢測系統中。在這些條件下，載玻片將提前被製備有NADH，使得DNA官能化的納米棒將不被結合。不束縛於任何理論，我們期望NRP將表現得像轉錄激活蛋白以能夠在添 加NAD+時由DNA塗覆的納米棒進行組裝。實施例7:本發明的一些實施方案提供了納米設備的有序陣列用於含有轉錄調控蛋白的代謝物檢測。在阻遏蛋白依賴性納米設備的一些實施方案中，NADH由納米設備的拆解來檢測，正如圖13所描繪的。因而，所釋放的納米棒的數目將被更容易確認為幹擾網格持續性的遺漏的光斑。在其他實施方案中，有序的陣列可以被用於檢測cAMP檢測用的使用激活因子依賴性納米設備的系統。有序陣列將由顯微鏡載玻片的表面上的暴露的N1-NTA島的陣列來製造，每一個陣列能夠結合單個Fl分子。製造工藝可以是如電子束光刻，正如圖14所描繪的。首先，用IOOmM EDTA衝洗乾淨的N1-NTA塗覆的顯微鏡載玻片以去除鎳且徹底洗滌。矽醇-NTA保持嵌入在玻璃表面上。然後用聚_(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)抗蝕單層( 40nm)旋塗表面。使用預設計的圖案將PMMS抗蝕層隨後暴露於電子束。在隨後的O2等離子處理後，將增加硫酸鎳，這將會結合於通過電子束暴露的島NTA。O2等離子處理步驟清潔表面以有利於鎳牢固的粘合。最後，將用丙酮洗滌表面以去除PMMA。這樣，載玻片的表面將包括組氨酸標籤的Fl將會結合的鎳島的有序陣列。鎳島之間的間距隔開得足夠遠以防止一個金納米棒橋接在相鄰島上的兩個Fl分子之間，如約300nm。還提供足夠的距離，使得任一個納米棒的旋轉不會受到相鄰島上的納米棒的旋轉所影響。 有序的陣列優選地使每一個N1-NTA島具有一個Fl分子。鎳島可以具有適於提供用於至少一個Fl分子結合的鹼 基的直徑。
權利要求
1.一種用於檢測至少一種靶向小分子代謝物的方法，包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中: (a)所述錨固部件包括分子馬達，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子； (b)所述橋連部件包括至少一個生物組分或合成組分，所述至少一個生物組分或合成組分結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在，其中所述橋連部件通過共價的或高親和性結合的相互作用被連接於所述錨固部件； (c)信號產生部件，所述信號產生部件包括至少一個電磁檢測探針，所述至少一個電磁檢測探針已經被在待檢測的所述代謝物的存在下特異性地結合於所述橋連部件或與所述橋連部件分離的部分官能化。
2.—種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括: (a)使多個分子馬達中的每一個結合於選定的橋連部件，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子，且所述橋連部件是結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件； (b)在由所述橋連部件組裝所述分子馬達後，將所述多個分子馬達錨固到固體載體； (C)將對所述橋連部件是特異性的電磁檢測探針結合於固定的橋連設備，其中所述橋連部件在不存在靶向代謝物下具有對所述探針的高親和性；且其中靶向代謝物結合於所述橋連部件導致探針對所述橋連部件的親和性減弱； (d)應用疑似含有對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品； (e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及 (f)通過顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，其中由探針的電磁特性的變化標示的在存在的所述樣品內存在平移或旋轉運動表示所述樣品內缺乏靶向代謝物，而由探針的電磁特性缺乏變化標示的在存在的所述樣品內不存在平移或旋轉運動表示所述樣品內存在靶向代謝物。
3.—種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括: (a)使多個分子馬達中的每一個結合於選定的橋連部件；其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子，且所述橋連部件是結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件； (b)在由所述橋連部件組裝所述分子馬達後，將所述多個分子馬達錨固到固體載體； (C)在不存在所述電磁探針下應用疑似含有對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品； (d)結合對所述橋連部件是特異性的電磁探針，其中所述橋連部件在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物被結合於所述橋連部件時具有對所述探針的高親和性； (e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及 (f)通過監測所述探針的電磁特性的變化由顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動， 其中由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的增強標示的所述探針對所述橋連部件的增強的親和性表明所述樣品內存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物，而由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的減弱標示的所述探針對所述橋連部件的減弱的親和性表明所述樣品內不存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物。
