檢測休眠隱生微生物的存在的方法

2023-09-11 16:12:55

專利名稱：檢測休眠隱生微生物的存在的方法
技術領域：
本發明涉及表面上、空氣中和液體中孢子的存在的檢測方法和設備。
背景技術：
本領域技術人員已經將通過檢測存在的吡啶-2，6-二羧酸(吡啶二羧酸)確定細菌內生孢子存在的方法使用了一定時間。該化合物含有存活孢子的有效部分，否則在自然界非常罕有(R.Lundin和L.Sacks，「細菌孢子的高解析度固態13C核磁共振吡啶二羧酸的α-碳信號的鑑定」-Appl.Environ.Microbiol.，vol.54，no.4，pp.923-928，1988)。將各種分析方法用於檢測吡啶二羧酸以便顯示存在孢子，包括導數光譜(A.Warth，「用導數光譜法測定細菌孢子中的吡啶二羧酸」-Anal.Biochem.，vol.130，no.，pp.502-505，1983)；內在螢光(A.Alimova，A.Katz，H.E.Savage，M.Shah，G.Minko，D.V.Will，R.B.Rosen，S.A.McCormick和R.R.Alfano，「發生飢餓情況的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的天然螢光和激發光譜改變」-Appl.Opt.，vol.42，no.19，pp.4080-4087，2003)；添加鑭系元素鹽後的發光(D.L.Rosen，C.Sharpless和L.B.McGown，「通過使用吡啶二羧酸 光致敏發光進行細菌孢子檢測和測定」-Anal.Chem.，vol.69，pp.1082-1085，1997)；質譜法(M.B.Beverly，K.J.Voorhees和T.L.Hadfield，「芽孢桿菌屬孢子的直接質譜分析」-Rapid Commun.Mass Spectrom.，vol.13，no.23，pp.2320-2326，1999)；傅立葉變換紅外光譜(H.Y.Cheung，J.Cui和S.Sun，「萌發過程中通過減弱的總反射傅立葉紅外光譜實時監測枯草芽孢桿菌內生孢子成分」-Microbiology，vol.145，pp.1043-1048，1999)；拉曼光譜(美國專利US 6,040,191)和H.Shibata，S.Yamashita，M.Ohe和I.Tani，「凍幹細菌孢子的雷射拉曼光譜」-Microbiol.Immunol.，vol.30，no.4，pp.307-313，1986)；和與氣相色譜法連接的的等離子體色譜法(美國專利US 6,672,133B1)。
美國專利中已經經由檢測吡啶二羧酸鈣和/或吡啶二羧酸，通過存在的吡啶二羧酸鈣檢測內生孢子的方法。美國專利US 6,498,041B1中描述了基於芽孢外被成分的分子識別來俘獲孢子、隨後通過添加由可見光譜中的光激發的螢光鈣結合染料檢測Ca2+的方法。美國專利US6,599,715和美國專利申請10,355,462中教導了當用紫外光激發時通過來自吡啶二羧酸 的發光檢測吡啶二羧酸的方法。
此外，已經報導了其它隱生微生物存在吡啶二羧酸(或具有極其相關的化學結構的其它吡啶二羧酸類似物)。(隱生描述的是能夠實現休眠狀態的微生物)。特別將吡啶二羧酸用於檢測梭狀芽孢桿菌屬孢子(M.W.Tabor，J.MacGee和J.W.Holland，「通過氣相色譜法對梭狀芽孢桿菌屬種類的孢子中的吡啶二羧酸的快速測定」-Appl.Environ.Microbiol.，vol.31，no.1，pp.25-28，1976)；芽孢八疊球菌屬(Sporosarchina)孢子(C.A.Loshon和P.Setlow，「芽孢八疊球菌屬種類休眠孢子中的小分子水平與芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬種類的孢子水平比較」-Can.J.Microbiol.，vol.39，no.，pp.259-262，1993)；八疊球菌屬孢子(R.S.Thompson和E.R.Leadbetter，「對來自尿素八疊球菌的內生孢子的吡啶二羧酸的分離」-Arch.Mikrobi1.，vol.45，pp.27-32，1963)；和Metabacterium孢子(S.Stunkel，J.Alves和I.Kunstyr，「來自齧齒動物腸的兩種『錐柱桿菌屬』的特徵。多孢錐柱桿菌中吡啶二羧酸的異主寄生培養和驗證」-Folia Microbiol.(Praha)，vol.38，no.3，pp.171-175，1993)。在這些和其它隱生(形成孢子)微生物中發現了吡啶二羧酸化合物。
2002年1月22日提交的美國專利申請10/054,419(且引入本文作為參考)中公開了用於檢測非生命表面和樣品上的微生物的方法和設備，其中使樣品接觸能夠激發來自各種代謝物、輔因子以及細胞和孢子成分的螢光的許多特定能量的電磁射線。因此，其中含有的待取樣的微生物細胞和孢子(且更具體的說是激發的代謝物、輔因子和其它細胞、病毒和/或孢子成分)發射可以測定的螢光。用能夠(1)除去任何背景和/或反射和散射激發信號和(2)將代謝物、輔因子和孢子成分的相對螢光信號與已知的生理範圍值比較的方法分析採集的螢光信號(涉及發射自細胞/病毒/孢子成分的信號)。美國專利申請10/054,419中特別教導了通過分別使用270nm-290nm和310nm-330nm範圍紫外電磁射線(光)激發吡啶二羧酸鈣(單獨或同時)檢測孢子並分別檢測460nm-480nm和400nm-430nm內的螢光能量的方法。上述申請中還教導了使用610nm-670nm範圍的電磁射線(光)激發與檢測730nm-800nm區內的光能結合檢測孢子的方法。在來自含水的細菌孢子樣品的發射光譜中和如上述申請附圖3F中說明的非存活的蘇雲金芽孢桿菌細胞樣品中觀察到了這種新發射。使用這些新的低能激發和對檢測孢子而言的發射範圍是有益的，因為(1)幾乎不存在來自其它微生物螢光團的幹擾和/或重疊；(2)來自生物衍生的有機表面的背景幹擾得到顯著減少；和(3)預計可有更大的激發穿透樣品深度。本說明書證實有益的低能激發和發射信號來源於吡啶二羧酸鈣且教導了使用這些激發光源檢測孢子的有益性。
正如本領域技術人員所公知的，螢光是發光的一種形式。[將螢光和磷光定為光致發光光譜測定法的類型(J.D.Ingle，Jr.和S.R.Crouch，Spectrochemical Analysis，pp.438，1988，Prentice-Hall，Inc.)]。螢光與磷光之間的主要差異在於發射存在期(I.Tinoco，Jr.，K.Sauer和J.C.Wang，Physical ChemistryPrinciples andApplications in Biological Sciences，pp.577，1995，Prentice-Hall)。(螢光指的是以微秒計和較短範圍的發射存在期；磷光指的是一般以微秒計的或較長範圍的發射存在期。)因此，由於沒有發射存在期數據，所以使用傳統發射光譜在實驗上無法區別螢光和磷光。在這種情況中，來自內發色團(吸收激發能量並發射低能射線的化學成分)的『表觀螢光』可能來源於磷光或螢光之一。對來自微生物成分的表觀螢光的檢測提供了檢測休眠隱生微生物的能力，但(1)不與樣品進行物理性接觸；(2)極快；和(3)不使用任何添加的試劑。
正如易於理解的，能夠測定醫院、食品區、供水、建築內和戰場上存在的休眠(隱生和/或形成孢子)微生物是極其有用的，因為要根除這些微生物需要花費最大努力。作為本發明的方法和設備應以低廉和快速的方式操作，例如用於食品生產設施。

發明內容
