少突膠質祖細胞和獲得及培養它們的方法

2023-09-19 22:21:00

專利名稱：少突膠質祖細胞和獲得及培養它們的方法
技術領域：
本發明涉及獲得自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法，和涉及用本發明方法得到的細胞。
本發明進一步涉及維持自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群較長時期而不改變細胞特性的方法。
通過連續地應用細胞分離(通過消化試劑，如胰蛋白酶)，隨後應用限定的培養條件，本發明的少突膠質祖細胞可以被去分化回到較早的發育階段。因此，本發明也涉及獲得具有同步發育階段的分化的和去分化的同質少突膠質祖細胞群或少突膠質細胞群的方法。
最後，本發明涉及用本發明的細胞治療患者的方法，和篩選候選藥物的方法，所述藥物用於治療脫髓鞘和導致髓鞘減少的神經元變性疾病的方法。
背景技術：
許多脊椎動物神經元的軸突由髓鞘所隔絕，這大大增加了軸突傳導動作電位的速度。少突膠質細胞(oligodendrocyte)負責中樞神經系統中髓鞘的形成。這些少突膠質細胞以環繞軸突的緊密螺旋層層包裹它們自身的漿膜，形成鞘，因而使軸突膜絕緣，以至於幾乎沒有電流漏過它。鞘在固定間隔的郎飛節處中斷，在該處，集中了軸突中的幾乎所有鈉通道。由於軸突膜的鞘內部分具有優異的電纜性質，因此一個節處的膜去極化幾乎立即被動地傳播到相鄰節。這樣，通過從一個節到另一個節的跳躍，動作電位沿著有髓鞘的軸突傳播。這種類型的傳導具有兩個主要優勢動作電位傳播較快，並且由於活性興奮被限制在郎飛節處軸突漿膜的小區域，保存了代謝能量。
脫髓鞘病多發性硬化顯著說明了髓鞘形成的重要性，在多發性硬化中，中樞神經系統中一些區域的髓鞘由於未知的機理遭到破壞。在許多神經變性疾病中，也強烈說明了髓鞘形成的重要性，在這種疾病中，有髓鞘的神經元受到損傷。在發生這些疾病的部位，神經衝動的傳播被大大減慢，常常伴有毀壞性的神經學後果。
少突膠質細胞似乎是終末分化細胞，其不經歷進一步的體內細胞分裂，因此，難於在體外長期培養(Verity等，J.Neurochem.，60577，1993)。少突膠質祖細胞，其具有增殖能力和分化潛能，提供了系統，通過該系統，可以在體外研究細胞分化和髓鞘形成/脫髓鞘/髓鞘再生的細胞機制和分子機制，並提供了促進體內髓鞘形成/髓鞘再生的來源。然而，在中樞神經系統(CNS)中，少突膠質細胞不同步地從少突膠質祖細胞發育，因此也認為，它們可能是表型上異質的細胞群(Skoff等，J.Comp.Neurol.169313-334，1976)。確實，起始於分離的圍產期腦的培養物是遺傳上異質的細胞群，具有非同步的發育成熟。因此，難於分離具有相同發育階段的表型同質的原代少突膠質祖細胞群。
因此，在本領域中，存在著對自我更新的，表型同質的同步少突膠質祖細胞群的需求，所述細胞具有同步化的發育階段，和存在著對獲得、維持和保存該細胞的方法的需求。
發明概述 在一個方面，本發明提供了獲得自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法。方法包括，在包括有效量的成纖維細胞生長因子(FGF)，優選地是鹼性FGF(bFGF)的培養基中，和在基本上不存在血小板源性生長因子(PDGF)下，培養具有非同步發育階段的異質少突膠質祖細胞群。該方法產生自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，其可以通過下列一種或多種能力而被表徵(1)響應於bFGF的自我更新的增值，不伴有分化，(2)在促細胞分裂原或血清不存在時，終末分化為同質的少突膠質細胞群，(3)在BMP-2存在下，生成同質的2型星性膠質細胞群，(4)去分化，(5)在體外和體內促進髓鞘形成，(6)缺乏分化為1型星形膠質細胞的潛能，和(7)冷凍後融解時，高度生存而不改變細胞特性。
細胞特性的變化是根據這些細胞的具體性質確定的，例如自我更新的增殖能力，這與多潛能幹細胞相同，和在被回收時具有高度生存而不改變細胞特性的情況下，儲存具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的能力，這基於這些細胞的具體性質，包括對凍融處理的高度耐受性。
本發明也包括，可以被限制在單一分化系中的自我更新的，具有同步發育階段的表型同質的少突膠質祖細胞群。例如，這種細胞可以被限制為，全部細胞群分化為單一譜系(single lineage)，如分化為成熟的少突膠質細胞或2型星形膠質細胞。
在本發明的另一方面，自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群也可以被無限期地維持在培養物中。因此，本發明也提供了獲取、維持和在培養物中無限期地保存自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法，包括，在包括有效量的FGF，優選地是bFGF的培養基中，和在基本上不存在PDGF下，培養具有同步發育階段的同質少突膠質祖細胞群。
本發明也提供了保存可存活的、冷凍的、未分化的、和同質的少突膠質祖細胞的方法，這是通過在帶有或不帶有促細胞分裂劑的冷凍培養基中冷凍少突膠質祖細胞實施的。一旦融解，少突膠質細胞以高度生存被回收，並且保有它們冷凍之前擁有的相同的表型特徵和發育特徵。
本發明方法獲得的少突膠質祖細胞可以被用來在不存在促細胞分裂劑或血清下，生成同質的和同步的成熟少突膠質細胞群，並具有髓鞘化神經元軸突的能力。本發明方法獲得的少突膠質祖細胞也可以被用來生成同質的2型星形膠質細胞群，其在特殊促有絲分裂劑，如骨形態形成蛋白(BMP-2)和BMP-4的存在下，缺乏增殖能力。本發明的少突膠質祖細胞進一步地不生成1型星形膠質細胞。
本發明進一步提供了獲得同質的去分化少突膠質祖細胞群的方法，所述細胞在發育上和表型上，其階段早於最初被分離的少突膠質祖細胞。該方法包括，在含有促進去分化的至少一種因子的培養基中，培養少突膠質祖細胞，或具有同步發育階段的同質少突膠質祖細胞群。促進去分化的因子可以是bFGF、PDGF、NT-3、或其它生長因子中的一種或多種。去分化的少突膠質祖細胞(或具有同步發育階段的同質的去分化少突膠質細胞群)能夠再分化為少突膠質細胞和2型星形膠質細胞。
本發明進一步提供了獲得自我更新的，表型同質的增殖少突膠質祖細胞群的方法，所述細胞在發育上和表型上，其階段晚於最初分離的少突膠質祖細胞。該方法包括，在含有至少一種促進向更分化階段發育的因子的培養基中，培養少突膠質祖細胞，或具有同步發育階段的同質少突膠質祖細胞群。該更分化階段進一步由處於更分化階段中的細胞的增殖能力所標誌。促進更分化增殖階段的因子，可以是較低劑量的bFGF或其它生長因子。
本發明的自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群提供了系統，用於篩選影響少突膠質細胞生物學功能和/或分化狀態的化合物。因此，本發明進一步提供了篩選化合物的方法，方法包括，用檢測化合物接觸自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，和檢測少突膠質祖細胞和/或培養基的變化。變化可以是少突膠質祖細胞的任何特徵和/或培養基中任意物質水平的增加或減少。該特徵可以是，例如，下列中的一種或多種變化髓鞘形成，分化為少突膠質細胞或2型星形膠質細胞，增殖速度，細胞遷移，存活能力，基因表達，蛋白表達，培養基中的蛋白水平，去分化或細胞形態學。
本發明的自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群也用於治療患者，如用於細胞治療。患者可以患有或具有髓鞘退化或損傷引起的神經系統病理狀態。本發明提供了治療患者的方法，包括給予患者治療有效量的本發明的少突膠質祖細胞。在本發明的一種實施方案中，少突膠質祖細胞可以含有指導所需基因在患者中表達的核酸載體或生物學載體。
附圖簡述


圖1是中樞神經系統(CNS)中各種細胞類型的圖示，由發育標記物和細胞形態學所標誌。
圖2是同質的和發育同步的大鼠少突膠質祖細胞群的相差照片。
圖3是同質的和發育同步的人少突膠質祖細胞群的相差照片。
圖4顯示了O4(+)O1(+)少突膠質祖細胞的相差照片和螢光成像照片，所述細胞用Cy-3連接的抗-O4抗體或Cy-3連接的抗-O1抗體進行免疫組織化學染色。
圖5A-5C是少突膠質細胞的照片。圖5A和5B分別是大鼠和人少突膠質細胞的相差照片。圖5C顯示了人少突膠質細胞的相差照片，和用Cy-3連接的抗-O1抗體與FITC-連接的抗-MBP抗體雙染色的同一少突膠質細胞。
圖6A和6B是分化為2型星形膠質細胞的大鼠少突膠質祖細胞的照片。圖6A是2型星形膠質細胞的相差照片，圖6B是相同細胞的螢光成像照片，顯示了膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達。
圖7A-7D是從O4(+)O1(+)少突膠質祖細胞產生的細胞的照片。圖7A顯示了O4(+)O1(+)少突膠質祖細胞的相差照片，和與Cy3-連接的抗-GFAP接觸的該細胞的螢光成像照片。圖7B顯示了從O4(+)O1(+)祖細胞去分化的O4(+)O1(-)細胞的相差照片(上部的圖)，和與Cy3-連接的抗-O4抗體(左下圖)和Cy3-連接的抗-O1抗體(右下圖)接觸的該細胞的螢光成像照片。圖7C顯示了從O4(+)O1(-)祖細胞去分化的O4(-)O1(-)細胞的相差照片(上部的圖)，和與Cy3-連接的抗-O4抗體(左下圖)和Cy3-連接的抗-O1抗體(右下圖)接觸的該細胞的螢光成像照片。圖7D顯示了從去分化的O4(-)O1(-)祖細胞生成的2型星形膠質細胞的相差照片，和與Cy3-連接的抗-GFAP接觸的2型星形膠質細胞的螢光成像照片。
圖8A-8C是大鼠少突膠質祖細胞的照片，其已分化為成熟的少突膠質細胞並且顯示了圍繞人脊髓背根神經節(DRG)神經元軸突的髓鞘形成。圖8A是帶有DRG的分化細胞的相差照片；圖8B是相同細胞的螢光成像照片，用檢測神經元的FITC-連接的抗-神經絲200KD抗體免疫組織化學染色；和圖8C是相同細胞的螢光成像照片，用Cy3-連接的抗-O1抗體免疫組織化學染色，以檢測少突膠質細胞。
