分泌性白細胞蛋白酶抑制劑通過糜酶的加工的製作方法

2023-09-11 18:10:00

專利名稱：分泌性白細胞蛋白酶抑制劑通過糜酶的加工的製作方法
技術領域：
本發明涉及分析糜酶(chymase)活性的方法。具體而言，本發明涉 及診斷糜酶相關疾病或者通過測量SLPI加工來評價人受試者的糜酶 相關疾病的治療效率。
背景技術：
分泌性白糹田月包蛋白酶4卬製劑(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, SLPI)作為彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的11.7kD抑制劑而被 首次發現(Thompson等，Proc Natl Acad Sci U S A (《美國國家科學院 院刊》)1986; 83:6692-6)。 SLPI由肥大細胞表達(Westin等，BiolChem 1999; 380:489-93)，並存在於上氣道黏膜(Fryksmark等，Ann Otol Rhinol Laryngol 1982; 91:268畫7l)和痰(Kramps等，J Histochem Cytochem 1981; 29:712-9)中。已在鼻腔(Lee等，Am Rev Respir Dis 1993; 147:710-6)、氣管和支氣管(Kramps等，Am Rev Respir Dis 1984; 129:959-63; Mooren等，J Histochem Cytochem 1982; 30:1130-4)、上 頜竇(Fryksmark等，出處同上)以及細支氣管上皮的杯狀細胞(Willems 等，Am Rev Respir Dis 1989; 139:1244-50)中測量出大量的SLPI。SLPI的晶體學研究已表明，該分子屬於乳清酸性蛋白樣家族中的 成員(Grutter等，Embo J 1988; 7:3M-:51)。這些蛋白質具有兩組4個 二硫4建連接起來的結構域。每個結構域的4個二闢b鍵以及螺旋結構使 SLPI成為非常穩定的蛋白質。已經表明，牛(Grutter,出處同上)和綿 羊(Pemberton等，Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34)的肥大細胞 蛋白酶在Leu72-Met73處裂解SLPI。其它研究顯示出SLPI的一種較 低分子量的加工產物，但還沒有描述負責這種裂解的酶的特徵(Ota等， Hum Reprod 2002; 17:2517-22)。 SLPI被描述為糜酶的最有效抑制劑 (Walter等，Arch Biochem Biophys 1996; 327:81-8;以及Fink等，Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367:567-71)。糜酶是一種屬於肽酶家族SI的糜蛋白酶型絲氨酸蛋白酶，其在皮膚和肺的肥大細胞和小球白細胞中表達，並祐:認為在胞外基質的降 解、黏膜下腺體分泌的調節和血管活性肽的生成中起作用。 一旦肥大細胞激活後，該糜酶被釋放進胞外基質，其立即具有最大活性(Takai 等，FEBS Lett467: 141-144， 2000)。有兩種形式的哺乳動物糜酶，即 a糜酶和p糜酶，它們在物種上不同並具有不同的功能。在人和狒狒 中，只發現了a-糜酶，而在狗、大鼠和小鼠中a-糜酶和(3-糜酶兩者都 有(Dell，Italia等，Curr Opin Cardiol 2003 17: 374-379)。儘管糜酶確切的病理生理作用仍有待確定，但是已經發現其參與 微血管滲漏、嗜中性粒細胞積聚、粘液分泌的刺激以及細胞因子的調 節等方面。有效的糜酶選擇性抑制劑可能適用於肥大細胞介導的疾 病，如孝喘、肺部炎症和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。因為糜酶可以在 心臟和血管壁的血管緊張素II的生成中起作用，因此糜酶抑制劑可能 在作為血管壁損傷和炎症(動脈粥樣硬化/再狹窄)以及心臟肥大的抗高 血壓治療方面具有潛在的應用。糜酶是心血管疾病治療的靶標 (Doggrell等，Can J Physiol Pharmacol. 2005 Feb; 83(2): 123-30)。另夕卜， 已經提出糜酶在諸如類風溼性關節炎(Kobayashi等，Jpn J Pharmacol. 2002 Sep; 90(1):7-11)、糖尿病性腎病(Huang等，J Am Soc Nephrol. 2003 Jul; 14(7):1738-47)以及炎性疾病(Muto等，Idrugs.， 2002, 12， 1141-50) 之類的疾病中起重要作用。因此，設計用以抑制糜酶的生物活性的化合物可以在多個疾病領
域中提供治療效果。已經研發了選擇性糜酶抑制劑，包括TY-51076、 SUN-C8257、 BCEAB、 NK320和TEI-E548 (參見Doggrell等，出處同 上)。這些糜酶抑制劑在心肌梗塞、心肌病和心動過速誘發的心力衰竭 等的動物模型中已取得極具前景的結果。為了有利於糜酶抑制劑在人 體進行試驗，以及一般情況下人體內糜酶活性的研究，需要開發人體 內糜酶活性的生物標記。發明內容本發明發現了人糜酶在特異性位點裂解人SLPI,並且發現這種裂 解可用作糜酶活性的指示劑。當試驗一系列已知與SLPI相互作用的 蛋白酶(包括類胰蛋白酶、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和蛋白酶3)時， 這種裂解是糜酶特異性的。在一個一般方面，本發明提供了檢測人受試者的糜酶相關疾病的 方法，該方法包括以下步驟a)從人受試者獲得生物樣品；b)測量該 生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)將步驟b)所測水平與在 健康人受試者中人糜酶裂解人SLPI的對照水平相比較，其中人糜酶 裂解人SLPI的水平與所述對照相比升高表明所述人受試者患有糜酶 相關疾病或患糜酶相關疾病的風險增加。在另 一個一般方面，本發明提供了評價治療人患者的糜酶相關疾 病的效果的方法，該方法包括以下步驟a)從人患者獲得生物樣品； b)測量在所述生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)將步驟b) 所測水平與人患者治療前人_糜酶裂解人SLPI的對照水平相比較，其 中人糜酶裂解人SLPI的水平與所述對照相比P爭低表明對所述患者的 糜酶相關疾病的所述治療是有效的。本發明還提供了一種測量人糜酶生物活性的方法，該方法包括以 下步驟a)使人糜酶與人SLPI在測定混合物中接觸；b)在所述人糜酶 裂解所述人SLPI的條件下孵育所述測定混合物；和c)測量所述測定 混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平。 本發明還提供了 一種鑑定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，該方法包括以下步驟a)使試驗化合物與人糜酶和人SLPI在測定混合 物中接觸；b)在所i^A糜酶裂解所逸人SLPI的條件下孵育所述測定混 合物；c)測量所述測定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平；和d)將步 驟c)檢測的水平與從對照的檢測水平相比較，在對照中，所述測定混 合物中未包含所述試-驗化合物。另外，本發明還提供了與本發明的方法相關的試劑盒。 本發明的另 一 方面是一種篩分具有更好機會響應涉及糜酶抑制 劑的治療的患者的方法，該方法包括以下步驟a)從患者獲得生物樣 品；b)測量所述生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)將步驟 b)所測水平與健康人受試者中人糜酶裂解人SLPI的對照水平相比較， 其中人糜酶裂解人SLPI的水平與所述對照相比升高表明所述患者具 有更好機會響應涉及糜酶抑制劑的治療。根據以下的公開，包括本發明詳細的描述和其優選的實施方案以 及所附的權利要求書，本發明的其它方面、特徵和優點將顯而易見。


