用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片及其製備方法
2023-09-19 20:02:10 3
專利名稱：用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物晶片技術領域，尤其是涉及一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生
物晶片及其製備方法，以及包括所述晶片的檢測試劑盒。
背景技術：
腸道感染是世界排名第3位的疾病病因，其中傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌引 起的腸熱症佔主要部分。這種疾病構成在衛生條件差和飲水未經處理的國家更為明顯，是 威脅人們健康的主要問題。在亞洲，甲型副傷寒沙門菌已經成為腸熱症的主要病因。中國 自1998年分離到甲型副傷寒沙門菌，它逐漸成為流行的優勢菌型，經常引起地方性流行和暴發。 傷寒副傷寒在全球分布廣泛，2000年世界衛生組織(WHO)估計全球傷寒總發病數 為2 165萬，發病率高達355/10萬，死亡數21.6萬，其中副傷寒發病數541萬。雖然全球 的傷寒副傷寒總發病呈下降趨勢，但在衛生狀況不良的地區，發病率仍居高不下，常出現水 和食物汙染引起的暴發和流行。傷寒副傷寒沙門菌耐藥日益嚴重，流行菌型不斷變遷，傷寒 副傷寒高發病率所造成的疾病負擔仍不容忽視。 目前傷寒副傷寒的診斷方法有細菌的分離培養、血清學方法如肥達氏反應、乳 膠凝集試驗、ELISA、核酸檢測(PCR)。分離培養法是在患者的體液標本中培養出傷寒沙門 菌，是最基本也是診斷傷寒病例的金標準。培養所用的標本可有骨髓、血液、糞便和尿液， Gilman等的實驗中證明即使在使用抗生素的前提下，骨髓的培養陽性率仍然最高，可達到 90%，而血、尿等標本的培養陽性率受到顯著影響。但抽取骨髓對患者來說很痛苦，並且增 加了傷寒病診治過程中的風險。由於培養的方法受到抗生素應用的影響，陽性率大大降低， 而且培養的方法至少經過3 5天才能得到結果，不能及時為正確合理的治療方案提供依 據。 血清學方法所針對的目的抗原(或其相應的抗體)有以下3種菌體抗原0、鞭毛 抗原H和Vi抗原。其中，肥達反應存在諸多問題，在診斷上含糊不清，不敏感不特異，已表 現出顯著的局限性，需要改用其他敏感特異的檢測方法。相對於肥達反應18 24h的時 耗，ELISA顯示了快速靈敏和特異的特點人們普遍認為EL ISA方法是一種既靈敏又特異的 診斷方法。尤其是EL ISA方法同時檢測IgM和IgG比單獨檢測IgM結果更可靠。
PCR檢測標本中的傷寒沙門菌核酸，是目前公認最為敏感和特異的診斷方法。但 PCR方法並不是完美的，不僅容易汙染，另外，傷寒和甲型副傷寒沙門菌是胞內寄生菌，抗生 素的濫用加劇了血液中細菌數量的減少，製備DNA模板過程中樣品的損失增加PCR擴增的 難度。但PCR方法的靈敏度比血培養和肥達氏反應顯著高，並且其高靈敏度和特異性對臨 床有爭議的傷寒病例做出快速、確切的診斷有巨大作用。 上述方法都各有優缺點，但都需要一次實驗只能檢測一種細菌，或者一個抗體，不 能同時檢測出傷寒0、 H、 VI和副傷寒甲、乙、丙型。在檢測效率方面費時費力，尤其傳統的 肥達氏反應更需要12-24小時，分離培養需要3-5天時間。PCR方法固然敏感和特異，但也要幾個小時，也需要昂貴儀器，一次實驗只能作出一種細菌的診斷，在基層醫療機構無法實 施，因為它需要有嚴格控制的操作空間和結淨環境。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，解決現 有技術存在的缺陷。 為實現上述目的，本發明採用如下技術方案 —種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片包括晶片片基，所述的片基設置有至 少一個檢測單元，所述的檢測單元設置有檢測樣待檢點陣，所述的檢測點陣為雙位點設計； 所述的檢測點陣包括質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、 乙、丙型檢測位點；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒0、H、VI型檢測位點和副傷寒 甲、乙、丙型檢測位點分別包被有相應的抗原。
優選的方案是所述的檢測點陣還包括空白對照檢測點。
更為優選的方案是所述的檢測單元的檢測樣待檢點陣為4X5雙位點設計；所述
的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點
以及空白對照檢測點設置有兩個重複；所述的陰性對照檢測點以及空白對照檢測點為傷寒