發明詳述
多能神經上皮幹細胞(NSC)被認為生成中樞神經系統(CNS)的所有細胞。這些細胞被廣義地歸類為神經元或神經膠質細胞。神經膠質細胞進一步被細分為星形膠質細胞和少突膠質細胞。發育標誌(developmental markers)的順序表達，將該譜系分為不同的表型階段，所述標誌的表達由一組細胞特異性抗體鑑定。也通過其增殖能力、遷移能力和形態學的顯著變化表徵細胞。圖1顯示了發育標誌和細胞形態學所表徵的不同細胞類型的圖示。這些標誌物中的一些詳述如下。
巢蛋白。巢蛋白是特異表達在神經上皮幹細胞(NSCs)上的蛋白質，並從而將它們和神經管中的其它更分化的細胞區分開來(Lendahl等，Cell 60585-595，1990)。神經膠質祖細胞也表達巢蛋白。在培養物中，在增殖著的少突膠質細胞祖細胞中觀察到高水平的巢蛋白，但是該蛋白在分化的少突膠質細胞中下調(Gallo等，J.Neurosci.15394-406，1995)。
A2B5。在體內，在神經元和神經膠質細胞上均表達單克隆抗體A2B5識別的抗原(Eisenbarth等，PNAS 764913-4917，1979)，並且所述抗原被用在少突膠質細胞培養物中，跟隨少突膠質祖細胞的成熟。隨著細胞分化為成熟的少突膠質細胞時，A2B5抗原開始下調。
O4。單克隆抗體O4(Sommer等，Dev Biol 83311-327，1981)標記少突膠質細胞成熟中的特殊的前少突膠質細胞階段(preoligodendrocyte stage)。當細胞和單克隆抗體O4結合時，認為該細胞是O4(+)。當細胞和該單克隆抗體不結合時，認為細胞是O4(-)。O4標誌的作用在下面詳述。
糖脂。少突膠質細胞和髓鞘中存在特殊的糖脂，如半乳糖苷神經醯胺(GalC)(半乳糖腦苷脂)和硫酸半乳糖基醯基鞘氨醇(硫苷脂)。半乳糖苷神經醯胺和硫酸半乳糖基醯基鞘氨醇是少突膠質祖細胞上的早期標誌物，它在培養物中和在體內，仍然存在於成熟少突膠質細胞的表面(Pfeiffer等，Trends Cell Biol 3191-197，1993；Raff等，Brain Res 174283-308，1979；Zalc等，Brain Res 211341-354，1981)。用於鑑定半乳糖腦苷脂的主要抗體是O1(Sommer等，Dev Biol 83311-327，1981)。因此，表達GalC的細胞通常被指定為O1(+)。
神經節苷脂GD3。在體外，GD3被高度表達在少突膠質祖細胞上，隨著細胞成熟，GD3表達消失(Hardy等，Development 1111061-1080，1991)。在體內，GD3也被表達在其它神經膠質細胞類型中，如不成熟的神經外胚層細胞，神經元和星形膠質細胞亞群，休眠的阿米巴樣小膠質細胞，和活性小膠質細胞。
PSA-NCAM。胚胎多唾液酸化形式的神經細胞粘附分子PSA-NCAM的表達被認為，對於調節和維持神經結構改變如遷移、軸突生長是重要的，對於可塑性也是重要的(Cremer等，Int.J.Dev.Neurosci.18213-220，2000)。PSA-NCAM的表達和GD3表達缺失共同表徵了少突膠質祖細胞從其產生的前體階段(Hardy等，Development 1111061-1080，1991；Grinspan等，J.Neurosci Res 41540-545，1995)。
髓鞘鹼性蛋白(MBP)和蛋白脂質蛋白(PLP)。髓鞘蛋白，其構成髓鞘重量的30％，是髓鞘和少突膠質細胞的特異成分。主要的CNS髓鞘蛋白MBP和PLP是低分子量蛋白質並構成總髓鞘蛋白的大約80％。因此，MBP和PLP是表徵成熟少突膠質細胞的特異標誌物。
膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)。星形膠質細胞包含中間纖維，被稱為膠質絲，它是GFAP聚合物，可以用抗GFAP抗體經免疫組織化學技術在組織切片中和CNS的培養物中容易地進行鑑定。已知存在兩種不同類型的GFAP+星形膠質細胞1型星形膠質細胞(T1As)具有成纖維細胞樣形態，在培養物中增殖，特別響應於表皮生長因子(EGF)，並且不結合於A2B5抗體；2型星形膠質細胞(T2As)在形態上類似於神經元或少突膠質細胞，在培養物中很少發生分裂，並且結合於A2B5抗體。2型星形膠質細胞似乎是從A2B5+，GFAP-祖細胞發育而來的，其在培養物中迅速獲取GFAP(Raff等，J.Neurosci.31289-1300，1983)。星形膠質細胞的這兩種類型在培養物中不從一種類型轉變為另一種類型。出處同上。
許多特徵將少突膠質細胞和星形膠質細胞區分開來。具體地，少突膠質細胞的體積更小，細胞質和細胞核均具有更高的密度，細胞質中缺乏中間纖維(原纖維)和糖原，和具有大量的微管(在Peters等，The Fine Structure of the Nervous Systemthe Neuronand the Supporting Cells.Oxford，UKOxford Univ.Press，1991中綜述)。少突膠質細胞可以有許多細胞伸展或突起，每一伸展或突起接觸並重複包繞一段軸突，該多螺旋的成膜髓鞘隨後濃縮。在相同的軸突上，鄰近的髓鞘片段屬於不同的少突膠質細胞，每一髓鞘單位在郎飛節附近終止(Bunge等，J.Cell Biol.12448-459，1962；Bunge，Physiol Rev 48197-210，1968)。
在少突膠質細胞最終成熟為髓鞘形成細胞之前，少突膠質細胞經過許多發育階段，這些發育階段由特異細胞表面受體的表達和對不同生長因子的響應所限定。最確定的少突膠質祖細胞是A2B5(+)O4(-)少突膠質細胞2型星形膠質細胞(O-2A)祖細胞(Noble等，Glia 15222-230，1995；Raff，Science 2431450-1455，1989；Miller，Trends Neurosci 1992-96，1996；Richardson等，Semin.Neurosci.2445-454，1990)。O-2A祖細胞能夠在體外分化為少突膠質細胞和2型星形膠質細胞，但不分化為1型星形膠質細胞。因此，O-2A祖細胞被認為是雙潛能的(bipotential)。在生長因子存在下，O-2A祖細胞在體外可以被誘導，經歷自我更新或增殖。例如，在PDGF和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)均存在下的生長刺激持續自我更新而不分化(Bogler等，PNAS 876368-6372，1990)，而在血小板源生長因子(PDGF)存在下的生長和少突膠質細胞的自我更新及產生均有關聯(Richardson等，Cell53309-319，1988；Raff等，Nature 333562-565，1988；Noble等，Nature 333560-562，1988)。特別地，當在含有作為唯一加入的外源性生長因子bFGF的培養基中培養O-2A祖細胞時，O-2A細胞經歷成熟前少突膠質細胞分化。出處同上。用10％胎牛血清處理時，O-2A祖細胞也可以被誘導分化為2型星形膠質細胞(Raff等，Nature 303390-396，1983)。
在形態學上，O-2A祖細胞通常是雙極的(有兩個主要的細胞伸展)。隨著O-2A細胞的成熟，它們變為多極，運動減少，但仍然是和單克隆抗體O4反應的增殖細胞。這隨後是短暫的發育階段，前-GalC。這些O-2A-後(post-O-2A)但是少突膠質細胞前(pre-oligodendrocyte)的細胞被統稱為A2B5(+)O4(+)O1(-)細胞。終末分化，即不成熟的少突膠質細胞階段的發生，由半乳糖苷神經醯胺(GalC)的合成並轉運至表面而確定，該半乳糖苷神經醯胺對單克隆抗體O1起反應。典型地延遲一天或兩天之後，成熟的少突膠質細胞發育，伴隨終末標誌物如髓鞘鹼性蛋白(MBP)和蛋白脂質蛋白(PLP)的可調型表達，以及髓鞘膜的合成。儘管大多數對O-2A祖細胞和它們更分化的少突膠質細胞的研究是從齧齒動物分離並研究的，但在人胎腦中也鑑定了雙極O-2A細胞，多極A2B5(+)O4(+)細胞，和成熟的O(+)少突膠質細胞(Rivkin等，Ann Neurol 3892-101，1995)。
最近，其它少突膠質祖細胞得到鑑定。已經從大鼠脊髓分離出稱作膠質限制前體細胞(GRP)的三潛能祖細胞，並且發現該細胞不同於雙潛能O-2A祖細胞(Rao等，PNAS 953996-4001，1998；Rao等，Dev Biol 18848-63，1997)。類似O-2A祖細胞，GRPs是A2B5(+)免疫反應細胞並不能分化為神經元祖細胞或神經元。與O-2A細胞不一樣，GFRs能夠分化為少突膠質細胞和兩種類型的星形膠質細胞，1型(A2B5(-)GFAP(+))和2型(A2B5(+)GFAP(+))。而且，新鮮分離的GRPs對PDGF無響應，這與O-2A細胞不同。然而，在含bFGF和PDGF的培養基中生長几天之後，GRP細胞可以獲得響應於PDGF的能力。在形態學上，GRP細胞是單極或雙極的。最近已經證明，在PDGF和甲狀腺激素(TH)存在下生長時，GRP細胞可以產生O-2A祖細胞(Gregori等，J Neurosci 22248-256，2002)，並從而構成最早鑑定的膠質限制細胞。
稱為寡球體(oligospheres)的另一類神經膠質祖細胞，已經被鑑定。寡球體是浮遊的細胞集合體，該集合體被認為包括A2B5免疫反應細胞(Avellana-Adalid等，J Neurosci Res 1558-570，1996)。寡球體最初是從大鼠新生腦中分離的(Avellana-Adalid等，J Neurosci Res 1558-570，1996)，但後來也從成年大鼠(Zhang等，PNAS 964089-4094，1999)、犬科動物(Zhang等，JNeurosci Res 54181-190，1998)和胚胎幹細胞(Brustle等，Science 285754-756，1999；Mujtaba等，Dev Biol 214113-127，1999；Liu等，PNAS 976126-5131，2000)分離。寡球體在培養中分裂，並作為未分化細胞的浮遊球繁殖。寡球體通過離解和附著被誘導分化。一旦分化，寡球體產生少突膠質細胞和星形膠質細胞。出處同上。儘管這些星形膠質細胞的表型未被表徵，但推測它們是1型星形膠質細胞(Lee等，Glia 30105-121，2000)。因此，這提示，寡球體和O-2A祖細胞是不同的細胞。