圖1表示人糜酶對重組人SLPI (rSLPI)的消化。每一泳道的樣品 是1 -蛋白質分子量標準品(BechMark， Invitrogen); 2 - SLPI， 0小 時；3 -糜酶+ SLPI， 20分鐘；4 -糜酶+ SLPI, 140分鐘；5 -糜 酶+SLPI, 4小時；6-糜酶+SLPI, 21小時；7 - SLPI， 21小時；8 -糜酶21小時；9 - 1 ug糜酶；10 -蛋白質分子量標準品(Mark-12, Invitrogen)。圖2說明已知的糜酶抑制劑降低了糜酶對rSLPI的裂解水平。數 字0、 8、 80、 800表示存在於測定混合物中以皮摩爾濃度為單位的糜 酶抑制劑的量。 ，圖3說明糜酶能夠裂解存在於人唾液樣品中的SLPI，並且說明糜 酶抑制劑降低了裂解水平。
圖4比較了取自正常人受試者和患有糜酶相關疾病的患者的唾液 樣品中SLPI裂解的水平。圖5說明cSLPI的增加與變應性症狀的增加相關。通過蛋白質印 跡分析測定了抗原攻擊前0.75小時和0.5小時以及抗原攻擊後0.5小 時和7小時從個體獲得的鼻灌洗液中cSLPI與總SLPI的比率(圖5b)。 在相同時間點，對患者的症狀強度進行評分(Lebel評分)(圖5a)。圖6說明嗜喘的痰樣品中的cSLPI/總SLPI百分比要比正常痰樣 品的高，並與這些個體的糜酶水平相關。痰樣品是從正常受試者和哮 喘受試者獲得的。通過蛋白質印跡分析測定了 cSLPI與SLPI的比率 和糜酶水平兩者。通過光密度測定分析法測定各值。
具體實施方式
本文引用的所有出版物均以引用方式併入本文。除非另有說明， 否則本文使用的所有科技術語均與本發明所屬領域的普通技術人員 通常所理解的意思相一致。本文所用的術語"含有，，、"包含，，、"具有"和"包括"以它 們開放的、非限制性的意思使用。下列為本說明書中時常用到的縮寫詞bp =鹼基對cDNA=互補DNACOPD= 'f曼性阻塞性肺疾病ELISA=酶聯免疫吸附測定；kb=千》威基；1000》威基對PAGE=聚丙烯醯胺凝膠電泳PCR=聚合酶鏈式反應SDS=十二烷基石危酸鈉SLPI =分泌性白細胞蛋白酶抑制劑本文所用的術語"糜酶的生物活性"是指根據標準技術在體內或
者體外測定的由糜酶發揮的活性。示例性的糜酶生物活性，包括但不 限於其將血管緊張素I轉化為血管活性肽血管緊張素II的能力、將大 內皮素1選擇性地轉化為31個胺基酸長的肽內皮素1的能力、降解 胞外基質的能力、裂解幹細胞因子以產生具有生物活性的可溶性產物 的能力、加工前膠原酶、炎性細胞因子和其它生物活性肽(包括本文所描述的SLPI)的能力，等等。本文所用的"生物樣品"是指包含細胞或組織物質或者由細胞或 組織物質組成的樣品，例如從受試者分離的細胞或者生物體液。"受 試者"可以是已成為治療、觀察或實驗對象的哺乳動物，例如大鼠、 小鼠、猴或人。生物樣品的實例包括(例如)痰、血液、血細胞(例如白 細胞)、羊水、血漿、精液、唾液、骨髓、組織或細針活組織檢查樣品、 尿液、^JI液、胸膜液和細胞培養物。生物樣品也可以包括組織切片， 例如用於組織學目的的冷凍切片。試驗生物樣品是已成為分析、監測 或觀察對象的生物樣品。對照生物樣品可以是試驗生物樣品的陽性對 照或陰性對照。通常，對照生物樣品包含與試驗生物樣品類型相同的 目標組織、細胞和/或生物體液。在具體實施方案中，生物樣品是"臨 床樣品，，，其為源自人患者的樣品。"細胞"是指適於檢測方法的靈敏度的至少一個細胞或多個細胞。 細胞可以存在於培養的細胞培養物中。細胞也可以存在於其天然環境 (例如生物組織或者生物體液)中。適用於本發明的細胞可以是細菌的， 但優選是真核的，並且最優選是哺乳動物的。本文所用的"人糜酶"是指最初^^A體分離的糜酶。糜酶為屬於 肽酶家族Sl的糜蛋白酶型絲氨酸蛋白酶。糜酶的異名包括肥大細胞 蛋白酶I;骨骼肌蛋白酶；皮膚糜蛋白酶型蛋白酶；肥大細胞絲氨酸 蛋白酶，肥大細胞絲氨酸糜酶；以及骨骼肌(SK)蛋白酶。糜酶裂解的 優先順序是Phe-|-Xaa>Tyr+Xaa>Trp+Xaa〉Leu+Xaa。示例性的 "人糜酶"具有SEQ ID NO:l的胺基酸序列，其在GenBank蛋白質ID: NP—001827中已有描述。本文所用的"人糜酶，，包括在SEQIDNO:l
中描述的人糜酶的結構和功能多態性。"多態性"是指群體中個體之 間在特定遺傳基因座的 一組遺傳性變型。本文所用的"糜酶相關疾病"或"糜酶相關障礙"是指與糜酶的 過度活性或過度表勤目關的疾病或障礙，或者是可通過在受試者中降 低糜酶的生物活性或P爭低糜酶的量來治療或改善的疾病或障礙，以及 在受試者中伴有這種疾病或障礙的亞臨床表現或狀態。示例性的"糜 酶相關疾病"包括但不限於哞喘、變應性鼻炎、纖維變性、高血壓、 心臟肥大、心力衰竭、類風溼性關節炎、糖尿病性腎病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和炎性疾病。本文所用的"人SLPI"是指最初/AA體分離的分泌性白細胞肽酶 抑制劑。SLPI的異名包括ALP、 MPI、 ALK1、 BLPI、 HUSI、 WAP4、 WFDC4和HUSI-I。 SLPI保護上皮組織免受絲氨酸蛋白酶的破壞。其 已在多種分泌物(包括精液漿、宮頸粘液和支氣管分泌物)中發現，並 且對於胰蛋白酶、白細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G具有親和性。它 的抑制作用通過保護上皮表面免受內源性蛋白水解酶的攻擊而有助 於免疫應答；這種蛋白還被認為具有廣譜抗生素活性。示例性的"人 SLPI"具有SEQ ID NO:2的胺基酸序列，其為在GenBank蛋白質ID: NP_003055中描述的蛋白質的成熟部分。本文所用的"人SLPI"包括 在SEQ IDNO:2中描述的人SLPI的結構和功能多態性。"人糜酶裂解人SLPI的水平"是指由人糜酶裂解或蛋白水解的人 SLPI的程度或數量。本文所用的"人糜酶裂解人SLPI的水平"可測 量為存在於試驗生物樣品或測定混合物中的糜酶裂解得到的人SLPI 片段與全長SLPI的比率。"糜酶裂解得到的人SLPI片段"是指由糜酶蛋白水解或裂解SLPI 而產生的人SLPI部分。在本發明中發現，人糜酶在Leu72-Met73之 間裂解人SLPI,其中數字72或73是指從人SLPI的氨基端開始計數 的胺基酸殘基的位置。因此，示例性的"糜酶裂解得到的人SLPI片 段"可以是SEQ ID NO:2的Serl—Leu72片段或Met73—Alal07片段， 其分別包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的胺基酸序列。本文所用 的"糜酶裂解得到的人SLPI片段"包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 中描述的人SLPI片段的結構和功能多態性。"核苷酸序列"是指單鏈或雙鏈形式的多聚體中脫氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸殘基的排列。核酸序列可由以下;威基的天然核苷酸構 成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥噤呤和尿嘧啶，分別縮寫為T、 A、 C、 G和U;和/或由天然核苷酸的合成類似物構成。"分離的"核酸分子是與天然來源的核酸中存在的至少一種其它 核酸分子基本上分離的核酸分子，或者當核酸分子經化學合成時，基 本上不含至少一種化學前體或其它化學物質。"分離的，，核酸分子還 可以是例如基本上不含至少一個這樣的核苷酸序列的核酸分子在核 酸所來源的生物體的基因組DNA中，該核苷酸序列在其5'端和3，端 天然鄰接所述核酸分子。在核酸分子的製備中，當有少於大約30%、 20%、 10%或5% (以乾重計)的其它核酸分子或其它化學物質(本文也 稱為"汙染核酸分子"或"汙染化學物質")時，所述核酸分子與其它 核酸分子或其它化學物質"基本上分離"或者"基本上不含"其它核 酸分子或其它化學物質。分離的核酸分子包括但不限於獨立於其它序列的單獨核酸分子 (例如由PCR或限制內切核酸酶處理產生的cDNA或基因組DNA片 段)，以及整合到載體、自主複製質粒、病毒(例如逆轉錄病毒、腺病 毒或皰滲病毒)中或整合到原核生物或真核生物的基因組DNA中的核 酸分子。另外，分離的核酸分子可以包括作為雜交或融合核酸分子的 組成部分的核酸分子。分離的核酸分子可以是如下所獲得的核酸序 列(i)通過(例如)聚合^式反應(PCR)體外擴增；(ii)通過(例如)化學 合成方法合成；(iii)通過克隆而重組產生；或(iv)通過裂解和電泳或色 譜分離而純化。術語"寡核苷酸"或"寡"指的是長度相對短，例如長度小於100 個殘基的單鏈DNA或RNA序列。對於許多方法，大約16-25個核苷
