2-氨基-4-甲膦醯丁酸抗性基因及其應用的製作方法

2023-09-11 06:21:05 2

專利名稱:2-氨基-4-甲膦醯丁酸抗性基因及其應用的製作方法
Phosphinothricin(PTC，2-氨基-4-甲膦醯丁酸)是穀氨醯胺合成酶的抑制劑。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦醯-丙氨醯-丙氨酸的「結構單位」。此三肽(PTT)具有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌以及抗真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的活性(Bayer等人，Helv.Chim.Acta 55∶224，1972)。PTT是由綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)Tu 494菌株(DSM40736，DSM4112)產生的。
德國專利2，717，440號公開了PTC可起全除莠劑(total herbicide)的作用。已公開的PCT申請WO86/02097號描述了植物對PTC的抗性是歸因於穀氨醯胺合成酶的過量生成。這種類型的過量生成(如從基因擴增所導致的)易遭受不穩定的風險。因此，這樣一種不穩定性將帶來穀氨醯胺合成酶過量生成的下降，將致使重新出現PTC的競爭性抑制作用。
與之相反，在權利要求
中所限定的本發明涉及一種PTC抗性基因及其在生產PTC抗性植物中的應用。此外，該基因還可作為抗性標記使用。而且，該基因可適於L型外消旋PTC的選擇性N-乙醯化作用。
本發明的PTC抗性基因能由下述步驟得到用BamHⅠ酶切以PTT抗性選擇出來的綠色產色鏈黴菌DSM4112菌株的總DNA，克隆大小為4.0Kb的片段，然後選擇PTT抗性。限制性圖譜(圖1)詳細描繪了該4.0Kb片段的特徵。
對該4Kb片段部分進行克隆實驗，以更精確地確定編碼區的位置。此實驗結果表明，抗性基因位於1.6Kb的SstⅡ-SstⅠ片段上(圖1中位置0.55至2.15)。用BglⅡ消化產生0.8Kb大小的片段，此片段摻入質粒中並轉化變鉛青鏈黴菌(S.lividans)後賦予PTT抗性。此抗性是由PTC的N-乙醯化產生的。
對此0.8Kb片段進行Maxam和Gilbert序列分析得到DAN序列Ⅰ(見附頁)。抗性基因的位置可從這一序列的開放讀碼(open reading frame)確定(從位置258起)。此基因讀碼終點位於圖示的倒數第二個核苷酸(位置806)，即最後一個核苷酸(位置807)是終止密碼子的第一個核苷酸。
用下加線條強調標明了DNA序列Ⅰ中的Shine-Dalgarno序列，作為起始密碼子的GTG也用線條標出。而且，頂部線條標出了確定的讀碼。
DNA序列Ⅱ顯示已確定了序列的基因中的限制性切點。沒有標出切斷此序列六次以上的酶。
抗生素PTT由細菌攝取並被降解為PTC。後者也抑制細菌中的穀氨醯胺合成酶，致使細菌因缺乏穀氨醯胺而死亡。因此，產生PTT的細菌應當具有保護自身不受PTT影響的機理，也就是說，防止再度攝取已生產的PTT，或者對已降解的產物PTC進行修飾。但令人吃驚的是，PTT生產菌綠色產色鏈黴菌DSM4112對其自身的抗生素敏感。但出人意料地證實，通過選擇PTT抗性，有可能以10-5的極高頻率發現抗PTT的選擇體，而且，此選擇體還能抑制相鄰菌落的本底生長。
通過分離此DNA、用BamHⅠ切斷並連接到鏈黴菌載體中建立了這些選擇體DNA的基因庫。將連接混合物轉化到市售的變鉛青鏈黴菌TK23菌株中，每1μg連接混合物產生大約5000至10000個含有大約1至5Kb插入段的轉化體。在這些轉化體中有PTT抗性變鉛青鏈黴菌株。有可能通過質粒分離並重新轉化到變鉛青鏈黴菌中，證明該抗性是由質粒編碼的。負責此抗性的基因位於4Kb BamHⅠ片段上(圖1)。編碼區位於0.8Kb BglⅡ片段上。BamHⅠ片段中不含下列酶的切點ClaⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PvuⅠ、PvuⅡ和XhoⅠ。