僅在神經細胞之外看，胚胎幹(ES)細胞是哺乳動物中存在的最早的全能細胞，並也可以用作神經上皮幹細胞來源，其隨後可以產生神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞。實際上，移植入創傷損害脊髓的ES細胞證明，移植的ES細胞生存並分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元(McDonald等，Nature Med.51410-1412，1999)。其它實驗從ES細胞分離寡球體並將寡球體移植入髓鞘缺失突變小鼠的脊髓中。ES-來源的寡球體似乎遷移進入宿主組織，產生髓鞘，和髓鞘化宿主軸突(Liu等，PNAS 976126-6131，2000)。然而，胚胎組織的應用日益變得有爭議。
從少突膠質祖細胞發育而來的少突膠質細胞是高度可調的，並且仍然是涉及各種環境因素的相對未定過程。實際上，多能細胞分化為膠質限制細胞(成神經膠質細胞)的能力，以及成神經膠質細胞進一步分化為少突膠質細胞或星形膠質細胞的能力，似乎由各種生長因子和轉錄因子所調節。在Collarini等，J Cell Sci(Suppl)15117-123，1991；McMorris等，Brain Pathol 6313-329，1996；Lee等，Glia 30105-121，2000；Baumann等，Physiol Rev81871-927，2001中綜述了體內和體外的許多認為重要的分子。這些包括但不限於，血小板源生長因子(PDGF)，鹼性FGF(bFGF)，胰島素樣生長因子I(IGF-1)，神經營養蛋白-3(NT-3)，神經膠質生長因子(GGF或神經調節蛋白)，睫狀神經細胞營養因子(CNTF)，白介素-6(IL-6)，轉化生長因子(TGF)，IL-2，三碘甲腺原氨酸(T3)，視黃酸(RA)，cAMP，生長可調的原癌基因-α(growth-regulated oncogene-alpha)(GRO-α)和各種激素。這些中的一些詳細論述如下。
血小板源生長因子(PDGF)。PDGF已經被鑑定為神經膠質細胞增殖以及分化為少突膠質細胞的重要生長因子，由星形膠質細胞和神經元在發育期間產生。PDGF可能在發育期間起重要作用，因為PDGF-A無效小鼠顯示了原始少突膠質細胞代的大的降低，儘管原始少突膠質細胞代並不完全缺失(Fruttiger等，Development 126457-467，1999)。然而，在多能神經上皮細胞和新鮮分離的GRP細胞中，均未觀察到PDGF受體α(PDGRR-α)(Rao等，PANS 953996-4001，1998)。因此，PDGF可能在發育的較晚階段起作用，而不是在多能神經上皮細胞產生更多限制膠質前體細胞的起始階段。
在體外，PDGF增強O-2A細胞的增殖和運動性(McKinnon等，Glia 7245-254，1993；Noble等，Nature 333560-562，1988；Raff等，Nature 333562-565，1988；Richardson等，Cell 53309-319，1988)，並且在體內，用作新生成少突膠質細胞的存活因子(Barres等，Cell 7031-46，1993)。在PDGF和其它環境信號不存在時，祖細胞在成熟前停止分裂並唯一地分化為少突膠質細胞(Temple等，Nature 313223-225，1985；Raff等，Nature 333562-565，1988)。然而，儘管存在PDGF，在細胞內固有的計時機理引起O-2A祖細胞停止分裂之前，O-2A祖細胞僅分裂有限的次數並分化為少突膠質細胞(Raff等，Nature 333562-565，1988)。
鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF-2)。bFGF刺激存培養物中發育的少突膠質細胞的增殖(Eccleston等，Brain Res 210315-318，1984；Saneto等，PNAS 823509-3515，1985；Besnard等，Neurosci Lett 73287-292，1987；Besnard等，Iht J Dev Neurosci 7401-409，1989；Behar等，J Neurosci Res 21168-180，1988)，也刺激少突膠質祖細胞增殖，所述祖細胞增殖在分裂數目或時期上具有限制的增殖能力，同時防止分化為少突膠質細胞(McKinnon等，Ann N.Y.Acad Sci 638378-386，1991；McKinnon等，Glia 7245-254，1993；Qian等，Neuron 1881-93，1997)。bFGF通過上調PDGF-α的表達並因而增加發育期起作用，在所述發育期內，少突膠質細胞祖先或前少突膠質細胞能夠響應於PDGF(McKinnon等，Neuron 5603-614，990)。實際上，已經顯示，單獨暴露於bFGF時，O-2A細胞經歷成熟前分化為少突膠質細胞，但不被誘導變成自我更新的少突膠質祖細胞。當暴露於bFGF和PDGF的組合時，O-2A細胞被誘導經歷持續的自我更新(Bogler等，PNAS 876368-6372，1990)。相似地，在bFGF和PDGF存在下，三潛能神經膠質祖細胞被誘導經歷自我更新(Rao等，PNAS 953996-4001，1998)。
神經營養蛋白-3(NT-3)。NT-3是神經生長因子家族成員，並且似乎僅當和高水平胰島素、PDGF或其它組合一起加入時，刺激少突膠質祖細胞的增殖(Barde，Nature 367371-375，1994；Barres等，Neuron 12935-942，1994)。NT-3也促進少突膠質細胞的體外存活(Barde，Nature 367371-375，1994；Barres等，Cell 7031-46，1992)。
睫狀神經細胞營養因子(CNTF)。CNTF是在結構上和功能上與造血細胞因子家族相似的細胞因子。用CNTF處理神經膠質祖細胞可以誘導少突膠質細胞的出現(Mayer等，Development 120143-153，1994；Barres等，Mol Cell Neurosci 8146-156，1996，Lachyankar等，Exp Neurol 144350-360，1997)。研究提示，為了刺激少突膠質細胞分化，CNTF需要PDGF存在(Engel等，Glia 1616-26，1996；Fruttiger等，Development 126457-467，1999)。
也存在CNGF可以刺激2型星形膠質細胞從O-2A祖細胞產生的證據。然而，CNGF本身不足以誘導2型星形膠質細胞的發育。實際上，可能通過模擬胎牛血清的效應，與細胞外基質相關的分子和CNTF協作(Lillien等，J Cell Biol 111635-644，1990)，這已顯示為誘導2型星形膠質細胞在體外分化(Raff等，Nature 303390-396，1983；Temple等，Nature 313223-225，1985)。
三碘甲腺原氨酸(T3)。甲狀腺素T3能夠維持少突膠質祖細胞增殖以及刺激它們分化為成熟的少突膠質細胞(Barres等，Development 1201097-1108，1994；Ibarrola等，DevBiol 1801-21，1996；Baas等，Glia 19324-332，1997)。
生長可調的原癌基因-α(GRO-α)。(GRO-α)也是一種細胞因子，被顯示為促進少突膠質祖細胞的增殖(Robinson等，JNeurosci 1810457-10463，1998)。
視黃酸(RA)和cAMP。cAMP和視黃酸似乎調節少突膠質祖細胞的分化(Raible等，Dev Biol 133437-446，1993；Noll等，Development 120649-660，1994)。
神經膠質生長因子(GGF或神經調節蛋白)。GGF是另一種生長因子，已經顯示，其刺激少突膠質祖細胞的增殖和存活(Canoll等，Neuron 17229-243，1996)。
令人感興趣的是，觀察到更分化的細胞向較少分化的細胞的一些逆轉，表明CNS的一些細胞擁有一些可塑性。例如，Canoll等觀察到，通過用GGF(神經膠質生長因子)處理具有表型O1(+)MBP(+)的成熟少突膠質細胞，降低了表達成熟標誌物O1和MBP的細胞數目(Canoll等，Mol Cell Neurosci.1379-94，1999)。這種表型逆轉也被細胞形態學的變化、中間絲蛋白巢蛋白的再表達和肌動蛋白細胞骨架的重組所表徵。也顯示，鹼性FGF降低培養基中成熟少突膠質細胞的數目(Fressinaud等，J.Neurosci.Res.40285-293，1995；Hoffman等，Glia 1433-42，1995；Grinspan等，J.Neurosci.Res.46456-464，1996)。然而，所有研究顯示成熟少突膠質細胞的逆轉而不是少突膠質祖細胞的逆轉，並且也沒能得到同質的去分化細胞群。而且，一些證據表明，bFGF可以觸發成熟少突膠質細胞的細胞程序死亡(Muir等，J.Neurosci.Res.441-11，1996)。另一研究說明，2型星形膠質細胞可以回復為具有圍產期少突膠質祖細胞雙極形態特徵的細胞(Kondo等，Science 2891754-1757，2000)。Gard和Pfeiffer觀察到，在PDGF存在下，O4(+)O1(-)祖細胞可以短暫地回復為A2B5(+)O4(-)表型。然而，回復的表型不能維持，原因是細胞迅速地再分化為O4(+)O1(-)表型，並且在其後不久，分化為O1(+)少突膠質細胞(Gard等，Dev.Biol.159618-630，1993)。