0、H、VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點的共同對照檢測點。 更為優選的方案是所述的質控檢測點包被的抗原為為用於檢測IgM和/或IgG
型抗體的抗原。 更為優選的方案是所述的晶片片基為活化處理後的玻璃片基，或者為膜片基，或 者為高分子矽片基，或者為塑料片基。 更為優選的方案是所述的晶片片基為多聚-L-賴氨酸或者戊二醛活化處理的玻 璃片基，或者為膜片基，或者為高分子矽片基，或者為塑料片基。 本發明的目的之二在於提供一種製備用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片的方 法，採用如下技術方案 —種製備用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片的方法包括如下步驟 (A)準備好已經活化處理的晶片片基，所述的片基設置有至少一個檢測單元，所述
的檢測單元設置有檢測樣待檢點陣，所述的檢測點陣為雙位點設計；所述的檢測點陣包括
質控檢測點，陰性對照檢測點，空白對照檢測點，傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、
丙型檢測位點； (B)準備待檢測的傷寒0、H、 VI型抗原和副傷寒甲、乙、丙型抗原； (C)準備質控蛋白，所述的質控蛋白為經過多次試驗後確定，無論待檢樣品室陽性
還是陰性，該蛋白均能在反應結束後顯示質控點，在閱讀儀或掃描儀下能清晰可見； (D)對晶片片基的檢測位點進行位點圖案排布設計，所排布的圖案能被人工或者
點樣機械手點樣時識別； (E)點樣，將質控蛋白和傷寒0、H、VI型抗原和副傷寒甲、乙、丙型抗原按步驟D中
設計的圖案用機械手或人工點樣於晶片上，並對其進行封閉反應，製作傷寒副傷寒檢測芯
片，用於同時檢測不同亞型所產生的抗體，包括IgM和/或IgG型抗體。 優選的方案是所述的檢測單元的檢測樣待檢點陣為4X5雙位點設計；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒0、H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點以及空 白對照檢測點設置有兩個重複；所述的陰性對照檢測點以及空白對照檢測點為傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點的共同對照檢測點；所述的質控檢測點包被 的抗原為用於檢測IgM和/或IgG型抗體的抗原；所述的晶片片基為多聚-L-賴氨酸或者 戊二醛活化處理的玻璃片基，或者為膜片基，或者為高分子矽片基，或者為塑料片基。
本發明的目的之三在於提供一種包括本發明的發明目的之一所述的生物晶片的 檢測試劑盒，採用如下技術方案 —種用於同時檢測傷寒、副傷寒的檢測試劑盒，包括如發明目的之一任一技術方
案所述的生物晶片； 稀釋試劑； 視蹤試劑； 洗滌試劑； 和顯色反應試劑。 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果 本發明所述的生物晶片，通過雙位點設計點陣的方法來實現高通量同時檢測傷寒 沙門氏菌感染，即一次檢測可得知傷寒0、 H、 VI和副傷寒甲、乙、丙型的組合，具有鑑別感染 類型和鑑別診斷的作用，尤其傷寒與副傷寒感染後臨床症狀幾乎完全相似，只有嚴格的分 型診斷才能區別。通過本發明所述的檢測試劑盒，可以實現高效、節省時間、高通量同時診 斷檢測傷寒沙門氏菌感染，即一次檢測可得知傷寒0、 H、 VI和副傷寒甲、乙、丙型的組合的 目的。無論對於基層還是大型醫療機構，均可以使用，配以晶片閱讀儀後可以達到定量診斷 的目的，對基層人員的要求不高，但產品的靈敏度照樣可以達到ELISA的水平。是目前比較 理想的技術平臺方法，在國內外均未見到類似的方法。
圖1為本發明所述的生物晶片檢測單元的點陣結構示意圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
實施例1 用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片的製備 如圖l所示，一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片包括多聚-L-賴氨酸活 化的玻璃三維晶片片基，所述的片基設置有至少一個檢測單元，檢測單元設置有檢測樣待 檢點陣，檢測樣待檢點陣為4X5雙位點設計；從上至下用A、 B、 C、 D分別代表行，從左至右 用數字1、2、3、4、5分別代表列。其中，各位點A1、B1、C1、D1均代表質控點；各位點A2、B2 代表傷寒0位點；A3、B3代表傷寒H位點；A4、B4代表傷寒VI位點；A5、B5代表副傷寒甲位 點；C2、 D2代表副傷寒乙位點；C3、 D3代表副傷寒丙位點；C4、 D4代表陰性對照(NC)位點; C5、D5為空白對照位點。質控檢測點包被的抗原為IgM和IgG型抗原。依據檢測儀器的需 要，可以將本實施例所述的多個檢測單元設計在一張檢測晶片上，在用於臨床檢測時，可以 同時對多個檢測標本進行檢測。
