小麥乙烯受體蛋白及其編碼序列的製作方法

2023-09-12 02:52:00 2

專利名稱：小麥乙烯受體蛋白及其編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物學領域，具體地說，本發明涉及新的小麥(Triticumaestivum)乙烯受體蛋白及其多核苷酸編碼序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。具體地說，本發明的多肽是一種與植物的熟性有關的、具有乙烯結合能力的乙烯受體蛋白。
背景技術：
控制農作物熟性的因素十分複雜，有關控制作物熟性的基因及其產物的研究歷來是植物生長發育研究領域的熱點課題。乙烯作為控制作物生長發育的五大植物激素之一，是作物成熟和衰老過程中最主要的調節因子，乙烯信號啟動了作物體內一系列與控制熟性有關的基因表達和酶系反應。
乙烯受體蛋白是乙烯生物合成和乙烯信號傳遞途徑中的一個關鍵的信號傳遞因子，廣泛存在於各類農作物、瓜果蔬菜及花卉中，決定乙烯的生物合成以及植物對乙烯的敏感能力，並控制植物成熟和衰老的進程。
首例乙烯受體蛋白編碼基因基因etr1於1993年從模式植物擬南芥中克隆到，其後採用etr1基因片段作為探針，在不足6年的時間內從馬鈴薯、蘋果、香蕉和番茄等近30種作物的cDNA庫中，成功地克隆了與擬南芥乙烯受體蛋白編碼基因在功能和結構上同源的熟性相關基因。國外已從數十種作物、蔬菜、水果和花卉中克隆到與熟性相關的乙烯受體蛋白編碼基因，但目前尚無小麥乙烯受體基因克隆的相關研究報導。
植物乙烯感應機制及其相關基因在結構和功能上高度保守性，這種保守性使乙烯受體蛋白在調節各類植物乙烯生物合成和乙烯信號傳導中具有廣泛的生物學功能，該蛋白結構上的變異、甚至是某個胺基酸殘基的點突變，均會導致轉基因植株在葉片脫離、花期延遲或果實成熟等性狀的變化，這在擬南芥、菸草、石竹等植物的轉基因植株構建上均有成功的例子。
與熟性相關的乙烯受體蛋白編碼基因在植物葉片脫落和果實成熟中起著重要的作用，其突變導致屬主植物熟性改變。擬南芥乙烯受體蛋白的顯性突變等位基因etr1-1在轉基因的香石竹中異源表達，使異源屬主獲得乙烯不敏感特性，從而導致熟性的變異。大約一半的轉基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了6天，延遲期最長達16天。轉基因花不表現花瓣內捲曲的典型的乙烯依賴性衰敗現象，轉基因植株的花瓣始終保持堅挺，直至逐步褪色和腐爛。
為了有效地、針對性地改變植物品種的成熟性(如花期延長或果實成熟延緩)，本領域迫切需要開發與成熟性有關的蛋白及其編碼基因。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的乙烯受體蛋白(即小麥乙烯受體蛋白)以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在改變植物成熟性(如花期延長或果實成熟延緩)方面的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的小麥乙烯受體蛋白多肽，該多肽源自小麥的，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結合功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述小麥乙烯受體蛋白多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-2223位的序列；(b)具有SEQ ID NO8中1-2223位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達小麥乙烯受體蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的小麥乙烯受體蛋白多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-2226個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗小麥乙烯受體蛋白多肽活性的化合物，以及抑制小麥乙烯受體蛋白多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在小麥乙烯受體蛋白的方法，它包括將樣品與小麥乙烯受體蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在小麥乙烯受體蛋白。
在本發明的第八方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用於篩選促進小麥乙烯受體蛋白多肽活性的激動劑，或者篩選抑制小麥乙烯受體蛋白多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的小麥乙烯受體蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
在本發明的第九方面，提供了一種改變植物成熟性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列，所述的小麥乙烯受體蛋白多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結合功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次從小麥中分離獲得了新的乙烯受體蛋白，發現其與其他物種中分離的乙烯受體蛋白有一定同源性，並且通過實驗證實了小麥乙烯受體蛋白具有乙烯結合能力，並且轉入植物後，可導致植物熟性的變化。在此基礎上完成了本發明。
在本發明中，術語「小麥乙烯受體蛋白」、「小麥乙烯受體蛋白多肽」或可互換使用，都指具有小麥乙烯受體蛋白胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的小麥乙烯受體蛋白或多肽」是指小麥乙烯受體蛋白多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化小麥乙烯受體蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括小麥乙烯受體蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然小麥乙烯受體蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「小麥乙烯受體蛋白多肽」指具有小麥乙烯受體蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與小麥乙烯受體蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括小麥乙烯受體蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與小麥乙烯受體蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗小麥乙烯受體蛋白多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含小麥乙烯受體蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了小麥乙烯受體蛋白多肽的可溶性片段。通常，該片段具有小麥乙烯受體蛋白多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供小麥乙烯受體蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然小麥乙烯受體蛋白多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「小麥乙烯受體蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼小麥乙烯受體蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的小麥乙烯受體蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或小麥乙烯受體蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的小麥乙烯受體蛋白多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼小麥乙烯受體蛋白多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，小麥乙烯受體蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含小麥乙烯受體蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得成熟性改變(如花期延長或果實成熟延緩)的植物。