儘管有體現在這些不同研究中的工作，但還未曾報導獲得、維持和存儲表型同質的自我更新少突膠質祖細胞群的方法，所述細胞在發育階段上是同步的。由於它們能夠自我更新，能夠增殖，能夠最終分化為少突膠質細胞，並且在表型上同質，發育階段同步，因此這些細胞在治療各種CNS疾病和病理狀態中是有用的，並且在體外和體內研究該疾病和病理狀態中是有用的，本發明提供了這些細胞。
在進一步描述本發明之前，應該理解，本發明不限於描述的具體實施方案。也應該理解，此處應用的術語僅是為了描述具體實施方案的目的，並不意欲限制，因為本發明的範圍僅由所附權利要求限制。
在提供數值範圍處，應該理解，居間值包含在本發明中。這些較小範圍的上下限獨立地被包含在較小的範圍內，也包含在本發明中，容易受到陳述範圍中極限值的任何具體排除。在陳述範圍包含一個或兩個極限值時，排除了任意一個或兩個所包含極限值的範圍，也包括在本發明中。
如無另外定義，此處所用的所有技術術語和科學術語，具有本發明所屬領域的普通技術人員普遍理解的相同意義。儘管在本發明實踐或實驗中，可以應用與此處描述相似或等價的任何方法和物質，但一些方法和物質在此被描述。此處提及的所有出版物在此引入，作為參考，以公開和描述與出版物引用的方法和物質有關的方法和/或物質。
必須指出，如此處和所附權利要求中所用，除非上下文清楚地另外指明，單數形式「一個(a)」、「或(or)」、和「那個(the)」包括複數指示物。
進一步地，如無另外指明，用在說明書和權利要求書中表示組分量、反應條件等的所有數值，將被理解為，在所有情況下由詞語「大約」修飾。因此，如無相反指明，說明書和權利要求中闡明的數字參數是近似值，可以根據本發明欲獲得的所需性質加以改變。
雖然闡明了本發明寬範圍的數值和參數是近似值，但具體實施例中的數值儘可能精確地報導。然而，任何數值固有地包括一些從各實驗測定中發現的標準誤必然產生的誤差。
如此處所應用，「表型同質群(phenotypically homogeneouspopulation)」和「具有同步發育階段(having a synchronizeddevelopmental stage)」是指基本上顯示相同表型和發育階段的細胞群。這樣的同質群可以包括多於大約90％的基本上相同的細胞，或至少大約92％、94％、96％、98％、99％、99.9％或100％的基本上相同的細胞。
「少突膠質祖細胞(oligodendrocyte precursor cell)」或「少突膠質祖細胞(oligodendrocyte progenitor cell)」在此用於描述一種細胞，其還未曾分化為成熟的少突膠質細胞，而具有分化為少突膠質細胞的潛能。在本發明的一種實施方案中，少突膠質祖細胞具有分化為2型星形膠質細胞的潛能。在另一種實施方案中，本發明的少突膠質細胞前體不分化為1型星形膠質細胞。在又一種實施方案中，少突膠質祖細胞可以由表型A2B5(+)O4(-)O1(-)；A2B5(+)O4(+)O1(-)；或A2B5(+)O4(+)O1(+)所表徵。A2B5、O4和O1分別指與抗體A2B5、O4和O1反應的蛋白的表面標誌表達。
相似地，在發育階段的同質性或同步性，可以通過細胞產生更分化細胞所使用的時間值確定。例如，少突膠質祖細胞同質群可以被誘導分化為少突膠質細胞同質群。少突膠質祖細胞異質群可以在不同的期間內被誘導分化為表型上異質的少突膠質細胞群，或分化為另一種細胞表型，如2型星形膠質細胞。如果該群包括發育上同步的少突膠質祖細胞，則具有進一步發育階段的少突膠質細胞或少突膠質祖細胞在相似的時間期間產生。如果該群包括發育上異步(或不同步)的少突膠質祖細胞，則少突膠質細胞可以在不同的時間期間產生。
可由此獲得本發明的少突膠質祖細胞的組織或細胞可以是任何胎兒的，青少年的或成人的神經組織，包括來自海馬、小腦、脊髓、皮質、紋狀體、基底前腦、腹側中腦、藍斑和下丘腦的組織。也可以從胚胎幹細胞獲得本發明的少突膠質祖細胞。而且，可以從任何哺乳動物種類獲得組織或細胞，包括齧齒動物、人、非人靈長類、馬科動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、豬科動物、綿羊科動物、兔形動物，和類似物。
可以從上述任一來源和通過本領域已知的任意方法，獲得包括少突膠質祖細胞的異質細胞群。例如，Gard等描述了間接免疫黏附分離法(immunopanning method)，通過該方法，可以獲得各種發育階段的A2B5(+)O4(+)O1(-)祖細胞(Gard等，Neuroprotocols 2209-218，1993)。可以改進間接免疫黏附分離法，以獲得A2B5(+)O4(-)祖細胞。McCarthy等也描述了用於獲得星形膠質細胞或少突膠質細胞培養物的細胞培養方法(McCarthy等，J.Cell Biol.85890-902，1980)。也可以應用本領域中已知的其它方法。
本發明提供了用於獲得自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法。方法包括，在含有有效量的成纖維細胞生長因子(FGF)的培養基中，培養具有非同步發育階段的異質少突膠質祖細胞群，直至獲得具有同步發育階段的少突膠質祖細胞同質群。FGF可以是FGF家族成員，選自FGF1、2、4、5、6、8b、9、10和17。優選的家族成員包括FGF2、4、6、8b、9和17。最優選的是FGF2，也被稱為鹼性FGF(bFGF)。「有效量的FGF」是指有效誘導同步發育階段並支持細胞存活、自我更新、和/或增殖的FGF家族成員的量。
在一種實施方案中，培養基可以包括濃度為大約0.1ng/ml至大約40ng/ml之間的FGF。優選地，FGF的濃度是至少大約0.1ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml或40ng/ml。在本發明的實施方案中，培養基中的FGF濃度可以是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。在另一種實施方案中，FGF濃度可以是大約1至大約10ng/ml。在又一種實施方案中，FGF濃度可以是大約2.5至大約7.5ng/ml。優選地，FGF濃度是大約5ng/ml。優選地，培養基中應用的FGF是bFGF。當應用其它FGF家族成員替代bFGF或應用除bFGF外的其它FGF家族成員時，也可以使用與應用bFGF時相同的濃度。
在本發明的一種實施方案中，培養基包括有效量的FGF，基本上不存在血小板源生長因子(PDGF)。在本發明的優選實施方案中，培養基包括有效量的bFGF，基本上不存在血小板源生長因子(PDGF)。如上所解釋，「有效量的FGF」是指，有效誘導同步發育階段並足以支持細胞存活、自我更新、和/或增殖的FGF的量。
「基本上不存在PDGF」(substantial absence of PDGF)是指在培養基中不存在PDGF。優選地，培養基中的PDGF少於大約0.1ng/ml。更優選地，培養基中的PDGF少於大約0.01ng/ml。最優選地，培養基中的PDGF少於大約0.001ng/ml。應該理解，PDGF可以由培養細胞內源產生，因而，培養基完全不存在PDGF是不可能的。因此，在本發明的一種實施方案中，培養基可以包括有效量的bFGF和痕量的PDGF，所述痕量PDGF對存活、自我更新和/或增殖沒有影響。選擇地，培養基可以包括有效量的bFGF，其可以刺激內源性PDGF由培養細胞產生。
在本發明的一種實施方案中，獲得自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法包括一個或多個培養步驟，這發生在含有有效量bFGF並基本上不存在PDGF的培養基中，培養包括少突膠質祖細胞的異質細胞群之前。例如，間接免疫黏附分離法獲得的A2B5(+)O4(-)細胞最初可以被培養在含有PDGF和bFGF，及任何其它生長因子的培養基中。當細胞被轉換到包括bFGF、基本上不存在PDGF的培養基中時，細胞通常將仍是異質的，這在於它們在表型上和/或發育上是不同步的。
根據本發明方法獲得的，自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群擁有下列特徵中的一個或多個。例如，該細胞可響應於bFGF而增殖或自我更新，而沒有可觀察到的分化以及在培養基中沒有加入的PDGF。對於少突膠質祖細胞，使用術語「增殖」(proliferate)和「自我更新」(self-renewing)，是指擁有持續細胞分裂能力而最終的細胞沒有表型變化的細胞。實際上，如下面的實施例所顯示，已經分離出獨特的自我更新的、具有同步發育階段的表型同質細胞群，所述細胞群單獨響應於bFGF，能夠無限增殖而不分化。本發明的細胞已經被持續培養多於一年。因此，如此處所應用，提及細胞在長期培養中增殖是指培養至少一年。
作為另一個例子，由於獲得的少突膠質祖細胞是同質的，它們能夠產生少突膠質細胞或2型星形膠質細胞的同質群。可以用本領域中已知的任何方法，誘導本發明的少突膠質祖細胞，產生少突膠質細胞，所述方法如，通過在沒有任何外源加入的生長因子的無血清培養基中培養細胞，或在含有睫狀神經細胞營養因子(CNTF)和/或甲狀腺激素T3(3，3』，5』-三碘甲腺原氨酸)的培養基中培養細胞。當使用CNTF時，優選的濃度範圍是大約1ng/ml至大約20ng/ml。當應用甲狀腺激素T3時，優選的濃度範圍是大約1μg/ml至大約30μg/ml。可以通過在含有骨形態形成蛋白2(BMP-2)、BMP-4、或10％胎牛血清的培養基中培養細胞，誘導本發明的少突膠質祖細胞，產生2型星形膠質細胞。當使用BMP-2或BMP-4時，優選的濃度範圍是大約1ng/ml至大約20ng/ml。誘導少突膠質祖細胞分化的其它方法是本領域中已知的。