本發明的目的在於隱生(休眠、形成孢子)微生物的檢測方法和設備，其中使樣品接觸610nm-680nm區內的電磁射線並檢測來自730nm-860nm區內的發射。取樣的孢子(更具體的說是其中包含的吡啶二羧酸鈣)發射可以測定的電磁能量。使用能夠除去任何背景、反射激發能量和/或散射光的方法分析採集的發射自吡啶二羧酸鹽的發射信號。因此，本發明的方法和設備提供了低廉而快速的方式，其中掃描樣品以檢測存在的微生物汙染並對其定量，但不接觸樣品。能夠在不接觸的情況下評價樣品中的微生物汙染，減少了引入汙染的危害。
本發明的一個目的是提供用於檢測食品上的隱生微生物汙染的方法和設備，其中當由610nm-680nm區內的電磁射線激發時，在730nm-860nm區內檢測來源於吡啶二羧酸鈣化合物的發射信號，從而使食品上的休眠微生物汙染在不接觸所述食品的情況下得到定量測定。
本發明的另一個目的是提供可以用於檢測非生命表面上、液體和空氣中的隱生微生物汙染的方法和設備。作為本發明的具體目的，該方法和設備可以用於以低廉而快速的方式發現例如保健設施、研究實驗室、水處理和工作站、建築物以及戰場上的隱生微生物和微生物汙染。
本發明的另一個目的是提供用於檢測非生命表面上和液體和空氣樣品中的微生物汙染的方法和設備，其中由610nm-680nm區內的電磁射線激發吡啶二羧酸鈣化合物的發射並在730nm-860nm區內檢測，由此在不接觸所述樣品的情況下測定樣品中的微生物汙染。
按照本發明的這種形式，通常需要使用發射630nm左右的電磁射線的光源。按照本發明的這種形式，由該光源發射的光特別或經過濾通過對特別激發吡啶二羧酸鈣的能量的電磁射線。
按照本發明的另一個實施方案，能夠且有時需要使580nm左右的電磁射線定向於樣品。580nm的光激發微生物中的黃素和血紅素化合物，其發射中的某些被樣品自我吸收，從而依次激發具有610nm-680nm範圍內發射的吡啶二羧酸鈣。如上所述採集並分析樣品的表觀螢光發射。
按照本發明的另一個實施方案，能夠且有時需要使能夠激發吡啶二羧酸鈣的能量和還可以不與孢子發生相互作用的能量的電磁射線定向。因此，按照本發明的該實施方案，可以測定來源於樣品的所得螢光信號(來自微生物成分和那些單純反射和/或散射自樣品的成分)且可以通過比較來自微生物的發射信號與那些反射/散射自樣品的那些信號的比例確定微生物的存在。
為了實施本發明，將傳感器不僅用於檢測由內在螢光團產生的螢光、而且用於檢測背景、反射和/或散射的電磁射線。該部件用於校準信號並補償還可能因使用探測器與掃描樣品之間的可變距離和不同樣品或表面之間的變化產生的信號改變。
還發現通過快速改變以不同於60赫茲的頻率定向於樣品的電磁射線，基本上可以將環境光(且特別是螢光)的作用減小到最低限度。調節激發能量還使傳感器發生運轉以使電磁射線定向於樣品的不同部分，但基本上不會對微生物含量測定的精確度產生影響。
本文所述的微生物檢測方法和設備能夠測定隱生微生物的存在和生理狀態，同時不需要試劑、不接觸樣品、以低廉方式進行並提供『實時』結果。本發明的這些和其它目的、特徵和優點在對下面所公開實施方案的詳細描述和待批權利要求進行綜述時將變得顯而易見。
附圖簡述附

圖1是可以用於實施本發明最基本特徵的儀器的方框圖。
附圖2表示吡啶二羧酸(吡啶-2，6-二羧酸，A)和白屈氨酸(4-羥基吡啶-2，6-二羧酸，B)的化學結構。
附圖3表示當在630nm處激發時20mM吡啶二羧酸鈣溶液(—)發射光譜和在670nm處激發時白屈氨酸鈣(-----)的發射光譜。
附圖4表示當用630nm射線激發時吡啶二羧酸鈣固體和溶液的發射光譜。實線表示固體鹽的發射光譜，而虛線表示飽和溶液的發射光譜。
附圖5表示當在315nm(—)和630nm(—)處激發時吡啶二羧酸鈣水溶液的發射光譜。
附圖6表示純吡啶二羧酸鈣水溶液(—)、提取自蘇雲金芽孢桿菌孢子的吡啶二羧酸鈣水溶液(—)、提取自啤酒糖酵母孢子的吡啶二羧酸鈣水溶液(------)和提取自已經加入Tb3+的Cryptosporidium parvum卵囊的吡啶二羧酸鈣水溶液(-●●-●●-)的發射光譜(270nm激發)。