將抗性基因的限制性圖譜(還沒有詳細確定其特徵)與吸水鏈黴菌(S.hygroscopicus)FERM BP-130/ATCC21705(歐洲專利申請，公開號0，173，327，圖7)相比較表明，本發明的抗性基因不同於已知基因，其為尋找PTT生物合成基因過程中發現的。
一方面使綠色產色鏈黴菌DSM4112和變鉛青鏈黴菌TK23的細胞提取物與PTC和乙醯輔酶A保溫，另一方面使PTT抗性的綠色產色鏈黴菌選擇體和攜有質粒的變鉛青鏈黴菌轉化體與PTC和乙醯輔酶A保溫，有可能表明後面的細胞將具有乙醯化活性。層析分析表明乙醯化發生在氨基上。
由於大腸桿菌中也已發現了PTT抗性，而且抗性機理也在革蘭氏陰性細菌中起作用，因此，有可能基於運送現象排除抗性。這樣，與植物啟動子偶聯並使用合適的載體後，本發明的抗性基因可轉化到植物中，從而可產生PTC抗性植物。
PTC的N-乙醯化還可用於合成的D，L-PTC的外消旋體拆開，因為只有L型發生選擇性乙醯化作用。
因此，本發明還涉及使用抗性基因選擇性地使外消旋PTC的L型發生N-乙醯化。
因此，本發明的抗性基因編碼的PTC乙醯轉移酶可用於分離外消旋PTC，例如，使外消旋體經受此酶的乙醯化作用。可使由德國專利2，717，440的方法所得到的外消旋PTC成為光學對映體，因為此酶只選擇性地攻擊L型，而D型則保持不變。然後，根據二者性質的差別，通過已知方法可將這樣得到的混合物分離開。
已公開了這樣一種方法使N-醯基-D，L-胺基酸與固定在適當載體上的醯基轉移酶接觸，選擇性地釋放L-胺基酸，它可以在酸化以後用不與水混溶的溶劑從與N-醯基-D-胺基酸的混合物中萃取出來(見英國專利1，369，462號)。已經公開了N-醯基-D，L-PTC的相應的分離方法，如見於德國專利公開2，939，269號或美國專利4，226，941號。
根據本發明保持不變的D-PTC可通過已知方法外消旋(見公開號為EP-A-0，137，371的歐洲專利申請，實例8)，然後回到流程中。
有可能但並不一定要分離出酶，這裡及下文中所說的「酶」總是意指具有酶促活性的部分。如果酶被分離出來，它可以以游離形式或在載體上的固定化形式使用。合適載體的例子已在歐洲專利-A0，141，223號中描述了。但方便的作法是不分離酶，而是使用任何預期可表達本發明之酶的PTC抗性細胞。因此，有可能方便地使用綠色產色鏈黴菌DSM4112的PTT抗性選擇體。而且，有可能有利地使用任何用本發明之基因轉化的預期細胞，並使之能夠表達PTC乙醯轉移酶。就此而論，本發明的基因(也是指其活性部分)可以以質粒整合形式或利用其它常規的基因操作方法，例如通過轉染引入到宿主細胞中。例如，摻入大腸桿菌的表達質粒中並用這樣的質粒轉化大腸桿菌是方便可行的，例如可通過歐洲專利-A0，163，249號和0，171，024號中介紹的已知方法進行。
對於外消旋體中的L-PTC的N-乙醯化，根據本發明，可以游離或固定化形式使用表達PTC乙醯轉移酶的細胞，使用常規的固定化技術進行固定(例如德國專利公開3，237，341及其中引用的文獻)。
本發明中L-PTC的酶促乙醯化以常規的酶促反應方式進行，方法中的條件由所用生物的性質來確定。從原則上講，適用於此的方法與上述選擇性脫醯作用的方法相同。
下述實例進一步闡明了本發明。除非特別指出者外，其中的份數和百分數數據均是指重量。
實例1 PTT抗性選擇體在基本培養基中(Hopwood等人，《鏈黴菌的基因操作實驗室手冊》，The John Innes Foundation Norwieh，England，p.233，1985)培養綠色產色鏈黴菌DSM4112菌株，加入漸增濃度的PTT。在100μg/ml的濃度下，大約在每10個菌落中發現一個抗性菌落。