4.一種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括: (a)使多個分子馬達中的每一個結合於固體載體，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子； (b)使多個分子馬達中的每一個連接至橋連部件，所述橋連部件包括結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件； (c)將對所述橋連部件是特異性的電磁檢測探針結合於固定的橋連設備，其中所述橋連部件在不存在靶向代謝物下具有對所述探針的高親和性；且其中靶向代謝物結合於所述橋連部件導致所述探針對所述橋連部件的親和性減弱 (d)應用疑似含有對所述橋連部分是特異性的所述靶分子或靶向代謝物的樣品； (e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及 (f)通過顯微鏡檢測偶聯於所述 固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動，其中由探針的電磁特性的變化標示的在存在的所述樣品內存在平移或旋轉運動表示所述樣品內缺乏靶向代謝物，而由探針的電磁特性缺乏變化標示的在存在的所述樣品內不存在平移或旋轉運動表示所述樣品內存在靶向代謝物。
5.—種納米檢測樣品中的靶分子的方法，包括: (a)使多個分子馬達中的每一個結合於固體載體，其中所述分子馬達是能夠被引起能夠被檢測到的平移或旋轉運動的生物分子或合成分子； (b)使多個分子馬達中的每一個連接至橋連部件，所述橋連部件包括結合或以其他方式應答於待檢測的小代謝物的存在的至少一個生物部件或合成部件； (c)在不存在所述電磁探針下應用疑似含有對所述橋連部件是特異性的所述靶向代謝物的樣品； (d)結合對所述橋連部件是特異性的電磁探針，其中所述橋連部件在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物被結合於所述橋連部件時具有對所述探針的高親和性； (e)引起偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動；以及 (f)通過監測所述探針的電磁特性的變化由顯微鏡檢測偶聯於所述固體載體的所述至少一個分子馬達的平移或旋轉運動， 其中由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的增強標示的所述探針對所述橋連部件的增強的親和性表明所述樣品內存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物，而由所述樣品內存在的平移或旋轉運動的減弱標示的所述探針對所述橋連部件的減弱的親和性表明所述樣品內不存在對所述橋連部件是特異性的靶向代謝物。
6.如權利要求2到5中任一項所述的方法，其中在步驟(d)之前、之後或與步驟(d)同時執行步驟(C)。
7.如權利要求2到6中任一項所述的方法，其中所述橋連部分是轉錄調控蛋白，所述轉錄調控蛋白包括針對特異性DNA序列的結合位點和針對該小分子代謝物的結合位點且所述信號產生部件包括已知結合所述轉錄調控因子的特異性DNA序列。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述轉錄調控蛋白是轉錄激活蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄激活蛋白時出現所述設備的組裝，這僅發生在所述小分子代謝物結合於所述轉錄調控蛋白的存在下。
9.如權利要求7所述的的方法，其中所述轉錄調控蛋白是轉錄阻遏蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄阻遏蛋白時出現所述設備的組裝且所述電磁檢測探針在所述小分子代謝物的存在下與所述蛋白分離。
10.如權利要求2到6中任一項所述的方法，其中所述橋連部件是信號轉導蛋白，所述信號轉導蛋白包括針對該小分子代謝物的結合位點，其中所述信號轉導蛋白在結合於所述小分子代謝物時改變構象，且所述信號產生部件包括檢測所述信號轉導蛋白的所激活的構象的抗體。
11.如權利要求2到6中任一項所述的方法，其中所述橋連部件是DNA證明蛋白，所述DNA證明蛋白識別DNA序列中的修飾鹼基，且所述信號產生部件包括對待檢測的DNA序列是互補的DNA序列，其中當待檢測的所述DNA與固定於所述電磁檢測探針的所述DNA序列進行DNA鹼基配對時發生所述設備的組裝。
12.如權利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述電磁指示器包括至少一個光顆粒、磁顆粒和熱顆粒。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述電磁指示器包括包含至少一個螢光珠和光散射顆粒的光指示器。
14.如權利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述電磁指示器是來自所述元素金屬組的膠態顆粒。
15.一種納米檢測設備，其包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件，其中: (a)錨固部件包括經由定點突變修飾的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子單位的N端上的組氨酸標籤和Fl- Y子單位上的半胱氨酸，其中多個Fl-ATP酶分子被固定至顯微鏡載玻片的表面，使得每一個Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子單位遠離所述顯微鏡載玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子單位上的所述半胱氨酸被生物素化； (b)所述橋連部件包括結合至或以其他方式應答於待檢測的小分子代謝物的存在的蛋白，其中所述橋連部件內的所述蛋白被生物素化並通過生物素-親和素-生物素鏈由所述錨固部件的生物素化的Fl-Y子單位連接於所述錨固部件；以及 (c)所述信號產生部件包括電磁檢測探針，所述電磁檢測探針已經在待檢測的所述代謝物的存在下，被特異性地結合於所述橋連部件的所述蛋白的部分官能化。
16.如權利要求15所述的納米檢測設備，其中所述橋連部件內的所述蛋白是轉錄調控蛋白，所述轉錄調控蛋白包括針對特異性DNA序列的結合位點和針對該小分子代謝物的結合位點且所述信號產生部件包括已知結合所述轉錄調控因子的特異性DNA序列。
17.如權利要求16所述的納米檢測設備，其中所述轉錄調控蛋白是轉錄激活蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄激活蛋白時出現所述設備的組裝僅發生在所述小分子代謝物結合於所述轉錄調控蛋白的存在下。
18.如權利要求16所述的納米檢測設備，其中所述轉錄調控蛋白是轉錄阻遏蛋白，其中當所述特異性DNA序列結合於所述轉錄阻遏蛋白時出現所述設備的組裝且所述電磁檢測探針在所述小分子代謝物的存在下與所述蛋白分離。
19.如權利要求15所述的納米檢測設備，其中所述橋連部件內的所述蛋白是信號轉導蛋白，所述信號轉導蛋白包括針對該小分子代謝物的結合位點，其中所述信號轉導蛋白在結合於所述小分子代謝物時改變構象，且所述信號產生部件包括檢測所述信號轉導蛋白的所激活的構象的抗體。
20.如權利要求15所述的納米檢測設備，其中所述橋連部件內的所述蛋白是DNA證明蛋白，所述DNA證明蛋白識別DNA序列中的修飾鹼基，且所述信號產生部件包括對待檢測的DNA序列是互補的DNA序列，其中當待檢測的所述DNA與固定於所述電磁檢測探針的所述DNA序列進行DNA鹼基配對時發生所述設備的組裝。
21.如權利要求15-20中任一項所述的納米檢測設備，其中所述電磁指示器包括至少一個光顆粒、磁顆粒和熱顆粒。
22.如權利要求21所述的納米檢測設備，其中所述電磁指示器包括包含至少一個螢光珠和光散射顆粒的光指示器。
23.如權利要求15-20中任一項所述的納米檢測設備，其中所述電磁指示器是來自所述元素金屬組的膠態顆粒。
24.一種用於檢測分子是否結合了轉錄調控蛋白的激活因子的方法，包括: (a)製備根據權利要求15所述的納米檢測設備； (b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸； (c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl-Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP；以及 (d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的增強表明所述代謝物結合於所述轉錄調控蛋白。
25.一種用於檢測結合阻遏蛋白的分子的方法，包括: (a)製備根據權利要求18所述的納米檢測設備； (b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸； (c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl-Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP；以及 (d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的減弱表明所述代謝物結合於所述阻遏蛋白。
26.一種用於檢測分子結合於信號轉導蛋白的方法，包括: (a)製備根據權利要求19所述的納米檢測設備； (b)使所述設備與靶向小分子代謝物接觸； (c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl-Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP；以及 (d)比較在靶向代謝物存在下由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁檢測探針產生的信號，與在所述靶向代謝物不存在下由所述探針產生的所述信號，其中在所述代謝物存在下，所述信號的增強表明所述代謝物結合於所述信號轉導蛋白。
27.一種證明DNA的方法，包括: (a)製備根據權利要求20所述的納米檢測設備； (b)使所述設備與待證明的DNA序列接觸； (c)在允許Fl-ATP酶的活性旋轉所述Fl-Y子單位的條件下，向所述設備中添加ATP；以及 (d)通過在待證明的DNA存在下，測定由結合於所述顯微鏡載玻片的旋轉的電磁探針產生的信號來測定待證明的DNA序列中存在修飾DNA，其中當與固定於所述電磁檢測探針的DNA序列進行DNA鹼基配對時產生信號。
28.如權利要求24、25、26或27所述的方法，其中步驟(d)包括使用暗視場顯微鏡的可視檢測來檢測所述信號。
29.如權利要求24、25、26或27所述的方法，其中步驟(d)包括測定來自檢測探針的一個或多個波長下的光的強度振蕩。
30.一種試劑盒，包括: (a)蛋白，其特異性地結合感興趣的小分子代謝物，其中所述蛋白以不幹擾所述感興趣的小分子代謝物的方式被生物素化； (b)Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有組氨酸標籤以有利於Fl-ATP酶附著於固體載體且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及 (c)金納米棒，其被結合於分子，這在所述蛋白被結合於感興趣的小分子代謝物時識別(a)內的所述蛋白。
31.如權利要求30所述的試劑盒，還包括固體載體。
32.如權利要求30所述 的試劑盒，還包括親和素。
全文摘要
本發明提供了用於高度靈敏地檢測感興趣的代謝物的方法和組合物，其包括使用包括錨固部件、橋連部件以及信號產生部件的納米檢測設備，其中錨固部件是分子馬達，信號產生部件是納米棒且橋連部件是特異性地結合於感興趣的代謝物的蛋白。
文檔編號C12M1/34GK103221530SQ201180043168
公開日2013年7月24日 申請日期2011年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者韋恩·弗拉施 申請人:作為亞利桑那州的一個法人團體並且代表亞利桑那州大學行事的亞利桑那州大學董事會