也因為通過本發明方法得到的少突膠質祖細胞是同質的，因此這種細胞群基本上被限制為單一的分化譜系。即，群中所有或基本上所有的少突膠質祖細胞被限制為，發育成少突膠質細胞或2型星形膠質細胞。如此處所應用，「基本上被限制」意味著群中多於大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的少突膠質祖細胞分化為相同的成熟細胞類型。
本發明的自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群也可以被凍融而具有高的存活率，並且在表型和發育變更上沒有任何變化。如此處所應用，高存活率和高度的生存意味著在冷凍和融解之後，存活率大於大約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。細胞可以被冷凍在含有或不含有bFGF的培養基或緩衝液中。一旦融解，細胞保持同質性以及其作為少突膠質祖細胞的狀態。培養基也將包含冷凍保護劑，如5-10％的DMSO或甘油。
本發明的少突膠質祖細胞也可以在此處教導的培養基中，在基本上不存在生長因子如bFGF下被冷凍，和維持冷凍狀態。普通技術人員將理解，本領域中的其它細胞冷凍緩衝液，對於本發明的細胞也會產生可接受的存活水平。
本發明的自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群也能夠產生髓鞘。可以通過共同培養本發明的少突膠質祖細胞和從中樞神經系統得到的神經元而誘導髓鞘形成，所述神經元包括來自海馬、小腦、脊髓、皮質、紋狀體、基底前腦、腹側中腦、藍斑和下丘腦的神經元，或來自周圍神經系統的神經元，包括來自脊髓背根神經節(DRG)的神經元。
自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群也可以以基本上相同的表型和發育狀態，被無限期保持在培養基中。因此，本發明也涉及在培養基中保持自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法。方法包括，在包括有效量FGF的培養基中，培養具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群。培養基可以包括FGF，濃度是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml之間。優選地，FGF的濃度是至少大約0.1ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml或40ng/ml。在本發明的一種實施方案中，培養基中的FGF濃度可以是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。在另一種實施方案中，FGF濃度是大約1ng/ml至大約10ng/ml。在又一種實施方案中，FGF濃度可以是大約2.5至大約7.5ng/ml。優選地，FGF的濃度是大約5ng/ml。優選地，用於培養基中的FGF是bFGF。當使用其它FGF家族成員替代bFGF或使用除bFGF外的其它FGF家族成員時，也可以使用和應用bFGF時相同的濃度。
本發明也涉及將少突膠質祖細胞去分化為發育上或表型上較早狀態的方法。例如，A2B5(+)O4(+)O1(+)祖細胞可以被去分化為A2B5(+)O4(+)O1(-)祖細胞，反過來，其可以被去分化為具有表型A2B5(+)O4(-)的O-2A-樣細胞。能夠分化為少突膠質細胞和2型星形膠質細胞的A2B5(+)O4(-)祖細胞，可以進一步去分化為膠質限制前體細胞樣細胞，其可以具有分化為少突膠質細胞、1型星形膠質細胞和2型星形膠質細胞的能力。該方法包括，在含有至少一種促進去分化的因子的培養基中，培養少突膠質祖細胞。促進去分化的因子包括bFGF、PDGF、神經營養蛋白-3(neutrophin-3)(NT-3)或其它生長因子中一種或多種。
當A2B5(+)O4(+)O1(+)祖細胞被去分化為A2B5(+)O4(+)O1(-)祖細胞時，使用單獨的bFGF，優選地，其濃度是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。
當A2B5(+)O4(+)O1(+)祖細胞被去分化為A2B5(+)O4(-)O1(-)祖細胞時，使用濃度大約0.1ng/ml至大約40ng/ml的bFGF，優選地在生長培養基中帶有PDGF和NT-3。當包括PDGF時，PDGF的濃度優選地是大約1ng/ml至大約50ng/ml。當包括NT-3時，NT-3的濃度優選地是大約1ng/ml至大約10ng/ml。
當A2B5(+)O4(+)O1(-)祖細胞被去分化為A2B5(+)O4(-)祖細胞時，可以僅用PDGF，優選地，其濃度是大約1ng/ml至大約50ng/ml。優選地，將bFGF和NT-3包含在生長培養基中。當包含bFGF時，bFGF的濃度優選地是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。當包含有NT-3時，NT-3的濃度優選地是大約1ng/ml至大約10ng/ml。
本發明的方法能夠產生去分化少突膠質祖細胞的同質群。因此，可以在包括至少上述一種促進去分化的因子的培養基中，培養具有同步發育階段的同質少突膠質祖細胞群。在包括至少上述一種促進去分化的因子的相同培養基中，可以將去分化少突膠質祖細胞的同質群維持在基本上相同的表型和發育狀態中。
本發明的去分化少突膠質祖細胞可以擁有或可以不擁有與天然發現的那些性質相似的性質。例如，本發明的去分化少突膠質祖細胞可以在表型上相似於O-2A祖細胞，其具有表型A2B5(+)O4(-)和雙極形態。而且，去分化少突膠質祖細胞可以是雙潛能的，如同O-2A祖細胞，這在於，它們都能夠分化為少突膠質細胞和2型星形膠質細胞。另一方面，本發明的去分化少突膠質祖細胞對生長因子的反應與O-2A祖細胞不同。例如，通常已知O-2A祖細胞通過生成2型星形膠質細胞，對骨形態形成蛋白(BMP)2或4以及睫狀神經細胞營養因子(CNTF)起響應。本發明的去分化少突膠質祖細胞可以通過生成2型星形膠質細胞對BMP響應，但是對CNTF不響應。
本發明的少突膠質祖細胞進一步涉及篩選化合物的方法，所述化合物影響少突膠質祖細胞的生物學功能和分化狀態。該方法包括，用檢測化合物接觸本發明的少突膠質祖細胞，並檢測少突膠質祖細胞和/或培養基的變化。該變化可以是少突膠質祖細胞任何特徵的增加或減少，例如，髓鞘形成，分化為少突膠質細胞或星形膠質細胞，表面標誌表達，生長特徵如增殖速度、細胞遷移、存活率、表面標誌表達、蛋白釋放、去分化，或細胞形態。其它特徵也可以隨變化而檢測。
檢測化合物可以是任何化學品、蛋白、肽、多肽或核酸(DNA或RNA)。檢測化合物可以是天然發生的或可以是通過本領域中的已知方法合成的。例如，檢測化合物可以是模擬神經遞質、激素或其它神經活化化合物的化合物。檢測化合物也可以是抗體。在本發明的實施方案中，應用本發明的方法，篩選影響髓鞘形成的化合物。
促進髓鞘生成細胞生長和存活的試劑可以被用於各種治療目的。由髓鞘生成細胞產生的髓鞘的退化或損傷所導致的神經系統疾病或病理狀態是很多的。髓鞘丟失由於造成髓鞘的直接損傷而可作為第一事件，或由於造成軸突和神經元的損傷而作為第二事件。第一事件包括神經變性疾病如多發性硬化(MS)、人類免疫缺陷MS-相關的脊髓病、橫貫性脊髓病/脊髓炎、進行性多灶性白質腦病、腦橋中央髓鞘溶解症和髓鞘損傷(如下面對第二事件的描述)。第二事件包括軸突或神經元的各種損害，由下述引起腦或脊髓的身體損害、缺血性疾病、惡性疾病、感染性疾病(如HIV、萊姆病、肺結核、梅毒或皰疹)、變性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病、亨延頓舞蹈病、ALS、視神經炎、感染後腦脊髓炎、腦白質腎上腺萎縮症和腎上腺脊髓神經病)、精神分裂症、營養性疾病/紊亂(如葉酸和維生素B12缺乏、韋尼克病)、系統疾病(如糖尿病、系統性紅斑狼瘡、癌症)、和毒物(如酒精、鉛、溴化乙錠)；以及治療過程如藥物相互作用、放射治療或神經外科治療。
當在體內給予時，本發明的少突膠質祖細胞是安全的，並且能夠遷移入宿主細胞，產生髓鞘和髓鞘化宿主軸突。而且，本發明的少突膠質祖細胞產生的少突膠質細胞能夠生成髓鞘和髓鞘化宿主軸突。因此，本發明提供了治療患者的方法，或為了患者利益的方法，其包括給予患者治療上有效量的本發明的少突膠質祖細胞或少突膠質細胞。如此處所應用，「治療上有效」是指足以減輕疾病症狀的少突膠質祖細胞量，或足以維持或增加患者髓鞘形成的量。技術人員將理解，本發明少突膠質祖細胞的治療有效量將根據被治療的狀態和患者的特徵而不同。
此處的患者被定義為，需要用少突膠質祖細胞或少突膠質細胞治療的任何人或非人動物，或對其治療可能有益處的任何對象，包括人和非人動物。這種欲被治療的非人動物包括所有馴養和野生的脊椎動物。在本發明的一種實施方案中，欲給予的少突膠質祖細胞或少突膠質細胞是從與接受治療的種屬相同的種屬獲得的。哺乳類的例子包括齧齒動物、人、非人靈長類、馬科動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、豬科動物、綿羊科動物、兔形動物和類似物。
治療中應用的少突膠質祖細胞或少突膠質細胞也包括核酸載體或生物載體，其量足以指導所需基因在患者中表達。常規重組核酸載體的構建和表達在本領域中是已知的，包括Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Vols 1-3(2d e d.1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中的那些技術。這種核酸載體可以被包括在生物載體如病毒和細菌中，優選地，包括在非致病或減毒的微生物中，包括減毒的病毒、細菌、寄生蟲和病毒樣顆粒。
核酸載體或生物載體可以通過體外基因治療方案被導入細胞，方案包括從患者切取細胞或組織，將核酸載體或生物載體引入切取的細胞和組織，以及將細胞或組織重新移植入患者(參見，例如，Knoell等，Am.J.Health Syst.Pharm.55899-904，1998；Raymon等，Exp.Neurol.14482-91，1997；Culver等，Hum.GeneTher.1399-410，1990；Kasid等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87473-477，1990)。核酸載體或生物載體可以通過例如，磷酸鈣介導的轉染導入切取的細胞或組織(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb.Virology 52456，1973)。也可以使用將核酸載體導入宿主細胞的其它技術，如電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)。
給予含有核酸載體或生物載體的細胞，可以提供患者不足或無功能的所需基因的表達。這種基因的例子包括那些編碼受體的基因，所述受體對多巴胺、GABA、腎上腺素、去甲腎上腺素、5-羥色胺、穀氨酸鹽、乙醯膽鹼和其它神經肽起響應，以及多巴胺、GABA、腎上腺素、去甲腎上腺素、乙醯膽鹼、γ-氨基丁酸、5-羥色胺、L-DOPA和其它神經肽的基因。細胞也可被設計為產生生長因子，如神經生長因子(NGF)、bFGF、PDGF或CNTF。在另一種實施方案中，核酸載體或生物載體可以編碼反義寡核苷酸。反義寡核苷酸是互補於給定基因「有義」鏈或編碼鏈的小的核酸。它們因此能夠和基因的RNA轉錄產物穩定並特異地雜交，並因而抑制RNA翻譯和從而抑制下遊事件。反義寡核苷酸的應用是本領域已知的。例如，Holt等，Mol.Cell Biol.8963-973，1988已顯示，當與原癌基因c-myc的RNA轉錄產物特異雜交的反義寡核苷酸被加入培養的HL60白血病細胞時，其抑制增殖和誘導分化。相似地，Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863379-3383，1989顯示，與原癌基因c-myb的RNA轉錄產物特異雜交的反義寡核苷酸抑制人骨髓性白血病細胞系的增殖。已知一些腦腫瘤表達原癌基因，如sis、myc、src和n-myc。因此，本發明的細胞可以被設計為，產生靶向並抑制sis、myc、src或n-myc的反義寡核苷酸。然而，上述基因列舉不意欲是窮盡的。本領域的技術人員可以確定用於在患者中表達的其它基因。
本發明的細胞可以通過腦內移植被給予。移植可以包括直接給予細胞進入中樞神經系統或腦室腔(ventricular cavities)，或硬膜下給予到宿主腦的表面上。具體過程可以包括，鑽孔並刺穿硬腦膜，以允許微量調節注射器針插入。選擇地，本發明的細胞可以被鞘內注射入脊髓。這種移植方法對本領域的普通技術人員是已知的，在例如Neural Grafting in the Mammalian CNS，Bjorklund和Stenevi，eds.，(1985)中有描述。實際上，培養基中生長的大鼠少突膠質祖細胞已經被移回動物並顯示出遷移、移入、分化和髓鞘化受體神經纖維(Espinosa de los Monteros等，Dev.Neurosci.1498-104，1992)。
本發明的細胞也可以和其它製劑共同給予，如生長因子、神經節苷脂、抗體、神經遞質、神經激素、毒素、神經突促進分子(neurite promoting molecules)、抗代謝物、和這些分子的前體如多巴胺、L-DOPA的前體。其它製劑可以由本領域的普通技術人員確定。
通過下列實施例說明本發明，但這並不意欲以任何方式加以限制。
實施例1純化大鼠少突膠質祖細胞的同質群
首先，用皮氏培養皿通過連續分離方法，或通過Gard等，Neuroprotocols 2209-218，1993，和McCarthy等，J.Cell Biol.85890-902，1980中描述的間接免疫黏附分離法，從大鼠胚胎脊髓(E14-E19)獲得A2B5(+)O4(-)或A2B5(+)O4(+)細胞。然後，在0.001％聚L-鳥氨酸(poly-L-ornitine)(Sigma)預包被的10cm培養皿(Falcon)上培養細胞，密度是大約20,000-50,000細胞/cm2，位於培養基A中(DMEM/N2(Gibco)；25ng/ml PDGF(RD)；15ng/ml bFGF(RD)；5ng/ml NT-3(RD)；0.05％牛血清(Sigma))。每隔一天更換培養基A，每日補充bFGF。
大約一周後，當板變成分會合(sub-confluent)時，用培養基B(0.125％胰蛋白酶；0.26mM EDTA；Ca(-)Mg(-)漢克氏緩衝鹽溶液(Hank’s Buffered Saline Solution)(Gibco))在37℃下胰酶消化細胞20分鐘。在培養基C(DMEM/B27(Gibco)；10μM 3，3′，5′-三碘甲腺原氨酸(T3)(Sigma)；10ng/ml bFGF)中將胰酶消化的細胞重新鋪板，持續大約一周。
在培養基C中溫育一周的期間，細胞開始從雙極形態(A2B5(+)O4(-))變化為多極形態，多極形態是A2B5(+)O4(+)細胞的特徵。當幾乎所有的細胞獲得類似太陽的多極形態時，用培養基B胰酶消化細胞並在培養基D(DMEM/B27；15-30ng/mlbFGF)中重新鋪板。大約每周胰酶消化細胞並重新鋪板。在培養基D中傳代培養的起始階段期間，細胞中的一些產生2型星形膠質細胞，表明初始細胞群仍然是發育上異質的。儘管增殖的A2B5(+)O4(+)細胞甚至在下一步驟中被誘導，但這些非自我更新的細胞分化為少突膠質細胞或其它表型的細胞，並在有限的增殖數目後和在一個月期間內死亡。此後，一些自我更新的A2B5(+)O4(+)少突膠質祖細胞生成並開始在培養基D中增殖。隨後的傳代培養在培養基D中重複進行一年餘。
在培養基D中傳代培養大約兩月之後，2型星形膠質細胞不再出現，並且，建立了含有多於99.99％(在十個獨立研究中的範圍是99.993-99.999％)的自我更新的、表型同質O4(+)O1(-)少突膠質祖細胞的群。通過在4％低聚甲醛的磷酸鹽緩衝液中固定和用抗O4抗體(Chemicon)及抗O1抗體(Chemicon)染色，計數細胞。在顯微鏡下，每孔(well)八個隨機視區中計數細胞。當細胞持續保持在培養基中時，它們持續增殖，並可以在培養基D中維持狀態良好超過一年(圖2)，而沒有任何表型變化或分化。實際上，它們被傳代培養超過50次並保持超過450天。這些細胞展示了獨特的特徵，正如下面實施例中進一步所說明。
按照布達佩斯條約中的條款，確立的大鼠A2B5(+)O4(+)O1(-)少突膠質祖細胞系被保藏在位於10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209的美國菌種保藏中心，保藏時間是2004年6月21日，指定的保藏編號是PTA 6093。
實施例2純化人少突膠質祖細胞的同質群 首先，通過間接免疫黏附分離法和/或實施例1中描述的培養方法，從胎兒人腦組織和脊髓(9-10周)獲得A2B5(+)O4(-)或A2B5(+)O4(+)細胞。然後，在0.001％聚L-鳥氨酸和0.01％層粘連蛋白預包被的10cm培養皿(Falcon)上培養細胞，密度是大約20,000-50,000細胞/cm2，位於培養基A中(DMEM/N2(Gibco)；25ng/ml PDGF；5ng/ml NT-3)。每日更換培養基A。
大約一周後，當板變得分會合時，用培養基B(0.125％胰蛋白酶；0.26mM EDTA；Ca(-)Mg(-)漢克氏緩衝鹽溶液(Gibco))在37℃下胰酶消化細胞20分鐘。在培養基C(DMEM/B27(Gibco)；10μM 3，3′，5′-三碘甲腺原氨酸(T3)；10ng/ml bFGF)中將胰酶消化的細胞重新鋪板，持續大約一個月。
在培養基C中溫育一個月的期間，細胞開始從雙極形態(A2B5(+)O4(-))變化為多極形態，多極形態是A2B5(+)O4(+)細胞的特徵。當幾乎所有的細胞獲得類似太陽的多極形態，並且增殖的集落響應於bFGF產生時，應用微柱(microcylinder)，用培養基B胰酶消化這些細胞集落並在培養基D(DMEM/B27；15-30ng/ml bFGF)中進行重新鋪板。大約每周，胰酶消化這些細胞並重新鋪板，在培養基D中無限重複傳代培養。在培養基D中傳代培養的起始階段期間，細胞中的一些產生2型星形膠質細胞，表明初始細胞群仍然是發育上異質的。儘管增殖的A2B5(+)O4(+)細胞甚至在下一步驟中被誘導，但這些非自我更新的細胞分化為少突膠質細胞或其它表型的細胞，並在有限的增殖數目後和在一個月期間內死亡。此後，一些自我更新的A2B5(+)O4(+)少突膠質祖細胞生成並開始在培養基D中增殖。隨後的傳代培養在培養基D中重複一年以上。
在培養基D中傳代培養大約一個月之後，2型星形膠質細胞不再出現，並且，建立了含有多於99.99％的O4(+)O1(-)少突膠質祖細胞同質群(圖3)。人少突膠質祖細胞同質群與來自大鼠的少突膠質祖細胞同質群顯示了相似的特徵。
實施例3少突膠質祖細胞可以被凍融 分別根據實施例1和2獲得的大鼠和人少突膠質祖細胞，被冷凍在5-10％DMSO的DMEM/B27培養基中，所述培養基補充有或未補充15ng/ml的bFGF。當細胞被融解並在培養基D中進行培養時，細胞以平均90％的存活率被恢復，在五個獨立實驗中，最大存活率範圍是97-99％。而且，細胞在其物理或功能特徵上，未顯示任何明顯變化，例如同質性、形態、增殖能力、分化能力和去分化能力。當在培養基D中培養時，細胞維持其同質性並持續增殖而不分化。
在基本上不存在生長因子或補充物如bFGF或B27補充物時，在此處教導的培養基中，也可以將根據實施例1和實施例2獲得的少突膠質祖細胞冷凍和維持在冷凍狀態。在融解和培養後，這種細胞也具有高度的生存率(結果未顯示)。技術人員將理解，本領域中已知的其它細胞冷凍緩衝液，對本發明細胞也會產生可接受的存活水平。
實施例4少突膠質祖細胞可以被誘導為增殖的O4(+)O1(+)祖細胞 當在補充有5ng/ml CNTF(RD)和0.5ng/ml bFGF(RD)的DMEM/B27(Gibco)中培養時，分別根據實施例1和2獲得的大鼠和人少突膠質祖細胞，以幾乎100％的效率被誘導為O4(+)O1(+)細胞。圖4顯示，通過用Cy3-連接的抗O4抗體染色，這些細胞是O4(+)，以及通過用Cy3-連接的抗O1抗體染色，這些細胞是O1(+)。正如加入15μg/ml BrdU後，用抗BrdU抗體和抗O1抗體雙染色20小時所測定，O4(+)O1(+)細胞中的大約98％持續增殖而不完全成熟為少突膠質細胞。因此，本發明的方法也提供增殖的O4(+)O1(+)祖細胞同質群。
實施例5少突膠質祖細胞能夠分化為少突膠質細胞 分別根據實施例1和2獲得的大鼠和人少突膠質祖細胞，也能夠分化為少突膠質細胞。將細胞培養在無血清的條件培養基中(補充有N2的DMEM)(Gibco)。一周之後，幾乎所有細胞表達O1和髓磷脂鹼蛋白(MBP)(Chemicon)，其為表達在成熟少突膠質細胞上的標誌物(圖5A、5B和5C)。因此，獲得的少突膠質祖細胞能夠以大約100％的效率被誘導為少突膠質細胞，這提供了以下證據在實施例1和2中分別獲得的大鼠和人少突膠質祖細胞在其發育階段上是完全同步的。
實施例6少突膠質祖細胞能夠分化為星形膠質細胞 根據實施例1獲得的大鼠少突膠質祖細胞，能夠分化為2型星形膠質細胞。當在補充有10ng/ml骨形態形成蛋白(BMP-2)或BMP-4(RD)的DMEM/N2(Gibco)中培養根據實施例1獲得的細胞時，幾乎所有的細胞分化為表達表面標誌膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和A2B5的細胞，GFAP和AB25都是2型星形膠質細胞的特徵(圖6A和6B)。這進一步證明，實施例1獲得的少突膠質祖細胞在其發育階段上是完全同步的。
實施例7少突膠質祖細胞能夠去分化 本發明人驚奇地發現，根據實施例4獲得的O4(+)O1(+)祖細胞可以被誘導，去分化為具有雙極形態的O-2A-樣細胞(O4(-)O1(-))。這些去分化的細胞是雙潛能的，能夠再分化為少突膠質細胞和2型星形膠質細胞(T2As)。
最初，在補充有20ng/ml BMP-2或BMP-4的DMEM/N2中，培養根據實施例4獲得的O4(+)O1(+)祖細胞兩周，但是由於缺乏Cy3-連接的抗-GFAP抗體(Sigma)染色，它們沒有給出任何所示的GFAP(+)-星形膠質細胞(圖7A)。然後，進行胰酶消化細胞並在補充有15ng/ml bFGF的DMEM/N2中進行傳代培養。如細胞染色所證明，一周之後，幾乎所有的細胞回復為O4(+)O1(-)細胞，所述染色是用Cy3-連接的抗-O4抗體進行的，但缺乏Cy3-連接的抗-O1抗體染色(圖7B)。然後，將培養基改變為，補充有25ng/ml PDGF，15ng/ml bFGF和5ng/ml NT3的DMEM/N2並進行培養，在大約一周內，幾乎所有細胞進一步回復為具有雙極形態的O4(-)O1(-)細胞(圖7C)。為了確認O4(-)O1(-)細胞仍然具有雙潛能以再分化，將O4(-)O1(-)細胞放置在通常產生少突膠質細胞或2型星形膠質細胞的條件下。當按照實施例5，在無血清的條件培養基(補充有N2的DMEM)中培養O4(-)O1(-)細胞時，幾乎100％的細胞分化為表達MBP的成熟少突膠質細胞。當在含有10ng/ml骨形態形成蛋白(BMP-2)、10ng/ml BMP-4或10％胎牛血清(FBS)的培養基中培養O4(-)O1(-)細胞時，O4(-)O1(-)細胞以幾乎100％的效率生成2型星形膠質細胞，正如用Cy3-連接的抗-GFAP抗體染色所證明(圖7D)。這對照於O4(+)O1(+)祖細胞，O4(+)O1(+)祖細胞對BMP無響應並僅分化為少突膠質細胞。因此，去分化的O4(-)O1(-)細胞類似於O-2A細胞，在於它們都是雙潛能的，都能夠生成少突膠質細胞和2型星形膠質細胞。
然而，去分化的O4(-)O1(-)細胞不同於O-2A細胞，原因是它們不僅缺乏O4表面標誌，而且它們對至少一種環境因子的響應也不同。例如，已知O-2A細胞響應於CNTF並分化為2型星形膠質細胞。與之對照，本發明的去分化的O4(-)O1(-)細胞對CNTF不起響應。因此，獲得的O4(-)O1(-)細胞可以是不同於O-2A祖細胞的新特徵化的少突膠質祖細胞群。
實施例8少突膠質細胞能夠形成髓鞘 分離人DRG神經元(9-10周)並在補充有10ng/ml CNTF和10ng/ml NGF的DMEM/B27中培養一周。加入根據實施例1獲得的少突膠質祖細胞，神經元∶少突膠質祖細胞的比率是1∶2，共培養兩周以上。用4％低聚甲醛的磷酸鹽緩衝液固定共培養的細胞，然後，用Cy3-連接的抗-O1抗體和FITC-連接的抗-神經絲200kD抗體(Sigma)進行雙染色，其中抗-O1抗體檢測髓鞘，抗-神經絲200kD抗體檢測軸突。多於99％的少突膠質祖細胞分化為成熟的少突膠質細胞，而一些細胞圍繞人DRG神經元的軸突形成髓鞘(圖8A-8C)，與之對照，不和任何少突膠質祖細胞共培養的對照DRG培養物不生成任何O1(+)少突膠質細胞，DRGs也不髓鞘化(結果未顯示)。
根據說明書中引用的參考文獻的教導，本說明書被最全面地得以理解，所有參考文獻以其整體在此併入，作為參考。說明書中的實施方案提供了本發明實施方案的示例，不應理解為限制本發明的範圍。技術人員將認識到，許多其它的實施方案被包含在所要求權利的發明中，並且其意圖是，說明書和實施例僅被認為是示例性的，本發明的真正範圍和精神由所附權利要求指明。
權利要求
1.獲得自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法，所述方法包括，在含有有效誘導同步發育階段的成纖維細胞生長因子(FGF)量的培養基中，培養具有不同步發育階段的異質少突膠質祖細胞群，其中所述培養是在基本上不存在血小板源生長因子(PDGF)下進行的，從而獲得所述自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群。
2.權利要求1所述的方法，其中所述自我更新的同質少突膠質祖細胞群包括，在培養基可以培養至少大約一年而沒有表型變化的少突膠質祖細胞，所述培育基包括有效防止所述表型變化的成纖維細胞生長因子(FGF)量並基本不存在PDGF。
3.權利要求1所述的方法，其中所述異質少突膠質相細胞群的細胞在不同分化方法中具有不同的發育速度，在分化時產生不同表型的細胞，或對周圍的培養條件響應不同。
4.權利要求1所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群在不同分化方法中具有相同的發育速度，在分化時產生相同表型的細胞，或對周圍的培養條件響應方式相同。
5.權利要求1所述的方法，其中所述少突膠質祖細胞的不同步群包括至少兩個少突膠質祖細胞的群，每一群具有不同的發育階段，其中所述發育階段選自A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段，A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段和A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段。
6.權利要求1所述的方法，其中所述少突膠質祖細胞的同步群是具有A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段，A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段或A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段的少突膠質祖細胞群。
7.權利要求1所述的方法，其中所述同質少突膠質細胞群被限制為少突膠質細胞系。
8.權利要求1所述的方法，其中所述FGF選自FGF1、FGF2(鹼性FGF或bFGF)、FGF4、FGF6、FGF8b、FGF9和FGF17。
9.權利要求1所述的方法，其中所述FGF是bFGF。
10.權利要求1或9所述的方法，其中所述FGF的量是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。
11.權利要求10所述的方法，其中所述FGF的量是大約1ng/ml至大約10ng/ml。
12.權利要求11所述的方法，其中所述FGF的量是大約5ng/ml。
13.權利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.1ng/ml。
14.權利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.01ng/ml。
15.權利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.001ng/ml。
16.權利要求1所述的方法，其中所述異質少突膠質祖細胞群是從哺乳動物獲得，所述哺乳動物選自齧齒動物、人、非人靈長類、馬科動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、豬科動物、綿羊科動物和兔形動物。
17.權利要求1所述的方法，其中所述異質少突膠質祖細胞群是從選自下列的成員分離的海馬、小腦、脊髓、皮質、紋狀體、基底前腦、腹側中腦、藍斑和下丘腦。
18.權利要求1所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群具有至少一種特徵，所述特徵選自(i)生成同質少突膠質細胞群的能力；(ii)生成同質2型星形膠質細胞的能力；(iii)去分化的能力；和(iv)缺乏分化為1型星形膠質細胞的能力。
19.自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，其通過權利要求1的方法得到。
20.自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，其通過權利要求1的方法得到，其中所述同質少突膠質祖細胞群被限制為少突膠質細胞系。