附圖7表示純吡啶二羧酸鈣水溶液(—)、提取自蘇雲金芽孢桿菌孢子的吡啶二羧酸鈣水溶液(—)和提取自啤酒糖酵母孢子的吡啶二羧酸鈣水溶液(------)的導數光密度光譜。
附圖8表示炭疽芽孢桿菌(—)、巨大芽孢桿菌(—)、枯草芽孢桿菌(------)和蘇雲金芽孢桿菌(-●-●-)的細菌孢子溶液的發射光譜(630nm激發)。
附圖9表示細菌(—)和酵母(------)孢子溶液的發射光譜(630nm激發)。
具體實施例方式
可以用於實施本發明描述方法的一個實施方案的設備用基本元件如附圖1的方框圖中所示。該設備由光源、激發濾波器、聚焦光學部件、採集光學部件、發射濾波器和檢測器組成。使來自光源的電磁射線定向於樣品，通過激發濾波器和聚焦光學部件(如果必要)以激發樣品中的內在發色團。用採集光學部件採集散射和反射的激發射線與發射的射線並使它們定向於檢測器。發射濾波器確保僅測定有意義的能量。
本發明的各種實施方案、包括不同結構和可應用的不同部件是可行的。用於該微生物檢測方法的基本部件允許(1)在610nm-680nm區內激發吡啶二羧酸鈣鹽；(2)採集和檢測710nm-860nm區內發射的電磁射線、背景(環境)光、反射激發光和散射的光能；和(3)用能夠校正背景幹擾的方法分析檢測的信號。在使用該方法的任何設備中所用的結構和部件應與應用的要求和預計的幹擾相匹配。
能夠且有時需要應用可提供寬帶照明的光源。所用光源的種類受其產生激發有意義內在微生物成分所需波長的電磁射線的能力的影響。另外，有時需要應用脈衝光源以便測定關閉迴路過程中的環境背景。可以使用的光源包括帶有各種電燈泡的燈(例如汞、鎢、氘、氙燈)、光發射二極體(LEDs)和對所需激發能量而言特定的二極體雷射器。所用的光源類型取決於所需激發射線的強度和所需的檢測極限。
在本發明各種實施方案中所用的激發和發射濾波器包括幹擾濾波器、浸漬玻璃、截止濾波器系列、凝膠濾波器、單色儀、光柵、折射(rugate)濾波器等。所用的發射濾波器的光截止特性取決於分析方法可接受多少散射和反射的激發射線信號或所需的檢測極限。如果使用僅具有有意義能量的光源，則可以不必使用激發濾波器；如果校準光源(諸如雷射)，則可以不必使用聚焦光學部件。(聚焦光學部件的目的是使激發射線定向於取樣的面積或體積)。重要的是應注意如果使用多光子激發，則能夠使用具有能量低於有意義發色團激發能量的光源。
採集光學部件的目的在於將發射自激發微生物發色團的光以及散射和反射自樣品的光輸送至檢測器。如果將幹擾濾波器用於區分這些發射能量，那麼需要校準採集的光以便使這些濾波器以最佳狀態工作。纖維光纜也可以用於將激發射線輸送至樣品並採集發射的射線且使其定向於檢測器。當許多光學成分在紫外線和可見光範圍內顯示出螢光時，能夠且有時需要應用拋光的反光金屬、藍寶石、熔凝矽石、石英、MgF2和/或CaF2光學成分。
檢測器用於將發射的電磁射線轉化成可以測定的電信號。大量具有不同靈敏度的檢測器可以用於本發明的實施方案光電倍增管(PMTs)、雪崩光二極體(APDs)、針型二極體、CCDs等。所選擇的檢測器取決於所檢測的射線的能量、發射信號的強度和設備所需的檢測極限。用能夠除去產生的任何背景發射、反射激發光和/或散射激發信號的方法分析採集的已經轉化成放大的電信號的發射能量。
附圖2表示吡啶二羧酸(吡啶-2，6-二羧酸，A)和白屈氨酸(4-羥基吡啶-2，6-二羧酸，B)的化學結構。附圖3表示吡啶二羧酸鈣溶液的發射光譜(630nm處激發)和白屈氨酸鈣的發射光譜(670nm處激發)。當使用610nm-680nm區內的電磁能量激發時，710nm-860nm區內的能量發射是鹼土金屬吡啶二羧酸鹽的特性，從而證明可以應用來自吡啶二羧酸鈣(或因可選生物合成途徑或隨後的吡啶二羧酸鹽的天賦反應產生的具有極其相近化學結構的其它內在吡啶二羧酸類似物)檢測休眠隱生微生物。