實例2載體的製備用BglⅡ切割質粒pSVHⅠ(歐洲專利0，070，522號，美國專利4，673，642號)，分離大小約7.1Kb的片段並與1.1Kb具有硫鏈絲菌素抗性的BglⅠ片段連接(歐洲專利申請，公開號0，158，201)。得到大小約為8.15Kb的質粒pEB2(圖2)。
實例3抗性基因的分離從實例1得到的選擇體中分離總DNA，並用BamHⅠ酶切。同樣用BamHⅠ打開質粒pEB2，使兩種混合物結合併連接。將連接混合物轉化到並鉛青鏈黴菌TK23(可從The John Innes Foundation得到)中，每1微克連接混合物得到5000至10000個具有大約1～5Kb插入段的轉化體。選擇PTT抗性產生兩個具抗性的變鉛青鏈黴菌菌落。從抗性菌落中分離出質粒並用BamHⅠ酶切。發現一個攜有負責抗性的基因的4Kb BamHⅠ片段。此質粒被稱為pPRⅠ(圖3)。
將其再轉化到變鉛青鏈黴菌TK23中，證明PTT抗性是由質粒編碼的，因為轉化體能在含有100μg/mlPTT的基體培養上生長。
實例4證明N-乙醯化使PTC失活檢查下列菌株以證實克隆片段的乙醯化活性綠色產色鏈黴菌DSM40736，綠色產色鏈黴菌(PTT抗性突變株)、變鉛青鏈黴菌TK23和變鉛青鏈黴菌TK23(pPRⅠ)。
這需將菌株接種到溶解培養基A(歐洲專利申請，公開號0，158，872第6頁)中，並在軌道式震蕩培養器中於30℃保溫2天。收穫細胞後，取1mg菌絲體在合適的緩衝液(如RS緩衝液C.J.Thompson等人，J.Bacteriol 151∶678-685，1982)中用超聲波破碎。測定PTC降解的典型試驗程序如下在250μl粗提物中，加入100μl PTC溶液(250μg/ml)和50μl乙醯輔酶A(4mg/ml)，將混合物於30℃下保溫2小時。此時間過後，用HPLC測定仍然存在的PTC量。此實驗基結果如下未反應的PTC菌株加入的PTC變鉛青鏈黴菌TK23 100%綠色產色鏈黴菌(DSM40736) 72%綠色產色鏈黴菌選擇體 7%變鉛青鏈黴菌TK23(pPRⅠ) 31%在薄層層析上(沒有茚三酮顯色)與參考物質相比表明，已經發生了PTC的N-乙醯化。
權利要求
1.一種獲得Phosphinothricin(PTC)抗性基因的方法，該方法包括選擇抗2-氨基-4-甲膦醯-丙氨醯-丙氨酸(PTT)的綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)D SM4112，從抗性菌株中分離總DNA並用BamHI酶切之，分離大小為4.0Kb的片段，以含有抗性基因的完整或亞片段形式克隆此片段並選擇PTT抗性。
2.根據權利要求
1的方法，其中被克隆的是位於4.0Kb BamHⅠ片段中的0.8Kb BglⅡ片段。
專利摘要
通過在綠色產色鏈黴菌DSM4112中選擇2-氨基-4-甲膦醯-丙氨醯-丙氨酸(PTT)抗性而產生PTT抗性的選擇體。用BamHI酶切這些選擇體的總DNA得到攜有Phosphinothricin(PTC)抗性基因的DNA片段，克隆4.0Kb大小的片段並選擇PTT抗性。此基因適用於生產PTC抗性的植物，以及作為抗性標記用於L型外消旋PTC的選擇性N-乙醯化作用。
文檔編號C12N15/64GK87105764SQ87105764
公開日1988年11月30日 申請日期1987年8月22日
發明者埃克哈德·斯特羅克, 沃夫岡·霍勒本, 沃特·阿諾德, 裡納特·阿利亞, 阿里德·普勒, 格哈德·沃納, 魯迪格·馬奎特, 蘇三尼·格拉布利, 迪特·布羅爾, 克勞斯·巴徹 申請人:赫徹斯特股份公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan