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檢測白血病bcr-abl的多重rt-pcr試劑盒的製作方法

2023-09-19 21:50:15 2

檢測白血病bcr-abl的多重rt-pcr試劑盒的製作方法
【專利摘要】檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,涉及白血病的檢測。採用多重RT-PCR結合毛細管電泳技術,通過一次PCR反應可同時檢測出BCR-ABL的三種融合形式e1a2、e13a2和e14a2,有效節約了檢測時間以及成本。以重疊延伸法所構建的三種融合形式e1a2、e13a2和e14a2作為陽性質控品,根據色譜圖形可快速、高效、準確的判斷擴增產物長度。適用於慢性粒細胞白血病,急性淋巴細胞白血病以及少數急性髓性細胞白血病患者體內BCR-ABL融合基因不同融合形式e1a2、e13a2和e14a2的定性檢測診斷以及輔助臨床用藥的選擇和預後判斷等多個領域。
【專利說明】檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及白血病的檢測,尤其是涉及一種檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒。
【背景技術】
[0002]白血病是造血系統中一種惡性克隆性疾病,在我國的發病率約(3.0~4.0)/10萬,而死亡率為50%。在惡性腫瘤死亡率中,白血病在我國男女性中分別居第6和第8位(孫曉東,柴憶歡,曹幼甫等.兒童白血病發病因素調查研究[J].中國航天醫學雜誌,2003,12(6):1-3)。多項研究已表明大部分白血病患者存在某種染色體異常(易位、倒位、缺失等),它是導致白血病發生發展的重要原因。而第一個將染色體異常與特定的腫瘤類型聯繫在一起的則是慢性粒細胞白血病(慢性粒細胞白血病英文全稱為chronicmyeloid leukemia,英文縮寫為CML)。CML發病率佔成人白血病的15%,其全球年發病率約為(I ~2)/10 萬,而在我國年發病率為 0.36/10 萬(FAGGIANO A, MANSUETO G, FER0LLAP,et al.Diagnostic and prognostic implications of the World Health Organizationclassification of neuroendocrine tumors[J].Journal of endocrinological investigation, 2008,31 (3):216-223)。CML的染色體異常在慢性期即已存在,是CML發病機制中的主要因素。因在費城發現,故命名為費城染色體(費城染色體的英文全稱為Philadelphia chromosome,英文縮寫為 Ph),顯帶分析為 t (9 ;22) (q34 ;qll),即位於 9號染色體上q34區的ABL基因和22號染色體上qll區的BCR基因融合形成新型基因BCR-ABL(NOWELL PC H D.A minute chromosome in human granulocytic leukemia[J].Science, 1960, 132:1497)。95%以上的CML病人中都會存在融合基因BCR-ABL,且在患急性淋巴細胞白血病的病人中也有顯著的發生率,成年人約為15%~30%,兒童約為5%,在2%初診為急性髓系細胞白血病的病人中也有所存在(SPECCHIA G, MININNI D, GUERRAS IO A, etal.Ph positive acute lymphoblastic leukemia in adults:molecular and clinicalstudies [J].Leukemi a&lymphoma, 1995, 18(1): 37-42)。由 BCR-ABL 編碼出的融合蛋白是一種具有持續活性酪氨酸激酶,參與多種信號通路的調節,例如幹擾有絲分裂原蛋白激酶通路而上調細胞增殖,幹擾磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路導致凋亡減少(MEL0 JV, DEININGER M ff.Biology of chronic myelogenous leukemia—signaling pathwaysof initiation and transformation[J].Hematology/oncology clinics of NorthAmerica, 2004, 18(3): 545-568),最終影響造血幹細胞的正常工作。因此,CML融合基因的檢測有助於了解慢性粒細胞白血病發病機制。