21.獲得分化的同質少突膠質細胞群的方法，包括在培養基中培養自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，所述培養基選自(a)缺乏任何促有絲分裂劑的培養基，(b)包括睫狀神經細胞營養因子(CNTF)的培養基，所述CNTF的量足以誘導所述少突膠質祖細胞分化，(c)包括3，3』，5』-三碘甲腺原氨酸(T3)的培養基，所述T3的量足以誘導所述少突膠質祖細胞分化，和(d)包括睫狀神經細胞營養因子(CNTF)和3，3』，5』-三碘甲狀腺原氨酸(T3)的培養基，所述CNTF和T3的量足以誘導所述少突膠質祖細胞分化。
22.權利要求21所述的方法，其中所述CNTF的量是大約1ng/ml至大約20ng/ml。
23.權利要求21所述的方法，其中所述T3的量是大約1μg/ml至大約30μg/ml。
24.在培養物中維持未分化的少突膠質祖細胞群的方法，包括在培養基中培養未分化的少突膠質祖細胞群，所述培養基包括成纖維細胞生長因子(FGF)，所述成纖維細胞生長因子的量能有效維持未分化的發育階段，其中所述培養是在基本上不存在血小板源生長因子(PDGF)下進行的，從而在培養物中維持未分化的少突膠質祖細胞群。
25.權利要求24所述的方法，其中所述FGF選自FGF1、FGF2(鹼性FGF或bFGF)、FGF4、FGF6、FGF8b、FGF9和FGF17。
26.權利要求24所述的方法，其中所述FGF是bFGF。
27.權利要求24或26所述的方法，其中所述FGF的量是大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。
28.權利要求27所述的方法，其中所述FGF的量是大約1ng/ml至大約10ng/ml。
29.權利要求28所述的方法，其中所述FGF的量是大約5ng/ml。
30.權利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.1ng/ml。
31.權利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.01ng/ml。
32.權利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少於0.001ng/ml。
33.去分化自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群的方法，包括在培養基中培養自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，所述培養基包括至少一種生長因子，所述生長因子的量有效促進去分化。
34.權利要求33所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群具有A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段，以及所述至少一種生長因子是bFGF，其量為大約0.1ng/ml至大約40ng/ml。
35.權利要求33所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群具有A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段，以及所述至少一種生長因子是PDGF，其量為大約1ng/ml至大約50ng/ml。
36.權利要求34所述的方法，其中所述培養基進一步包括PDGF，其量為大約1ng/ml至大約50ng/ml，和神經營養蛋白-3，其量為大約1ng/ml至大約10ng/ml。
37.權利要求35所述的方法，其中所述培養基進一步包括bFGF，其量為大約0.1ng/ml至大約40ng/ml，和神經營養蛋白-3，其量為大約1ng/ml至大約10ng/ml。
38.權利要求33所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群是具有A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段、A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段或A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段的少突膠質祖細胞群。
39.權利要求33所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群去分化為具有A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段或A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段的同質少突膠質祖細胞群。
40.權利要求33所述的方法，其中所述去分化的少突膠質祖細胞可以分化為少突膠質細胞或分化為2型星形膠質細胞。
41.權利要求33所述的方法，進一步包括，在所述培養步驟期間，通過用消化試劑進行細胞分裂，轉移所述少突膠質祖細胞至少一次。
42.去分化的少突膠質祖細胞群，其由權利要求33的去分化方法獲得。
43.自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，其響應於骨形態形成蛋白(BMP-2)或BMP-4的處理，分化為2型星形膠質細胞，但是不響應於任何量睫狀神經細胞營養因子(CNTF)的處理，所述BMP-2或BMP-4的量能有效誘導分化為2型星形膠質細胞。
44.去分化的同質少突膠質祖細胞群，其響應於骨形態形成蛋白(BMP-2)或BMP-4的處理，分化為2型星形膠質細胞，但是不響應於任何量睫狀神經細胞營養因子(CNTF)的處理，所述BMP-2或BMP-4的量有效誘導分化為2型星形膠質細胞。
45.權利要求43或44所述的方法，其中BMP-2和BMP-4的量是大約1ng/ml至大約20ng/ml。
46.篩選化合物的方法，所述化合物影響同質少突膠質祖細胞群、少突膠質細胞群或2型星形膠質細胞群的生物學功能，方法包括(a)用檢測化合物接觸通過權利要求1方法獲得的自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群、或從權利要求1的方法獲得的所述同質群分化而來的少突膠質細胞群、或從權利要求1的方法獲得的所述同質群分化而來的2型星形膠質細胞群；和(b)檢測少突膠質祖細胞、少突膠質細胞或2型星形膠質細胞生物學功能的變化。
47.權利要求46所述的方法，其中所述同質少突膠質祖細胞群是選自A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段的少突膠質祖細胞、A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段的少突膠質祖細胞和A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段的少突膠質祖細胞的群。
48.權利要求46所述的方法，其中所述變化是至少一種特徵的增加或降低，所述特徵選自髓鞘形成、分化為少突膠質細胞或2型星形膠質細胞、增殖速度、細胞遷移、存活能力、基因表達、蛋白表達、培養基中的蛋白水平、去分化、生長特徵和細胞形態學。
49.治療患者的方法，所述患者患有影響中樞神經系統的疾病或狀況，所述方法包括，給予患者治療有效量的自我更新的、具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群，所述細胞群是通過權利要求1的方法獲得的。
50.權利要求49所述的方法，其中所述少突膠質祖細胞在給予所述患者之前被分化或去分化。
51.權利要求49所述的方法，其中所述疾病或狀況是脫髓鞘疾病或神經變性疾病。
52.權利要求51所述的方法，其中所述脫髓鞘疾病選自脊髓損傷(SCI)、多發性硬化(MS)、人類免疫缺陷MS-相關的脊髓病、橫貫性脊髓病/脊髓炎、進行性多灶性白質腦病、和腦橋中央髓鞘溶解髓鞘損傷。
53.權利要求51所述的方法，其中所述神經變性疾病選自阿爾茨海默病、阿爾茨海默型老年痴呆(SDAT)、帕金森病、亨延頓舞蹈病、缺血、失明、和有髓神經元損傷造成的神經變性疾病。
54.大鼠A2B5(+)O4(+)O1(-)自我更新的少突膠質祖細胞的基本純化培養物，其ATCC保藏編號是PTA6093。
55.基本上純化、自我更新的具有同步發育階段的同質少突膠質祖細胞群。
56.權利要求55所述的少突膠質祖細胞，其中所述同步發育階段是A2B5(+)O4(-)O1(-)。
57.權利要求55所述的少突膠質祖細胞，其中所述同步發育階段是A2B5(+)O4(+)O1(-)。
58.權利要求55所述的少突膠質祖細胞，其中所述同步發育階段是A2B5(+)O4(+)O1(+)。
59.權利要求55所述的少突膠質祖細胞，其中所述同步發育階段是bFGF依賴的。
60.基本上純化、自我更新的同質少突膠質祖細胞群的混合物，其由至少兩種不同的同步發育階段組成，其中所述發育階段選自A2B5(+)O4(-)O1(-)發育階段、A2B5(+)O4(+)O1(-)發育階段和A2B5(+)O4(+)O1(+)發育階段。
全文摘要
本發明描述了自我更新的，具有同步發育階段的表型同質少突膠質祖細胞群和獲得自我更新的表型同質少突膠質祖細胞群的方法。其它方法包括維持和保存同質的少突膠質祖細胞群較長時期而不改變細胞特徵的方法，和去分化少突膠質祖細胞的方法。自我更新的，表型同質少突膠質祖細胞群或同質少突膠質細胞群可以用於治療患有中樞神經系統疾病或病理狀態的患者。
文檔編號C12N5/02GK1833021SQ200480019375
公開日2006年9月13日 申請日期2004年7月19日 優先權日2003年7月18日
發明者H·岡崎 申請人:大冢製藥株式會社