—種能同時檢測傷寒副傷寒感染的生物晶片，其具體製備步驟如下 1)用TBS緩衝液(PH值8. 0)將傷寒0、H和副傷寒甲、乙、丙抗原及對照和質控點
稀釋到10ug/ml。陰性對照用TBS緩衝液代替； 2)將稀釋後的各類抗原和對照，用點樣儀機械手按照後面所示的圖案噴點於玻璃 基片上，在溼度為60%的孵育箱中放置3小時； 3)用封閉液封閉上述晶片，在上述同樣的條件下2小時。所述的封閉液主要以含
蔗糖、洛蛋白、明膠為主的超純水製備而成，ra值為6. 0-7. 2，以7. 0為首選； 4)乾燥將上述3)步驟形成的晶片置於乾燥環境(溫度22度、溼度低於45% )
下乾燥過夜。 5)將上述4)步驟所形成的晶片，裝於鋁箔袋中，加乾燥劑後封口，保存於4-8度待
用，有效期可達一年。
實施例2
檢測試劑盒的組裝
實施例1所述的生物晶片 2TX10/20片
標本稀釋液 1瓶(2. 5/5ml ，呈藍色)
示蹤物 1瓶(2. 5/5ml ，呈紅色)
顯色劑 1瓶
洗滌液 2/4瓶(18mlX2/4，直接使用)
說明書 1張
溼盒自備於飯盒內放溼紗布一層即可。 實施例3
通過檢測試劑盒同時檢測傷寒沙門氏菌感染
將實施例2所述試劑盒平衡至室溫。標本稀釋用標本稀釋液以1 : 20(15ul 300ul)稀釋血清標本於試管中混勻。加樣取出晶片拆封並平放於實驗臺上，於每方格中 加入200ul已稀釋的標本，注意使標本布滿方格。孵育將晶片置於溼盒中並放置37t:溫 育30分鐘。甩去方格內液體，於每格內加入4滴洗滌液，立刻甩掉，連續洗滌3次，最後用 蒸餾水流洗1秒鐘，甩幹後在吸水紙上吸乾方格周圍水滴。加示蹤物每格滴2滴示蹤物， 勿溢出方格外。溼盒中37t:溫育30分鐘，同上法洗滌3次，在吸水紙上吸乾周圍水滴。顯 色每格加入2滴顯色劑，37t:孵育箱顯色10-12分鐘。甩去方格內液體，用蒸餾水流洗1 秒種。甩幹，吸水紙吸乾液滴。 檢測結果通過同一反應單元，可同時得知不同類型的傷寒感染組合，如若O位 點出現陽性，則為傷寒近期感染，若H位點出現陽性反應，則為既往傷寒感染，具有流行病 學診斷的意義；若O與H位點同時出現陽性反應，則代表是傷寒的近期感染和復發感染；如 副傷寒甲位點出現陽性反應，則代表是副傷寒甲型感染，依次類推。NC位點始終不出現反 應，是陰性對照；C5、 D5位點也始終不出現反應，是空白對照；各位點的反應呈現藍色或紅 色斑點(與示蹤物有關)，弱反應可能呈現半圓型斑點或淡淡的斑點。本系統設計中陰性標 本不顯色，即為背景色。本晶片所指背景是晶片基質的顏色、點與點之間的部分為背景。顯 色即為陽性。 一般情況下標本位點的顯色深度不超過質控點。當標本顯色較弱時，有時可 出現"空心"或"半空心"，尤其當甩掉顯色液吸乾後會出現此現象，仍判為陽性。本系統以雙位點設計，若雙位點中只有一個顯色，另一位點未顯色，則實驗需重複。實驗完畢的晶片 若要長期保存可存放於黑暗乾燥處，並做為汙染物處理。室溫過低(低於2(TC)會致顯色 較慢且偏淡，可適當延長時間或置37t:恆溫箱中解決。 需要定量分析時，將其結果通過掃描儀掃描後，使用分析軟體進行分析。 以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定
本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在
不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於發明型的
保護範圍。
權利要求
一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是包括晶片片基，所述的片基設置有至少一個檢測單元，所述的檢測單元設置有檢測樣待檢點陣，所述的檢測點陣為雙位點設計；所述的檢測點陣包括質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒O、H、VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒O、H、VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點分別包被有相應的抗原。
2. 如權利要求1所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是所述的檢測 點陣還包括空白對照檢測點。
3. 如權利要求2所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是所述的檢測 單元的檢測樣待檢點陣為4X5雙位點設計；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點以及空白對照檢測點設置有兩個重複；所述的陰性對照檢測點以及空白對照檢測點為傷寒0、H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型 檢測位點的共同對照檢測點。
4. 如權利要求3所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是所述的質控檢測點包被的抗原為用於檢測IgM和/或IgG型抗體的抗原。
5. 如權利要求4任一項所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是所述的晶片片基為活化處理後的玻璃片基，或者為膜片基，或者為高分子矽片基，或者為塑料片基。
6. 如權利要求5所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，其特徵是所述的晶片片基為多聚-L-賴氨酸或者戊二醛活化處理的玻璃片基，或者為膜片基，或者為高分子矽片基，或者為塑料片基。
7. —種製備用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片的方法包括如下步驟(A) 準備好已經活化處理的晶片片基，所述的片基設置有至少一個檢測單元，所述的檢 測單元設置有檢測樣待檢點陣，所述的檢測點陣為雙位點設計；所述的檢測點陣包括質控 檢測點，陰性對照檢測點，空白對照檢測點，傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型 檢測位點；(B) 準備待檢測的傷寒0、H、VI型抗原和副傷寒甲、乙、丙型抗原；(C) 準備質控蛋白，所述的質控蛋白為經過多次試驗後確定，無論待檢樣品室陽性還是 陰性，該蛋白均能在反應結束後顯示質控點，在閱讀儀或掃描儀下能清晰可見；(D) 對晶片片基的檢測位點進行位點圖案排布設計，所排布的圖案能被人工或者點樣 機械手點樣時識別；(E) 點樣，將質控蛋白和傷寒0、H、VI型抗原和副傷寒甲、乙、丙型抗原按步驟D中設計 的圖案用機械手或人工點樣於晶片上，並對其進行封閉反應，製作傷寒副傷寒檢測晶片，用 於同時檢測不同亞型所產生的抗體，包括IgM和/或IgG型抗體。
8. 如權利要求7所述的用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片的方法其特徵是所述 的檢測單元的檢測樣待檢點陣為4X5雙位點設計；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點， 傷寒0、H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點以及空白對照檢測點設置有兩個重 復；所述的陰性對照檢測點以及空白對照檢測點為傷寒0、 H、 VI型檢測位點和副傷寒甲、 乙、丙型檢測位點的共同對照檢測點；所述的質控檢測點包被的抗原為為用於檢測IgM和/ 或IgG型抗體的抗原；所述的晶片片基為多聚-L-賴氨酸或者戊二醛活化處理的玻璃片基，或者為膜片基，或者為高分子矽片基，或者為塑料片基。
9. 一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的檢測試劑盒，其特徵是包括如權利要求1 6 任一項所述的生物晶片；稀釋試劑；視蹤試劑；洗滌試劑；和顯色反應試劑。
全文摘要
本發明公開了一種用於同時檢測傷寒、副傷寒的生物晶片，屬於生物晶片技術領域，包括晶片片基，所述的片基設置有至少一個檢測單元，所述的檢測單元設置有檢測樣待檢點陣，所述的檢測點陣為雙位點設計；所述的檢測點陣包括質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒O、H、VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點；所述的質控檢測點，陰性對照檢測點，傷寒O、H、VI型檢測位點和副傷寒甲、乙、丙型檢測位點分別包被有相應的抗原。通過本發明所述的生物晶片進行檢測，可以實現高效、節省時間、高通量同時診斷檢測傷寒沙門氏菌感染，即一次檢測可得知傷寒O、H、VI和副傷寒甲、乙、丙型的組合的目的。
文檔編號G01N33/569GK101738472SQ20091023892
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者林連成 申請人:深圳市賽爾生物技術有限公司