附圖4表示當使用630nm射線激發時吡啶二羧酸鈣固體樣品和溶液的發射光譜。實線表示固體鹽的發射光譜，而虛線表示飽和溶液的發射光譜。吡啶二羧酸鈣固體和水溶液的光譜表示在780nm左右的發射，不過，與溶液相比固體樣品的光譜下降。(固體吡啶二羧酸鈣光譜的發射可以因濃度而終止)。附圖5表示當在315nm(—)和630nm(—)處激發時吡啶二羧酸鈣水溶液的發射光譜，說明與已知吡啶二羧酸鈣螢光發射相比新的低能發射信號的相對信號強度(R.Nudelman，N.Feay，M.Hirsch，S.Efrima和B.Bronk，「作為觀察到的細菌孢子UV發射光譜的可能成分的吡啶二羧酸螢光」-SPIE vol.3533，pp.190-195，1998)。
附圖6表示純吡啶二羧酸鈣溶液(—)、提取自蘇雲金芽孢桿菌孢子的水溶液(—)、提取自啤酒糖酵母孢子的水溶液(------)和提取自已經加入Tb3+的Cryptosporidium parvum卵囊的水溶液的發射光譜(270nm激發)(按照Anal.Chem.，vol 69，pp.1082-1085，1997中所述的方法)。附圖7表示純吡啶二羧酸鈣溶液(—)的導數光密度光譜；該附圖還表示提取自蘇雲金芽孢桿菌孢子(—)和已經加入Ca2+的啤酒糖酵母孢子的水溶液(------)(按照Anal.Chem.，vol 130，no.2，pp.502-505，1983中所述的方法)。這些附圖清楚地表明在各種休眠隱生微生物中存在周期表II族(鹼土金屬，包括Mg2+、Ca2+等)吡啶二羧酸化合物酵母孢子、細菌孢子和草履蟲卵囊。附圖8表示炭疽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌的細菌孢子溶液的發射光譜(630nm激發)。710nm-860nm之間存在吡啶二羧酸鈣發射表明在許多細菌孢子中普遍存在吡啶二羧酸鈣。附圖9表示細菌(芽孢桿菌屬的種類)和酵母(糖酵母屬的種類)孢子溶液的發射光譜(630nm激發)，說明可以使用710nm-860nm的發射檢測真菌和細菌孢子。
使用新的內在鹼土金屬吡啶二羧酸鹽低能發射能夠快速檢測休眠隱生微生物，但不需要加入任何的試劑、取樣處理或接觸樣品。上述本發明的實施方案僅作為典型使用，本領域技術人員可以使用上述基本構思進行其它組合、變化和修改而不會脫離本發明的實質。檢測休眠隱生微生物的該方法範圍包括當使用610nm-680nm區內的電磁能量激發時，使用來自內在710-860nm區內的鹼土金屬吡啶二羧酸鹽的發射光。重要的實施方案包括激發這種內在發色團且隨後使用同時計算背景信號、散射激發信號和反射激發信號的方法分析檢測的發射。所有變化、修改和組合均屬於如待批權利要求所定義的本發明範圍。
權利要求
1.休眠隱生微生物的檢測方法，包括下列步驟a.用610nm-680nm的特定範圍的電磁射線波長激發內在休眠隱生微生物發色團；由此激發含有內在發色團的所述微生物以發射電磁射線；和b.檢測由710nm-860nm範圍的激發微生物發色團發射的電磁射線信號。
2.如權利要求1中所述的方法，其中所述的微生物發色團選自鹼土金屬-吡啶二羧酸鹽。
3.權利要求1所述的方法，其中待檢測的休眠隱生微生物包括細菌內生孢子、真菌孢子和原生動物卵囊。
全文摘要
本發明涉及休眠隱生微生物的檢測方法，該方法通過當用610nm－680nm區內的電磁能量激發時檢測發射自710nm－860nm區內的內在鹼土金屬吡啶二羧酸鹽的電磁射線來進行。使用低能量發射的新內在吡啶二羧酸鈣鹽能夠快速檢測細菌孢子、真菌孢子和卵囊而不需要加入任何試劑、樣品處理或接觸樣品。
文檔編號C12Q1/04GK1677089SQ20041004929
公開日2005年10月5日 申請日期2004年6月10日 優先權日2004年4月2日
發明者L·S·鮑爾斯, C·R·洛伊德 申請人:微生物系統有限合夥公司