[0003]目前CML的治療主要是以提高細胞遺傳學緩解(即Ph陽性細胞消失率)和分子生物學緩解(即BCR-ABL融合基因轉陰性率)為目標,從而保證患者獲得長期無病生存,因此臨床上若要評價白血病治療方式的效果,融合基因的檢測就顯得尤為重要。同時它也為制定合理的治療方案提供了依據,例如對於含有BCR-ABL的白血病病人,可以用靶向藥物伊馬替尼來進行治療(DEININGER M, BUCHDUNGER E, DRUKER B J.Thedevelopment of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia[J].Blood, 2005,105(7):2640-2653)。
[0004]現在,白血病的診斷依據,已不僅從形態學上來獲得,還需要其它信息如遺傳的、免疫的、生物學的以及臨床的特徵來確定(VARDIMAN J ff, HARRIS N L, BRUNNING R D.TheWorld Health Organization(WHO)classification of the myeloid neoplasms[J].Blood, 2002, 100 (7): 2292-2302)。2000年WHO已經將染色體易位作為白血病分類方案的最重要的指標之一。而鑑於融合基因在對於疾病的診斷、預後、療效評價以及微小殘留病監測等上的臨床價值,融合基因檢測技術的開發不得不說具有很大的市場價值以及臨床意義。目前,融合基因的檢測方法主要有染色體核型分析、螢光原位雜交技術以及聚合酶鏈反應(聚合酶鏈反應的英文全稱為polymerase chain reaction,英文縮寫為PCR)等。染色體核型分析,作為細胞遺傳學研究的基本方法,依然是臨床上初始診斷白血病的常規手段。然而,這個過程繁瑣、費時,要求處於細胞中期的樣本,檢測的靈敏度只有 1% ~5% (CHUNG N G, BUXH0FER-AUSCH V, RADICH J P.The detection andsignificance of minimal residual disease in acute and chronic leukemia[J].Tissue antigens, 2006,68 (5): 371-385)。螢光原位雜交技術能夠分析處於細胞分裂中期和間期細胞,可作為染色體顯帶技術的一種輔助手段來確定融合基因,然而,它操作繁瑣,對技術要求較高,假陽性率也較高(> 10%),且當Ph陽性細胞數小於10%時即不適用(SEONG D C, KANTARJIAN H M, RO J Y, et al.Hypermetaphase fluorescence in situhybridization for quantitative monitoring of Philadelphia chromosome-positivecells in patients with chronic myelogenous leukemia during treatment [J].Blood, 1995,86(6):2343-2349)D因此,鑑於PCR法檢測快速有效,不需要大量的病人樣本,也不要求分裂細胞,即使在稀少的異常細胞中也能夠檢測到,具有很高的敏感性等這些特點,在臨床上的應用極廣。通常,PCR檢測融合基因都是基於其RNA水平,這是因為融合基因DNA水平上的斷裂點大部分是在內含子位置,可能會由於片段過長而造成擴增失敗或效率下降,而且各個病人的斷裂點在內含子上的位置也不同,而檢測RNA水平的融合基因不需要考慮內含子的這些問題,使得檢測融合基因更方便。綜合各種關於PCR檢測融合基因方法的文獻研究或市場產品,目前應用於臨床上融合基因檢測的PCR技術主要是逆轉錄PCR (逆轉錄 PCR 的英文全稱為 reverse transcription-quantitative PCR,英文縮寫為RT-PCR)和突光定量 PCR(突光定量 PCR 英文全稱為 reverse transcription-quantitativePCR,英文縮寫為R T-qPCR)技術。