酸長的寡核苷酸是有用的，儘管有時也可以利用大於大約25個核苷 酸的較長寡核苷酸。某些寡核香酸可以用作合成互補核酸鏈的"引 物"。例如，DNA引物可以與互補核酸序列雜交，以在使用DNA聚 合酶的反應中引發互補DNA鏈的合成。寡核苷酸在幾種核酸檢測方 法(例如RNA印跡或原位雜交)中也可用於雜交。術語"多肽，，、"蛋白質，，和"肽"在本文中可互換使用，是指 胺基酸殘基通過肽鍵或經修飾的肽鍵連接起來的胺基酸鏈。胺基酸鏈 可以是大於兩個胺基酸的任何長度。除非另有說明，否則術語"多肽"、 "蛋白質，，和"肽"還涵蓋其多種修飾形式。這種修飾形式可以是天 然存在的修飾形式或化學修飾形式。修飾形式的實例包括但不限於糖 基化形式、磷酸化形式、豆蔻醯化形式、棕櫚醯化形式、核糖基化形 式、乙醯化形式、泛素化形式等。修飾也包括分子內交聯和共價結合 至多種部分，例如脂質、黃素、生物素、聚乙二醇或者其衍生物等。 此外，修飾還可以包括環化、支化和交聯。另外，除了由基因密碼子 編碼的常規的二十種胺基酸以外的胺基酸也可以包含在多肽中。"分離的蛋白質"是與天然來源的蛋白質中存在的至少一種其它 蛋白質基本上分離的蛋白質，或者當蛋白質經化學合成時，基本上不 含至少一種化學前體或其它化學物質。在蛋白質的製備中，當有少於 大約30%、 20%、 10%或5%(以乾重計)的其它蛋白質或其它化學物質 (本文也稱為"汙染蛋白質"或"汙染化學物質")時，所述蛋白質與 其它蛋白質或其它化學物質"基本上分離"或者"基本上不含"其它 蛋白質或其它化學物質。分離的蛋白質可具有幾種不同的物理形式。分離的蛋白質能夠以 全長新生多肽或未經加工的多肽，或以經部分加工的多肽或經加工多 肽的組合的形式存在。全長的新生多肽可以通過特異性蛋白酶解事件 進行翻譯後修飾，導致形成全長新生多肽的片段。 一個片段或者是多 個片段的物理締合可以具有與全長多肽有關的生物活性；然而，與各 個片段有關的生物活性的程度可以變化。
分離的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，"分離的多肽"可 以是"雜交多肽"。"分離的多肽，，還可以是通過胺基酸的添加或缺 失或取代而衍生自天然多肽的多肽。分離的多肽也可以是"純化多 肽"，"純化多肽，，在本文中用於指基本均質製劑中的特定多肽，該製劑基本上不含其它細胞組分、其它多肽、病毒材料或培養基；或者 當多肽經化學合成時，基本上不含與化學合成有關的化學前體或副產 物。"純化多肽"可通過標準純化技術從天然或重組宿主細胞獲得或 者通過化學合成獲得，這對於技術人員來說是顯而易見的。術語"雜交蛋白"、"雜交多肽"、"雜交肽"、"融合蛋白"、 "融合多肽"和"融合肽"在本文中可互換使用，是指非天然存在的 多肽或者分離的多肽，其具有特定多肽分子及與其共價連接的一個或 多個其它多肽分子，所述的其它多肽分子在天然情況下並不與該特定 多肽相連接。因此，"雜交蛋白，，可以是通過共價鍵結合在一起的兩 種天然存在的蛋白質或片段。"雜交蛋白，，還可以是通過將兩種人工 多肽通過共價鍵結合在一起而形成的蛋白質。通常但不是必然地，兩 個或更多個多肽分子通過形成單條非分支多肽鏈的肽鍵結合或"融 合"在一起。本文所用的術語"蛋白片段"是指代表部分蛋白質的多 肽。"重組(的)"是指已經用分子生物學技術修飾為某些方面不同於其 天然狀態的核酸、由核酸編碼的蛋白質、細胞或病毒顆粒。例如，重 組細胞可以包含細胞的天然(非重組)形式中未發現的核苷酸序列，或 者可以表達其他異常的、表達不足的或根本不表達的天然基因。重組 細胞還可以包含在細胞的天然形式下發現的基因，其中該基因#^務飾 並通過人工手段重新導入該細胞中。該術語還涵蓋含有內源核酸的細 胞，該內源核酸已被修飾而沒有將該核酸從該細胞中除去；此種修4牟 包括例如通過基因置換和定點突變獲得的那些修飾。"重組宿主細胞"是已將重組DNA序列導入其中的細胞。重組 DNA序列可用任何適合的方法(包括例如電穿孔、磷酸釣沉澱、顯微
注射、轉化、基因槍和病毒感染)導入宿主細胞中。重組DNA可以或 不可以整合進(共價連接至)構成細胞基因組的染色體DNA中。例如， 重組DNA可以保持在游離型元件，例如質粒上。或者，對於穩定轉 化或轉染的細胞，重組DNA已整合進染色體中，使得其通過染色體 複製為子細胞所遺傳。這種穩定性通過穩定轉化或轉染的細胞建立由 一群含有該外源DNA的子細胞組成的細胞系或克隆的能力來i正明。 重組宿主細胞可以是原核的或真核的，包括細菌(例如大腸桿菌)、真 菌細胞(例如酵母)、哺乳動物的細胞(例如人、牛、豬、猴和齧齒動物 來源的細胞系)以及昆蟲細胞(例如源自果蠅屬(Drosophila)和蠶的細胞 系)。還應該理解，術語"重組宿主細胞"不僅指特定的主題細胞，還 指這種細胞的子代或潛在的子代。因為由於突變或者由於環境影響， 在後代中可能發生某些修飾，因此這種子代實際上可能與母體細胞不 相同，^f旦仍包括在本文所用的術語的範圍內。"序列，，是指在多聚體中單體的線性順序，例如，多肽中胺基酸 的順序或多核苷酸中核苷酸的順序。如本領域所知的，"序列同一性或相似性"是兩個或更多個多肽 序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關係，可通過比較所述序列 確定。如本文所用的，在兩個或更多個核酸序列或兩個或更多個多肽 序列之間的關係的內容中，"同 一性"分別指在將序列進行最佳比對 和分析時，相同的核苷酸或胺基酸殘基的百分比。為了將查詢序列與 (例如)胺基酸序列SEQ ID NO:2比較，將該查詢序列與SEQ ID NO:2 進行最佳比對，並獲得在SEQ ID NO:2的整個長度上的最佳局部比對。分析可通過人工進行或用序列比較算法實現。對於序列比較，通 常將一個序列作為參考序列，將查詢序列與其進行對比。當使用序列 比較算法時，將待測序列和參考序列輸入計算機中，指定子序列坐標 (如果必要的話)，並指定序列算法的程序參數。用於比較的序列的最佳比對可以(例如)通過使用同源性比對算法 (Needleman和Wunsch, J Mol. Biol., 48:443 (1970))進行。執行Needleman和Wunsch分析的軟體可以通過在巴斯德研究所(法國)生物 豐欠4牛網http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/ interfaces/needle.html公開i也獲 得。當考慮兩個序列的全長時，NEEDLE程序利用Needleman-Wunsch 全局比對算法來發現它們的最佳比對(包括空位)。將同一性計算為在 報告的比對區域(包括該長度中的任何空位)上兩個序列間的相同匹配 的百分比。還提供了相似性分數，其中相似性計算為在報告的比對區 域(包括該長度中的任何空位)上兩個序列間的匹配百分比。標準的對 比利用了用於蛋白質序列的EBLOSUM62矩陣和用於核苷酸序列的 EDNAFULL矩陣。空位開放罰分(gap openpenalty)是產生空位減去的 分數；使用空位開放罰分的默認設置為10.0。對於空位延伸(gap extension),對於空位中的每一個鹼基或殘基，罰分被力n入標準的空位 罰分；默認設置為0.5。雜交也可被用作測試來表明兩種多核苷酸基本上與彼此相同。具 有高度同一性的多核苷酸在嚴格雜交條件下彼此雜交。"嚴格雜交條 件"具有本領域已知的含義，如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)中描述的一樣。示例性的嚴格雜交條 件包括在約45'C下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在 50-65。C下在0.2xSSC和0.1% SDS中進行一次或多次洗滌，視雜交的 多核苷酸共享互補性長度的不同而異。"載體"是指異源核酸可以插入或被插入其中的核酸分子。 一些 載體可以被導入允許該載體複製或允許由該栽體或構建體編碼的蛋 白質表達的宿主細胞中。載體通常具有選擇標記，例如，編碼耐藥性 蛋白的基因、複製起點序列以及允許插入異源序列的多克隆位點。載 體通常是基於質粒的，並且質粒由小寫字母"p"後面跟著字母和/或 數字的組合進行命名。本文所公開的起始質粒是市售的、可在不受限 制的基礎上可公開獲得的，或者可以通過應用本領域已知的方法從可 獲得的質粒構建。根據本發明可以使用的許多質粒和其它克隆載體和表達載體對於本領域技術人員是熟知的並且容易獲得。此外，技術人 員可容易地構建適用於本發明的任何數量的其它質粒。根據本公開內 容，本發明中這種質粒以及其它載體的特性、構建和使用，對技術人 員將是顯而易見的。
在實踐本發明時，使用了分子生物學、」微生物學和重組DNA中 的許多常規技術。這些技術是熟知的，並且在例如以下文獻中有詳細 說明F.M. Ausubel編輯,Current Protocols in Molecular Biology,第I、 II和III巻(1997); Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor, NY (2001)。
本發明提供了通過測量人糜酶裂解人SLPI的水平來測量人糜酶 的生物活性的一般方法。
在一個一般方面，本發明提供了通過測量生物樣品中人糜酶裂解 人SLPI的水平，檢測人受試者的糜酶相關疾病的方法。患有糜酶相 關疾病的人受試者可能具有過度活性的糜酶或者水平升高的糜酶。因 此，與健康人受試者的生物樣品相比，從這類人受試者中取得的生物 樣品包含更多由糜酶在特異性位點Leu72-Met73處進行的SLPI裂解。
任何類型的生物樣品都可用於本發明。在具體實施方案中，生物 樣品可以為唾液、痰、鼻腔滲出液、ELF或者灌洗液。生物才羊品可以 以本領域技術人員已知的方式從人受試者中得到。對照生物樣品包含 與試驗生物樣品類型相同的目標組織、細胞和/或生物體液，並且可從 一個或一群未被診斷患有糜酶相關疾病的健康人中獲得。
全長人SLPI的水平和由糜酶裂解產生的SLPI片段的水平都可從 生物樣品中測得，並可用於定量人糜酶裂解人SLPI的水平。生物樣 品中全長人SLPI的水平和由糜酶裂解產生的SLPI片段的水平可通過 本領域技術人員已知的用於蛋白質定量的任何手段測量。
在一個實施方案中，SLPI或SLPI片段可從生物樣品分離或純化 並測定其含量。使用本領域已知的方法，例如基於大小的分離方法(例 如凝膠過濾)，SLPI或SLPI片段可容易地從剩餘的生物樣品中分離出
來。另外，樣品還原以後，樣品中SLPI或者SLPI片段可在凝膠(例如 聚丙烯醯胺凝膠)上進行分離，隨後利用與蛋白質複合物有免疫反應的 抗體作免疫印跡。或者，SLPI或SLPI片段的水平可在生物樣品中確定而無需分離 或純化。為此目的，優選的是在免疫測定法中使用與SLPI或SLPI片 段選擇性發生免疫反應的抗體。例如，可使用免疫細胞化學方法。也 可以使用其它熟知的基於抗體的技術，包括例如酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、萸光免疫測定、 蛋白A免疫測定和免疫酶測定(EMA)。例如，參見美國專利第 4，376，110和4，486，530號，兩者都以引用的方式併入本文。然後，將人糜酶裂解人SLPI的水平計算為存在於試驗生物樣品 或測定混合物中糜酶裂解產生的人SLPI片段與全長SLPI的比率。與 對照樣品相比，試驗樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平升高表明，人 受試者患有糜酶相關疾病或發生糜酶相關疾病的風險增高。在另一個一般方面，本發明通過測量治療前、治療期間或治療後 人糜酶裂解人SLPI的水平，提供了評價治療人患者的糜酶相關疾病 的效果的方法。對糜酶相關疾病的有效治療將P條低人患者體內糜酶的 生物活性或者降低糜酶的含量。因此，將在有效治療後在取自這種人 患者的生物樣品中觀察到糜酶在特異性位點Leu72-Met73對人SLPI 的裂解較少。作為對照，包含與試驗生物樣品相同類型的目標組織、 細胞和/或生物體液的生物樣品可在治療前從同一人患者獲得。與對照 樣品相比，試驗樣品中人糜酶裂解人SLPI水平的降低表明對所述患 者的糜酶相關疾病的治療是有效的。本發明的方法還包括分析與糜酶相關疾病相關的其它生物標記、 表型或生理學變化的步驟。例如，在哞喘中，最近據報導在哞喘患者 中，VEGF水平和氣道血管通透性指數與氣道阻塞和氣道對乙醯曱膽 鹼反應性過高的程度呈負相關(Kanazawa等，Clin Exp Allergy 2005年 11月，35(11): 1432-6)。具體而言，發現在不患潰瘍性結腸炎(UC)的哮
喘患者和患有潰瘍性結腸炎的哞喘患者中，誘導的痰中VEGF水平和 氣管血管通透性指數顯著高於正常對照或潰瘍性結腸炎患者(出處同上)。因此，在診斷哮喘症的本發明方法中，或在評價治療哞喘症有效 性的本發明方法中，該方法還包括在人受試者誘導的痰中分析VEGF 表達水平的步驟。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種炎症性肺疾病，與不是完全可 逆的進行性氣流限制相關。COPD包括通常與吸菸相關的慢性阻塞性 支氣管炎和肺氣腫。儘管COPD精確的病因學未知，醫學文獻提出在 某些情況下，COPD可能代表了自非常嚴重的慢性哮喘開始的病理學 發展。因此，目前可用於治療COPD的療法主要是那些設計來減輕與 哞喘相關的氣道炎症和肺部炎症的方法。目前的療法包4舌口力良或吸入 皮質類固醇和支氣管擴張藥，例如|32-腎上腺素能激動劑和膽鹼能拮抗 劑。因此，可以預期用於哞喘的新療法也將是COPD的可能療法。關 於COPD的綜述參見de Boer, W. I. ， Perspectives for cytokine antagonist therapy in COPD， Drug Discovery Today, 10(2):93， 2005;和Barnes, P.J.， New Treatments for COPD, Nature Reviews-Drug Discovery, 1: 437， 2002。.同哮喘一樣，COPD的炎症方面可通過包括白細胞(例如 嗜中性粒細胞和巨噬細胞)流入肺和氣道的炎症反應來表徵。這種流入 是與哮喘和COPD兩者都相關的氣道和肺部炎症的特點之一。因此， 在診斷COPD症的本發明方法或評價治療COPD症的有效性的本發明 方法中，所述方法還包括測量白細胞流入肺和氣道的步驟。細胞因子是哮喘和COPD中的關鍵炎性介質。促炎細胞因子尤其 包括白介素(IL)-1、胂瘤壞死因子(TNF)-a和巨噬細胞趨化因子 (MCP)-1。治療譯喘和COPD的有效治療劑往往降低這些促炎細胞因 子的水平。因此，在診斷哮喘或COPD症的本發明方法或評價治療哮 喘或COPD症的有效性的本發明方法中，所述方法還包括測量受試者 細胞因子水平的步驟。本發明的另 一方面是篩分有較好機會響應糜酶抑制劑治療的患
者的方法，該方法包括測量這些患者的SLPI裂解水平的步驟。具有 更多SLPI裂解的患者可能具有機能亢進的糜酶，並因而可能更能響 應糜酶抑制劑療法。例如，哮喘可由縮窄相關的(應用支氣管擴張器) 和/或氣道構造相關的(粘液過度產生)活動產生。仍需確定肥大細胞及 其釋放的糜酶的作用是否涉及嗜喘的異常病理生理學特徵中的任一 個或兩者。因此，哮喘可能是糜酶依賴性機理和/或糜酶非依賴性機理 的結果。為此目的，糜酶對SLPI的特異性裂解可用於糜酶非依賴性 哮喘人群與糜酶依賴性哮喘人群的聯繫或驗證或將這兩種人群分開， 以加強糜酶抑制劑的效力性能。本發明還提供了鑑定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，該方 法包括以下步驟a)使試驗化合物與人糜酶和人SLPI在測定混合物中 接觸；b)在其中人糜酶裂解人SLPI的條件下孵育測定混合物；c)測量 測定混合物中由糜酶裂解產生的人SLPI片段的水平；和d)將乂人步驟 c)中檢測的量與來自對照樣品的檢測結果比較，其中測定混合物中未 包含試驗化合物。化合物鑑定方法可利用常規的實驗室形式，或在適用於高通量的 測定法中進行。術語"高通量"是指允許容易同時地和/或快速連續地 篩選多個樣品的測定設計，並且可包括機器人操作的能力。高通量測 定的另一個理想的特徵為一種優化以減少試劑使用，或使操作次數最 小化以便實現所需分析的測定設計。測定形式的實例包括用於液體處 理實驗的96孔板或384孔板、懸浮液滴(levitatingdroplet)和"晶片實 驗室"微通道晶片。本領域技術人員熟知，隨著塑料模具和液體處理 設備小型化的發展，或隨著設計出改進的測定設備，可以用本發明的 設計處理更大量的樣品。任何試驗化合物可在本發明的篩選測定法中篩選，以選擇本發明 的蛋白質複合物的調節劑。術語"鑑定"化合物旨在既涵蓋(a)從先前 未知為糜酶調節劑的群組中選擇化合物；又涵蓋(b)測試已知能夠結合 或調節糜酶功能和活性的化合物。這兩種類型的化合物在本文中都統 稱為"試驗化合物"或"候選化合物"。候選化合物涵蓋大量的化學 類別，包括但不限於小的有機或無機化合物、天然或合成的分子，例如抗體、蛋白質或其片段、反義核酸、幹擾RNA (iRNA)和核酶以及 它們的衍生物、模擬物和類似物。優選地，它們為小分子有機化合物， 即分子量不大於10,000道爾頓，更優選分子量小於5，000道爾頓。優 選的是，試驗化合物是以本領域已知的文庫形式提供，例如以化學合 成文庫(一般參見Gordan等，J. Med. Chem.， 37:1385-1401 (1994))、重 組表達文庫(例如噬菌體展示文庫)以及基於體外翻譯的文庫(例如核 糖體展示文庫)的形式提供。候選化合物包括與多肽的結構相互作用所必需的化學官能團，並 且通常包括至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，優選至少兩個化學官 能團，更優選至少三個化學官能團。候選化合物可以包含環碳或雜環 結構和/或被一個或多個上述官能團取代的芳族結構或聚芳族結構。候 選化合物還可為生物分子，例如肽、糖類、脂肪酸、甾醇、類異戊二 烯、嘌呤、嘧啶、上述物質的衍生物或結構類似物或者其組合等。如 果化合物為核酸，則該化合物通常為DNA或RNA分子，儘管還可以 想到具有非天然鍵或亞單元的修飾核酸。候選化合物從各種來源獲得，包括合成化合物文庫或天然化合物 文庫。例如，大量手段可用於各種有機化合物和生物分子的隨機合成 和定向合成，包括隨機化寡核苷酸的表達、合成的有機組合文庫、隨 機肽的噬菌體展示文庫等。候選化合物還可用本領域已知的組合文庫 方法中的多種方法的任何一種獲得，包括生物文庫；空間可尋址平行 固相或液相文庫需要重疊合法的合成文庫方法；"一珠一化合物" 文庫方法以及用親和色語選擇的合成文庫方法(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。或者，可以得到或容易地產生細菌、真菌、植物 和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，天然的文庫和化合物以 及合成產生的文庫和化合物可以容易地通過常規的化學、物理和生化 手段進行修飾。
此外，已知的藥理性藥物可以經過定向或隨機的化學修飾，例如 醯化、烷基化、酯化、醯胺化等來產生藥理性藥物的結構類似物。候 選化合物可以隨機選擇或者可基於結合和/或調節糜酶活性的功能的 現有化合物。因此，候選藥物的來源是一個或多於一個的分子文庫， 所述的分子是基於一種或多種提高或降低糜酶活性的已知化合物，其 中所述化合物的結構在分子的一個或多個位置經過改變以包含更多 或更少的化學部分或不同的化學部分。在產生類似物激活劑/抑制劑的 文庫時對分子所做的結構改變可以是定向的、隨機的或定向和隨機的 組合的取代和/或添加。在製備組合文庫時，本領域普通技術人員可以 基於現有化合物容易地製備這種文庫。多種其它試劑也可被包含於混合物中。這些試劑包括諸如鹽、緩 衝劑、中性蛋白質(例如白蛋白)、去垢劑等之類的試劑，其可用以促 進最佳的蛋白質-蛋白質和/或蛋白質-核酸的結合。這種試劑還可降低 反應組分的非特異性或背景相互作用。也可以使用提高測定效果的其 它試劑，例如核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。分子文庫的合成方法的實例可在本領域中找到，例如在Zuckermann等(1994) J Med. Chem. 37:2678中找到。化合物文庫可存 在於溶液中(例如Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)或微珠上 (Lam (1991) Nature 354:82-84)、 晶片上(Fodor (1993) Nature 364:;555-556)、細菌中(美國專利第5，223，409號)、孢子中(美國專利第 5，571，698號)、質粒中(Cull等(1992) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)或噬菌體中(例如參見Scott和Smith (1990) Science 249:3 86-390)。可以測試選擇的化合物降低糜酶在特異性位點Leu72-Met73裂 解SLPI的生物活性的能力。在測試過程中，可以將試驗化合物在SLPI 之前、之後或同時加入糜酶中，作為SLPI蛋白酶活性的底物。通常， 進行了對照測定，在該對照測定中上述篩選測定法是在不存在試-驗化 合物時進行。然後，將該對照試驗的結果與試驗化合物存在情況下獲
得的結果相比較。篩選測定中的糜酶或SLPI可以是分離的或不分離的。在一個實 施方案中，基本純化的糜酶或SLPI可用於篩選測定中。對技術人員 顯而易見的是，任何重組表達方法都可用於本發明，用以表達和純化 SLPI或糜酶。可用於本發明的示例性核酸分子包括編碼人糜酶或SLPI 的核酸分子。通常，核酸，優選DNA形式的核酸， 一旦導入宿主細胞後，就 整合進載體中以形成能夠指導產生相互作用蛋白成員的表達載體。許 多類型的載體可用於本發明。了解了本發明後，構建用於本發明目的 的表達載體的方法對技術人員來說將是顯而易見的。(一般參見 Current Protocols in Molecular Biology,第2巻，Ausubel等主編，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience,第13章，1988; Glover, DNA Cloning,第II巻，IRL Press, Wash.， D.C.,第3章，1986; Bitter 等，Methods in Enzymology， 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern等主編，Cold Spring Harbor Press, 第I和II巻,1982;和Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989)。一般來講，表達載體包括表達盒，該表達盒具有啟動子及與其有 效連接的編碼相互作用蛋白質成員的DNA。該啟動子可以是天然啟動 子，即在天然存在的細胞中發現的負責所述相互作用蛋白質成員在所 述細胞中表達的啟動子。或者，表達盒可以為嵌合型表達盒，即具有 不是天然啟動子的異源啟動子，其負責所述相互作用蛋白質成員在天 然存在的細胞中表達。表達載體還可以包含用於該載體在宿主細月包中 複製的DNA複製起點。優選的是，表達載體還包括用於載體在(例如) 大腸桿菌中擴增的複製起點，以及用於選擇和僅維持包含該表達載體 的宿主細胞的選擇標記。這樣構建的表達載體可通過本領域已知的任何技術，例如，通過 直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔、病毒感染、脂轉染、基因槍等 技術導入宿主細胞中。目標蛋白質的表達可以是瞬時的或穩定的。表 達載體可以在宿主細胞中以染色體外狀態，即作為自我複製質粒或病 毒而保持。或者，表達載體可通過常規技術，例如穩定細胞系或位點 特異性重組的選擇而整合到宿主細胞的染色體中。在穩定細胞系中， 至少表達載體的表達盒部分被整合到宿主細胞的染色體中。載體構建體可以設計為適於在多種宿主細胞中表達，所述宿主細 胞包括但不限於細菌、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞以及哺乳動物 和人細胞。製備表達載體用於在不同宿主細胞中表達的方法對於技術人員來i兌應該是顯而易見的。糜酶或SLPI的同系物和片段也可用上述重組方法容易地表達。 例如，為了表達蛋白片段，可以選擇摻入表達載體的DNA片段，使 得其僅編碼該蛋白片段。同樣，特定的雜交蛋白可用編碼該雜交蛋白 的重組DNA進行表達。類似地，同系物蛋白質可用編碼該同系物蛋 白質的DNA序列進行表達。編碼同系物的DNA序列可以通過用重組 DNA技術操縱天然蛋白質編碼序列得到。為此目的，可用本領域公知 的技術進行隨機誘變或定點誘變。為了製備蛋白質衍生物，例如，天 然的相互作用蛋白成員的胺基酸序列可以通過定點DNA誘變以預定 方式來改變，以產生或移除共有序列。在另一個實施方案中，本發明涉及的糜酶或SLPI可以存在於生 物樣品，例如唾液、痰、鼻腔滲出物、ELF和灌洗液等中。糜酶或SLPI 還可以與細胞締合或存在於細胞溶解產物中。本發明還包括在糜酶活性的 一個或多個其它測定中對化合物進 行測試的步驟。可以針對其它的糜酶活性對化合物作進一步測試，所 述的其它活性包括但不限於其將血管緊張素I轉化為血管活性肽血 管緊張素II的能力、將大內皮素1選擇性地轉化為31個胺基酸長的 肽內皮素l的能力、降解胞外基質的能力、裂解幹細胞因子以產生具 有生物活性的可溶性產物的能力、加工前膠原酶、炎性細胞因子和其 它生物活性肽的能力，等等。在一個具體實施方案中，可以在包含糜
酶和顯色底物的酶抑制測定中進一步測試化合物(參見例如Garavilla 等，TheJ.Bio. Chem.2005, 280:18001-18007)。本發明的方法還包括在糜酶相關疾病的動物模型中測試該化合 物的步驟。例如，公認的氣道炎症模型是豬蛔蟲(^yc^ly犯w附)抗原誘 發的哮喘綿羊模型。將試驗化合物給予該綿羊模型後，嗜中性粒細胞 和巨噬細胞流入的減少將給本領域普通技術人員提示，該化合物將可 用於治療與哮喘和COPD相關的氣道和肺部炎症。氣道炎症的另 一個 模型是大鼠的脂多糖(LPS)誘發的氣道中性白細胞增多，其中，將LPS 導入肺時，白細胞流入支氣管肺泡灌洗液中。將試驗化合物給予該大 鼠模型後，逆轉的LPS誘發的氣道炎症，和支氣管肺泡灌洗液中的中 性白細胞數降低，將給本領域普通技術人員提示，該試驗化合物將可 用於治療哮喘和COPD。哮喘和COPD的又一個模型是大鼠的糖原誘 發的急性腹膜炎模型。當將試驗化合物給予該大鼠模型後，經糖原處 理的大鼠的腹水和血漿中促炎細胞因子(尤其是包括IL-1、 TNF-a和 MCP-1)的水平降低證明，該試驗化合物將可用於治療孝喘和COPD。實施例1人糜酶在特異性位點裂解重組人SLPI 儘管有研究人員已經報導了牛(Grutter等，Embo J 1988; 7:345-51) 和綿羊(Pemberton等，Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34)肥大細 胞蛋白酶能裂解人SLPI，但是沒有報導it^糜酶裂解SLPI的研究。 本實施例研究了人糜酶裂解重組人SLPI (rSLPI)的能力。重組人SLPI和山羊抗SLPI多克隆抗體從R&D systems (Minneapolis, MN)獲得。兔抗SLPI抗體從Abeam (Cambridge, MA) 獲得。人糜酶和類胰蛋白酶從Cortex Biochem (San Leandro, CA)獲得。 組織蛋白酶G和彈性蛋白酶購自Biodesign International (Saco, ME), 蛋白酶3購自Fitzgerald Industries International (Concord, MA)。除非 另有說明，否則本文包括的其它實施例中也可以使用類似的試劑。
將重組人SLPI與人糜酶(摩爾比40:1)在37。C下於0.1 M Tris-HCl， pH8.0， 0.5MNaCl中孵育。在多個時間點後收集樣品。將 還原的樣品在4-12% SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen)(每孔2ug rSLPI)上分離並用考馬斯染料染色。圖1顯示將rSLPI與人糜酶孵育大約20分鐘後觀察到重組人SLPI 的裂解。甚至在rSLPI十倍過量於糜酶時，大部分rSLPI蛋白仍被裂 解(數據未顯示)。全長人SLPI被裂解成兩個片段。質語分析表明，大 約11.7 kD的全長人SLPI被裂解為大小大約7.9 kD和3.8 kD的兩個 片段。為確定裂解的確切位點，對全長(圖1,條帶A)和裂解片段的條 帶(圖1，條帶B和C)進行N-端測序。測序分析表明重組人SLPI在 Leu72-Met73處祐人糜酶裂解。該結果表明，已知的糜酶抑制劑SLPI (Fink等，BiolChemHoppe Seyler 1986; 367:567-71)還充當糜酶的底 物。這與牛和綿羊肥大細胞蛋白酶裂解人SLPI的活性一致(Grutter等， 出處同上；和Pemberton等，出處同上)。利用LC/MS分析測試了一系列蛋白酶(包括彈性蛋白酶、組織蛋 白酶G、類胰蛋白酶和蛋白酶3)裂解重組人SLPI的能力。已知這些 蛋白酶受SLPI抑制。將重組人SLPI(l嗎)與試驗蛋白酶(50ng)孵育5 小時。然後在50mM NH4HCO3緩衝液中將樣品稀釋至大約0.1嗎蛋 白/^d。使用Agilent 1100 LC/MSD進行液相色鐠測定。將稀釋樣品(IO pl)以0.2 mL/min的流速注入Zorbax SB300 5u C8, C18 (150x2.1 mm) 柱上。使用30分鐘的15%至60%的溶劑A中的溶劑B梯度洗脫樣品 內的蛋白質，其中溶劑A為(0.1%曱酸+0.02%TFA)/H2O;和溶劑 B為(0.1%曱酸+ 0.02% TFA)/ACN。在10.7分鐘的保留時間檢測到 裂解的rSLPI，而在12.2分鐘檢測到完整的SLPI。 Agilent 1100 MSD SL 質譜儀通過電噴射電離源與1100HPLC系統相接。系統控制和數據獲 取使用10.02版的Chemstation軟體。通過LC/MS，天然rSLPI得以分離並且已檢測到11708道爾頓的 預期大小。與糜酶孵育後，從HPLC解析出第二個峰。這第二個峰具
有另外的18個質量單位，與水添加至有切口的或裂解的rSLPI分子一 致。因此，第二個峰的存在表明糜酶的確裂解了 rSLPI,如從SDS-PAGE 分析所觀察到的。rSLPI與所述蛋白酶組中其它蛋白酶的孵育沒有導 致形成第二個峰，表明測試的其它蛋白酶不裂解rSLPI。在蛋白酶存 在情況下rSLPI樣品的還原確實導致了 SLPI蛋白的裂解，表明其它蛋 白酶能夠裂解還原形式的rSLPI。其它蛋白酶不能裂解SLPI與Vogelmeier等人的研究一致，該研 究表明SLPI沒有被彈性蛋白酶和組織蛋白酶G裂解(J Clin Invest 1991; 87:482-8)。實施例2糜酶抑制劑降^A糜酶對人rSLPI的裂解本實施例研究了糜酶抑制劑對人糜酶裂解人SLPI的影響。對多 種濃度的兩種糜酶抑制劑進行了測試糜酶抑制劑A: [2-(3-{曱基 -[1-(萘-2-羰基)-哌啶-4-基]-氨曱醯基}-萘-2-基)-1-萘-1-基-氧代-乙基]-膦酸)，其在US20030195172中已有描述；和糜酶抑制劑B: {(5-氯-苯並|>]噻吩-3-基)-[2-(3-氯-5-氟-苯基)-乙烯基氨曱醯基]-曱基}-曱基 次膦酸，其在US20050176769中已有描述。在存在或不存在糜酶抑制劑的情況下，將重組人SLPI (80皮摩爾) 與人糜酶(80皮摩爾)在1M Tris緩沖液(pH 7.5)或PBS中於37。C下孵 育30分鐘。進行蛋白質印跡分析，以對rSLPI的量和較大的SLPI裂 解產物(根據質譜分析，大約為7.9 kD)的量進行定量。將樣品用等體 積的含SDS緩衝液和含|3-巰基乙醇的緩衝液變性和還原。將每種樣品 加到4-20%的梯度聚丙烯醯胺凝膠或15%的聚丙烯醯胺凝膠上。樣品 進行電泳，再轉移至PVDF膜(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)上。 將印跡於室溫下在5。/。乳/PBS-吐溫(PBS/0.4。/。吐溫-20)中阻斷1小時。 將印跡與在封閉溶液稀釋的一抗(山羊抗SLPI以1:1000稀釋的或兔抗 SLPI以1:2000稀釋)在4。C下孵育過夜。用PBS-吐溫洗滌三次後，將
印跡與在封閉稀釋液中以1:2500稀釋的二抗(山羊抗兔HRP或兔抗山 羊HRP)在室溫下將育1小時。將印跡用PBS-吐溫洗塗6次，與Wester Lightning化學發光試劑(Perkin Elmer， Boston, MA)在室溫下孵育1 分鐘，並在暗室中對Biomax Light膠片(Eastman Kodak ， Rochester ， NY)進行顯影。將購自Alpha Innotech (San Leandro, CA)的光密度計 FluorChem(tm) 8000凝月交成4象系統(Advanced Fluorescence ， Chemiluminescence and Visible Imaging System)用於觀'J量與顯影月交片 上rSLPI的量和較大SLPI裂解產物的量相關的密度。用以下公式計算SLPI裂解的百分比lOOx (較大的SLPI裂解產 物的密度/(rSLPI的密度+較大的SLPI裂解產物的密度))。圖2顯示了糜酶抑制劑對糜酶裂解SLPI的影響。抑制的量與所 加入的糜酶抑制劑的量直接相關。這說明了該測定法對確定糜酶抑制 劑化合物的功效的有用性。實施例3人糜酶裂解臨床樣品中的人SLPI本實施例說明了測定SLPI裂解的離體測定法，該SLPI來自可容 易獲取的臨床樣品-人唾液。將10 pl人唾液與糜酶(4嗎/0.1U/5 MM)和/或糜酶抑制劑(100 pM) 在37°C (用PBS使總體積達到30 pl)孵育30分鐘。將10 jal唾液稀釋 於20 pi PBS作為未消化的唾液樣品。如實施例2所述，進4亍蛋白質 印跡分析以測定唾液樣品中SLPI的量和較大的SLPI裂解產物的量， 並計算SLPI裂解的百分比。圖3顯示了外源性糜酶裂解唾液樣品中的SLPI,如同其對rSLPI 的裂解。還顯示了糜酶抑制劑對糜酶裂解SLPI的能力的影響。糜酶 抑制劑{(5-氯-苯並[1)]噻吩-3-基)-[2-(3，4-二氟-苯基)-乙烯基氨曱醯基]-甲基卜曱基次膦酸，在US20050176769中已有描述。抑制劑降低了糜 酶活性並抑制了對來自唾液的SLPI的裂解(圖3)。這些結果表明，可
以用唾液樣品監測糜酶的活性以及糜酶抑制劑的效果。與實施例1的結果一致，測試的一系列蛋白酶中，唾液中SLPI 的裂解對於糜酶是獨特的。當將唾液樣品與組織蛋白酶G、類胰蛋白 酶和蛋白酶3孵育時，沒有觀察到較大SLPI裂解產物。唾液與彈性 蛋白酶孵育後觀察到SLPI的少量消化。然而，所得的消化產物雙條 帶(SDS-PAGE分析後大約為11 kD和10.5kD)與糜酶消化產生的裂解 產物的大小不同。實施例4SLPI加工作為糜酶相關疾病的生物標記測量來自正常受試者和變態反應患者的人唾液樣品中SLPI的裂 解，所述變態反應與糜酶活性過強相關。唾液樣品是從人受試者獲得的 一名受試者主訴由於暴露於小鼠 而誘發的變應性症狀(變態反應)，另一名受試者沒有呼吸性疾病(正 常)。樣品在-80。C下冷凍保存。樣品在水上解凍，渦旋。將唾液(10pl) 用PBS(15fxl)稀釋。如實施例2所述，進行蛋白質印跡分析以測定唾 液樣品中SLPI的量和較大的SLPI裂解產物的量，並計算SLPI裂解 的百分比。圖4顯示了正常受試者和變態反應患者的唾液樣品之間SLPI裂 解量的差異。在變態反應唾液樣品中觀察到更高百分比的SLPI裂解， 表明SLPI加工可以用作糜酶相關疾病的生物標記。實施例5將下列方法用於研究患有變應性鼻炎的受試者中，在基線時和響 應相關變應原時的鼻內上氣道炎症的可溶性組分(介質、細胞因子)。材料1支移液管(>10 cc)或10 cc注射器無菌洗鼻液0.9%NaCl， 1個鼻孔10ml，預熱至37°C
預熱裝置 棉紙漏鬥(40 mm) 注射器(10cc) 塑料容器 鼻鏡冰的0.1%塞洛唑啉鼻噴霧劑(根據De Graaf-In't Veld C等，Clin Exp Allergy 1995; 25:966-73 的有效技術改進)1. 0.9%NaCl無菌溶、^i口熱至37°C。2. 用鼻鏡和足夠光照檢查鼻子的可達性。3. 受試者就座後伸長其脖子大約30°。用移液管或注射器向該 名受試者的一個鼻孔內滴入lOcc已加熱的0.9%NaCl溶液。 指導受試者在操作過程中不要吞咽或呼吸。4. IO秒鐘後，讓受試者彎腰躬身並逐漸從其鼻子中排出洗滌液 至漏鬥(與10 cc注射器連接)中。5. 攻擊前，總共採用了 4次鼻腔洗滌以除去碎片。6. 為測試第1天研究的可重複性，第2天(攻擊前)分析了第一 次洗滌液；第2天第一次洗鼻後，在另外3個NAL操作過程 前每個鼻孔用0.1%賽洛唑啉噴霧1次IO分鐘(不允許受試者 擤鼻涕)。7. 數分鐘後，進行第二次和第三次洗鼻(並處理)。8. 將第4次洗滌液保存於水上的塑料容器中直至處理。9. 1小時內進行所有的NAL,並保存在水上直至處理時。結果見圖5。圖5說明了 cSLPI的增加與變應性症狀的增加相關。 通過蛋白質印跡分析測定了抗原攻擊前0.75小時和0.5小時和抗原攻 擊後0.5小時和7小時從個體獲得的鼻灌洗液中cSLPI與總SLPI的比 率(圖5b)。在相同時間點，對患者的症狀強度進行評分(Lebel評分)(圖 5a)。 ，實施例6使用歐洲呼吸協會(ERS)推薦法和包括高滲或等滲鹽溶液吸入的 規程從受試者收集痰。在輕度至中度哞喘患者中，用高滲鹽水誘發痰， 其中鹽水:帔氣霧化並以3-4個5分鐘的周期吸入。在更嚴重的哮喘患 者中，使用改良ERS規程，以吸入正常鹽水開始，更緩慢發展至高滲 鹽水，只要FEVi沒有顯著下降。結果見圖6。圖6說明了哮喘的痰樣品中的cSLPI/總SLPI百分 比要比正常痰樣品的高，並且與這些個體的糜酶水平相關。痰樣品是 從正常受試者和哮喘受試者獲得的。通過蛋白質印跡分析確定cSLPI 與SLPI的比率和糜酶水平。通過光密度測定分析法測定各值。
權利要求
1. 一種檢測人受試者的糜酶相關疾病的方法，包括以下步驟a. 從所述人受試者獲得生物樣品；b. 測量所述生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 將步驟b)所測水平與健康人受試者的人糜酶裂解人SLPI的對照水平相比較，其中人糜酶裂解人SLPI的水平與所述對照相比升高表明所述人受試者患有糜酶相關疾病或患糜酶相關疾病的風險增加。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是唾液。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述糜酶相關疾病選自p孝 喘、變應性鼻炎、纖維變性、高血壓、心臟JI巴大、心力衰竭、類風溼 性關節炎、糖尿病性腎病、嚢性纖維化、COPD和炎性疾病。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI的 水平以所述生物樣品中存在的糜酶裂解產生的人SLPI片段與全長 SLPI的比率來測量。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人SLPI 片段基本上由SEQIDNO:3的氨基^列組成。
6. 根據權利要求4所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人SLPI 片段基本上由SEQIDNO:4的胺基酸序列組成。
7. 根據權利要求4所述的方法，其中所述全長人SLPI基本上由 SEQ ID NO:2的胺基酸序列組成。
8. —種評價治療人患者的糜酶相關疾病的有效性的方法，包括以 下步驟a. 從人患者獲得生物樣品；b. 測量所述生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 將步驟b)所測水平與人患者治療前人糜酶裂解人SLPI的對照 水平相比較，其中人糜酶裂解人SLPI的水平與所述對照相比降低表 明對所述患者的糜酶相關疾病的治療是有效的。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述生物樣品是唾液。
10. 根據權利要求8所述的方法，其中所述糜酶相關疾病選自哮 喘、變應性鼻炎、纖維變性、高血壓、心臟肥大、心力衰竭、類風溼 性關節炎、糖尿病性腎病、嚢性纖維化、COPD和炎性疾病。
11. 根據權利要求8所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物樣品中存在的糜酶裂解產生的人SLPI片段與全長 SLPI的比率來測量。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人 SLPI片IS:基本上由SEQIDNO:3的氨基酉齡列組成。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人 SLPI片段基本上由SEQ ID NO:4的胺基酸序列組成。
14. 根據權利要求11所述的方法，其中所述全長人SLPI基本上 由SEQ ID NO:2的胺基酸序列組成。
15. 根據權利要求8所述的方法，其中所述對人患者的糜酶相關 疾病的治療包括應用降低糜酶生物活性的化合物。
16. —種測量人糜酶的生物活性的方法，包括以下步驟a. 使人糜酶與人SLPI在測定混合物中接觸；b. 在其中所述人糜酶裂解所述人SLPI的條件下孵育所述測定混 合物；和c. 測量在所述測定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人糜酶包括SEQ ID NO:l的胺基酸序列。
18. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人SLPI包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列。
19. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物樣品中存在的糜酶裂解產生的人SLPI片段與全長 SLPI的比率來測量。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人　SLPI片段基本上由SEQIDNO:3的胺基酸序列組成。
21. 根據權利要求19所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:4的胺基酸序列組成。
22. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人SLPI是分離的。
23. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人SLPI是在生物樣 品內。
24. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人糜酶是分離的。
25. 根據權利要求16所述的方法，其中所述人糜酶是在生物樣品內。
26. —種鑑定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，包括以下步驟a. 使試驗化合物與人糜酶和人SLPI在測定混合物中接觸；b. 在其中所述人糜酶裂解所述人SLPI的條件下孵育所述測定混 合物；c. 測量在所述測定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平；和d. 將步驟c)所檢測的水平與從對照檢測到的水平相比較，其中所 述測定混合物中未包含所述試驗化合物。
27. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人糜酶包括SEQ ID NO:l的胺基酸序列。
28. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人SLPI包括SEQ ID NO:2的氨基^列。
29. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物樣品中存在的糜酶裂解產生的人SLPI片段與全長 SLPI的比率來測量。
30. 根據權利要求29所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:3的氨基^列組成。
31. 根據權利要求29所述的方法，其中所述糜酶裂解產生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:4的氨基斷列組成。
32. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人SLPI是分離的。
33. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人SLPI是在生物樣 品內。
34. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人糜酶是分離的。
35. 根據權利要求26所述的方法，其中所述人糜酶是在生物樣品內。
36. —種試劑盒，包括a. 特異性結合SLPI片段的抗體，該SLPI片段基本上由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的胺基酸序列組成；和b. 用於將所述SLPI片段的測量水平與人糜酶生物活性相關聯的 說明書。
37. —種篩分具有更好機會響應涉及糜酶抑制劑的治療的患者的 方法，包括以下步驟a. 從患者獲得生物樣品；b. 測量所述生物樣品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 將步驟b)所測水平與健康人受試者的人糜酶裂解人SLPI的對 照水平相比較，其中人糜酶裂解人SLPI的水平與所述對照相比升高 表明所述患者具有更好的才凡會響應涉及糜酶抑制劑的治療。
全文摘要
現在發現，人糜酶在特異性位點裂解人SLPI，並且這種裂解可以用作糜酶活性的指示。本發明提供了通過測量SLPI加工來診斷人受試者的糜酶相關疾病或評價對人受試者的糜酶相關疾病治療效果的方法，以及其它相關方法和組合物。
文檔編號G01N33/53GK101401001SQ200780008605
公開日2009年4月1日 申請日期2007年1月12日 優先權日2006年1月12日
發明者M·R·德安德裡, S·貝爾科夫斯基 申請人:詹森藥業有限公司