[0005]螢光定量PCR技術由於其自動化程序操作,極高的靈敏度,且能定量的優勢已成為微小殘留性疾病監控研究的重點,但對於定性方面的研究並不多,再加上其所需要的儀器以及試劑的昂貴性,無疑限制了它在白血病臨床初始診斷分型上的應用。關於非實時RT-PCR技術的報導相對比較多,早在1998年時就有研究報導採用多重巢式RT-PCR方法同時檢測急性白血病中29種融合基因(PALLISGAARD N, H0KLAND P, RIISHOJ D C,etal.Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneousscreening of29translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia[J].Blood, 1998,92(2): 574-588)。1999年來自歐洲多個國家的實驗室則通過合作,對能夠敏感檢測急性白血病中常見的8種染色體異位所形成的融合基因的巢式RT-PCR方法進行了標準化,包括 PCR 引物以及 PCR 步驟(VAN DONGEN J J, MACINTYRE E A, GABERT J A, etal.Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosomeaberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease.Reportof the BIOMED-1Concerted Action:1nvestigation of minimal residual disease inacute leukemia [J].Leukemia, 1999, 13(12): 1901-1928)。之後的各種方法學的報導大部分也都是在這兩項研究的基礎上進行的PCR條件以及體系的改良。
[0006]多重PCR技術因為是在同一個PCR反應體系裡加入兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的PCR反應,所以在臨床上檢測白血病中多種融合基因的實用性很大。故本研究以CML病人常見的BCR-ABL融合基因的三種最常見的融合形式ela2、el3a2和el4a2作為檢測對象,將多重RT-PCR和毛細管電泳結合,建立出了一種適用於臨床的快速、有效檢測白血病融合基因的方法,以期應用於白血病初始診斷分型,作為核型分析的一種輔助手段來確定其檢測到的染色體異常,並為選擇合適的治療措施以及療效評價提供一定的幫助。

【發明內容】

[0007]本發明的目的之一在於提供一種既快速、準確,又經濟、價廉,並且易於標準化的BCR-ABL融合基因定性檢測方法。
[0008]本發明的目的之二在於提供一種用於慢性粒細胞白血病,Ph陽性的急性髓系細胞白血病和急性淋巴細胞白血病患者血液中BCR-ABL融合基因檢測的多重RT-PCR的引物、試劑盒和配套的PCR擴增程序。
[0009]所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,包括BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶、對照品、多重PCR擴增程序和包裝物;
[0010]所述BCR-ABL基因PCR反應液由PCR反應緩衝液、2條BCR-ABL基因特異性上遊引物、I條BCR-ABL基因特異性下遊引物組成,所述2條BCR-ABL基因特異性上遊引物Fl序列為:5,-TTTGAGGATTGCGGAGGC-3?, F2 序列為 5』 -GGAGCAGCAGAAGAAGTGTT-3』,所沭 I 條BCR-ABL基因特異性下遊引物R序列為:5』 -GGTCCAGCGAGAAGGTTT-3,。
[0011]所述BCR-ABL基因特異性上遊引物的濃度為10 μ Μ,所述BCR-ABL基因特異性下遊引物的濃度為10 μ Mo
[0012]所述PCR 反應緩衝液由 Tris-HCl 10mM、KC150mM、MgCl20.2mM 和 dNTPs0.2mM 組成,所述 Tris-HCl 的 pH 為 8.3 ;或所述 PCR 反應緩衝液由 IOOmM Tris-HCl、500mMKCl、25mMMgCl2 和 25mM dNTPs 組成,所述 Tris-HCl 的 pH 為 8.8。
[0013]所述Taq酶的每次反應用量為1U。
[0014]所述PCR的擴增程序為:第一階段:95°C Iminl個循環;第二階段:95°C 30s, 66~61 °C 30s (每個循環降低 1°C),72°C 20s,5 個循環;第三階段 95°C 30s,61°C 30s, 72°C 20s,25個循環;其中第二階段用於富集特異產物,第三階段用於擴增。
[0015]採用所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒對待測樣本PCR擴增後,採用毛細管電泳進行檢測,只有當對照品BCR-ABL融合基因的三種融合形式ela2、el3a2和el4a2檢測呈陽性,無模板對照品無信號時,待檢測樣本的檢測結果才有效。
[0016]本發明在對Genebank中已知的人類BCR基因以及ABL基因的信使RNA序列進行比對分析,選擇BCR基因斷裂點上遊序列和ABL基因斷裂點下遊序列進行特異性多重引物設計。所設計的多重引物Tm值大體一致,長度相似,整合搭配各引物使其儘量避免二聚體產生。這些引物可同時在包括Taq聚合酶、高純度的脫氧核苷酸(dNTPs)以及Mg2+離子等的PCR反應液中,按照PCR擴增程序,通過PCR擴增實現BCR-ABL融合基因的三種融合形式ela2、el3a2和el4a2的同時檢測,具有快速、準確、經濟、價廉等優點。
[0017]本發明的優點是:(1)與核型分析輔助手段FISH相比,本發明操作簡單、快捷,敏感性高,對樣本要求不高,並能清晰的判斷融合基因融合類型;(2)與實時PCR定量檢測融合基因的方法相比,本發明著重於定性分析,故採用成本、工作量和所需的模板量需求低;
(3)而與巢式多重RT-PCR檢測融合基因的方法相比,本發明無需進行多次PCR,避免操作繁瑣、費時且模板汙染的可能;(4)從產業化上看,本發明採用毛細管電泳,與常規的瓊脂糖凝膠電泳相比,自動化程度高,檢測靈敏快捷,微量模板即可完成,尤其適用於臨床上大批量樣本操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為對照品BCR-ABL融合基因的構建原理。
[0019]圖2為經過核型分析鑑定為BCR-ABL融合基因兩例慢性粒細胞白血病樣本經本試劑盒檢測的結果。圖中數字I和2表示樣本結果;3,4,5分別表示對照品ela2,el3a2,el4a2模板擴增結果(陽性對照);6表示超純水為模板擴增結果(陰性對照)。
[0020]圖3為兩例急性淋巴細胞白血病樣本經本試劑盒檢測的結果。圖中數字I和2表不樣本結果;3,4,5分別表不對照品ela2, el3a2, el4a2模板擴增結果(陽性對照);6表不超純水為模板擴增結果 (陰性對照)。
[0021]圖4為I例無BCR-ABL融合基因的健康血液樣本經本試劑盒檢測的結果。圖中數字I表示樣本結果;2,3,4分別表示對照品ela2,el3a2, el4a2模板擴增結果(陽性對照);5表示超純水為模板擴增結果(陰性對照)。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0023]實施例1BCR-ABL融合基因檢測試劑盒及其使用
[0024]I製備包括下列組成成分的試劑盒=BCR-ABL基因PCR反應液(1200 μ L) I管、Taq酶(30μ L) I管、對照品(300 μ L) I管。
[0025]2樣本的採集、保存和運輸:
[0026]2.1使用樣本類型:新鮮血液。
[0027]2.2樣本採集、保存和運輸:用抗凝管搜集新鮮血液後立即進行RNA抽提,或者提取白細胞放入液氮冷凍並保存於_80°C。樣本長途運送採用乾冰。
[0028]3、核酸抽提:
[0029]建議利用MagCore Compact核酸抽提儀,按照其配套全血RNA抽提試劑盒(MRN-Ol)的說明書操作,最終每400μ L血液樣本中可獲得洗脫體積為200 μ L的RNA樣品,之後立即進行逆轉錄。
[0030]4、逆轉錄:
[0031]建議使用QIAGEN QuantiTcct ? Reverse Transcription 試劑盒。按照說明書進行操作。
[0032]5、多重 RT-PCR 檢測:
[0033]5.1試劑準備:按比例吸取相應量的BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶(BCR-ABL基因PCR反應液19.8 μ L/人份+Taq酶0.2 μ L/人份),充分混勻後按20 μ L/人份分裝入PCR
反應管,備用。
[0034]5.2加樣:分別向BCR-ABL基因PCR反應管加入5 μ L逆轉錄後的cDNA樣本,同時向BCR-ABL基因PCR反應管加入5 μ L對照品樣本作為對照品,向BCR-ABL基因PCR反應管加入5yL超純水作為NTC。
[0035]5.3 編輯:在 Thermal Profile Setup 窗口編輯反應程序:第一階段:95°C Iminl個循環;第二階段:95°C 30s, 66~61 °C 30s (每個循環降低1°C),72°C 20s,5個循環;第三階段95°C 30s,61°C 30s, 72°C 20s, 25個循環;其中第二階段用於富集特異產物,第三階段用於擴增。所有設置完成後保存文件,運行。
[0036]5.4結果檢測:反應結束後,將PCR產物(上樣體積0.5μ L以上)放於毛細管電泳儀內,自動進行電泳結果檢測。反應結束後打開分析窗口,選擇樣本孔,自動分析結果。
[0037]實施例2應用BCR-ABL融合基因檢測試劑盒檢測5例臨床樣本
[0038]選取經過核型分析鑑定有BCR-ABL的2例慢性粒細胞白血病病人和2例急性淋巴細胞白血病病人血液樣本和無BCR-ABL的I例健康血液樣本提取RNA後立即逆轉錄,將得到的逆轉錄產物進行檢測,同時檢測對照品、NTC。
[0039]檢測結果解釋=BCR-ABL融合基因的無模板對照品NTC除卻marker色譜峰(20bp, IOObp)外無其它峰出現,說明體系沒有受到汙染;對照品出現與BCR-ABL融合基因的三種融合形式ela2、el3a2和el4a2相對應的峰值413bp、215bp和290bp,說明體系可有效地檢測BCR-ABL融合基因。
[0040]2例經過核型分析鑑定為BCR-ABL融合基因的慢性粒細胞白血病血液樣本檢測結果為兩例均表達290bp的el4a2型BCR-ABL融合基因(見圖2),2例經過核型分析鑑定為BCR-ABL融合基因的急性淋巴細胞白血病血液樣本檢測結果為一例表達413bp的ela2型BCR-ABL融合基因,一例表達215bp的el3a2型BCR-ABL融合基因(見圖3),I例經過核型分析鑑定無BCR-ABL融合基因的健康血液無目的帶出現(見圖4)。
[0041]本次實驗中5例樣本的檢測結果與核型分析的檢測結果完全吻合,且能清晰的辨別融合基因亞型,說明利用本試劑盒來定性檢測白血病患者BCR-ABL融合基因是可行的,本試劑盒快速、準確、經濟、價廉,為臨床檢驗帶來便利的同時也能有效地減低病患的經濟負擔。
[0042]實施例3應用BCR-ABL融合基因檢測試劑盒與臨床金標準染色體核型分析技術同時檢測50例臨床樣本
[0043]選取50例白血病血液樣本,其中45例經臨床金標準染色體核型分析鑑定為陽性,5例鑑定為陰性。提取RNA後立即逆轉錄 ,將得到的逆轉錄產物用BCR-ABL融合基因檢測試劑盒進行檢測,結果如表1所示。
[0044]表1兩種方法檢測BCR-ABL融合基因結果比較
【權利要求】
1.檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於包括BCR-ABL基因PCR反應液、Taq酶、對照品、多重PCR擴增程序和包裝物; 所述BCR-ABL基因PCR反應液由PCR反應緩衝液、2條BCR-ABL基因特異性上遊引物、I條BCR-ABL基因特異性下遊引物組成,所述2條BCR-ABL基因特異性上遊引物Fl序列為:5,-TTTGAGGATTGCGGAGGC-3,, F2 序列為 5,-GGAGCAGCAGAAGAAGTGTT-3 』,所沭 I 條 BCR-ABL.基因特異性下遊引物R序列為:5』 -GGTCCAGCGAGAAGGTTT-3』。
2.如權利要求1所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於所述BCR-ABL基因特異性上遊引物的濃度為10 μ Μ,所述BCR-ABL基因特異性下遊引物的濃度為10 μ Μ。
3.如權利要求1所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於所述PCR反應緩衝液由 IOOmM Tris-HCl、500mM KCl、25mM MgCl2 和 25mM dNTPs 組成,所述 Tris-HCl的pH為8.8。
4.如權利要求1所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於所述PCR反應緩衝液由 Tris-HCl lOmM.KCl 50mM、MgCl2 0.2mM和 dNTPs 0.2mM 組成,所述 Tris-HCl的pH為8.3。
5.如權利要求1所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於所述Taq酶的每次反應用量為IU。
6.如權利要求1所述檢測白血病BCR-ABL的多重RT-PCR試劑盒,其特徵在於所述PCR的擴增程序為:第一階段:95°C Iminl個循環;第二階段:95°C 30s,66~61°C 30s,每個循環降低1°C,72°C 20s,5個循環;第三階段95°C 30s,61°C 30s, 72°C 20s, 25個循環;其中第二階段用於富集特異產物`,第三階段用於擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627810SQ201310673777
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】曾驥孟, 呂曉楠, 劉祝君 申請人:廈門大學

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