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的小麥乙烯受體蛋白或多肽有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗小麥乙烯受體蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組小麥乙烯受體蛋白篩選多肽庫可用於尋找有價值的能抑制或刺激小麥乙烯受體蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對小麥乙烯受體蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與小麥乙烯受體蛋白基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制小麥乙烯受體蛋白的分子，也包括那些並不影響小麥乙烯受體蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的小麥乙烯受體蛋白基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的小麥乙烯受體蛋白基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達小麥乙烯受體蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的各類抗體可以利用小麥乙烯受體蛋白基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與小麥乙烯受體蛋白基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗小麥乙烯受體蛋白的抗體可用於檢測樣品中的小麥乙烯受體蛋白。
多克隆抗體的生產可用小麥乙烯受體蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
本發明還涉及定量和定位檢測小麥乙烯受體蛋白水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的小麥乙烯受體蛋白水平，可用於解釋小麥乙烯受體蛋白在成熟性方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在小麥乙烯受體蛋白的方法是利用小麥乙烯受體蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與小麥乙烯受體蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在小麥乙烯受體蛋白。
本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用小麥乙烯受體蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測小麥乙烯受體蛋白的轉錄產物。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從小麥cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2226個鹼基，其開放讀框位於1-2223位，編碼全長為741個胺基酸的小麥乙烯受體蛋白(SEQ IDNO2)。小麥乙烯受體蛋白具有明確的結合乙烯的功能，但結合能力比見報導的擬南芥野生型ETR1低10倍，顯示其較強的延遲花期或果實成熟能力。此外，小麥乙烯受體蛋白在核酸水平上與已見報導的乙烯受體基因的最高同源性為64.2％，最低為43.3％，在胺基酸水平上的同源性最高為56.4％，最低為39.8％，是一個能用於構建延遲花期或果實成熟的轉基因花卉、果蔬等轉基因植物的新基因。
小麥乙烯受體蛋白為改變植物的成熟性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。可以通過與熟性相關的基因如乙烯受體蛋白編碼基因的導入，改變現有優良農作物品種的熟性，獲得轉基因早熟小麥、水稻或其它農作物品種，解決農業生產中存在的實際問題。
轉乙烯受體蛋白編碼基因植株通過改變或打亂宿主植物的乙烯信號傳遞的遺傳控制機理，使轉基因植株獲得乙烯敏感或不敏感特性，在熟性上表現出早熟或晚熟等變異。這一技術路線完全不僅在研究思路和構建途徑上有創新性，而且還具有更強的可操作性和更高的成功率。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1小麥乙烯受體蛋白基因的克隆使用Qiagen公司的mRNA Isolation Kit按公司提供的試劑盒操作說明書分離純化小麥的mRNA。使用Promega公司的Universal Riblone cDNASynthesis System，以上述分離的mRNA為模板，逆轉錄合成cDNA。選用λgt11噬菌體載體(Promega)，與加EcoRI接頭的cDNA連接成重組體，然後包裝鋪板。噬菌斑密度大約為15000pfu/Φ150mm平板，噬菌體DNA轉移至尼龍膜。採用隨機引物法標記擬南芥、水稻和菸草乙烯受體基因DNA為探針，65℃雜交20-24小時。根據雜交結果挑取陽性噬菌斑，共獲得10個陽性噬菌斑。
經酶切和進一步的雜交鑑定確定其中一個含完整小麥的乙烯受體蛋白ETR1基因。經全核苷酸序列分析結果表明小麥乙烯受體蛋白編碼基因全長為2226bp(SEQ ID NO1)，其ORF位於1-2223位，編碼全長為741個胺基酸的小麥乙烯受體蛋白，其序列如SEQ ID NO2所示。
實施例2RT-PCR法獲得小麥乙烯受體蛋白的編碼序列為了驗證序列的正確性，根據SEQ ID NO1的序列，設計和合成了如下引物正向引物5』-3』 27ATGGGACCCGGATCAGTTG (SEQ ID NO3)反向引物5』-3』 2190 TTGATTCCAGCTTTGCAAGG (SEQ ID NO4)以用常規方法抽提的小麥Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨後94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，回收，連接到T-Easy載體上採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果結果驗證了小麥乙烯受體蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO1)的正確性。
實施例3小麥乙烯受體蛋白的結構分析將小麥乙烯受體蛋白全長序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL +DDBJ +PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations +PDB +SwissProt +Superdate+PIR資料庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現小麥乙烯受體蛋白及其編碼基因與已報導的下列物種的乙烯受體蛋白有一定同源性在核苷酸水平上，與擬南芥、水稻和菸草的乙烯受體蛋白基因的同源性分別為43.3％，46.6％、64.2％；在胺基酸水平上，與擬南芥、水稻和菸草的乙烯受體蛋白的同源性分別為48.2％、39.8％、56.4％。
此外，小麥乙烯受體蛋白基因在SEQ ID NO1的187-210位處含保守的乙烯結合位點的典型結構tttatagttctttgtggagcaaca(SEQ ID NO5)，相應的胺基酸殘基為SEQ ID NO2中的63-70位FIVLCGAT(SEQ ID NO6)。這暗示本發明蛋白具有乙烯受體蛋白的相應功能。
實施例4小麥乙烯受體蛋白的點突變據報導，擬南芥乙烯受體蛋白的顯性突變等位基因etr1-1當胺基酸序列中65位半胱氨酸殘基(Cys65)點突變為酪氨酸(Tyr)或絲氨酸殘基(Ser)後突變蛋白不能結合乙烯，在轉基因的香石竹中異源表達，使異源屬主獲得乙烯不敏感特性，從而導致熟性的變異。大約一半的轉基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了6天，延遲期最長達16天。
在本實施例中，在分析小麥乙烯受體蛋白序列的基礎上，在需要突變的部位設計引物ttttatcgttctttatggagcaa(SEQ ID NO7)，使用TaKaRa MutanBEST Kit，以實施例2中獲得的PCR產物為模板，通過PCR擴增獲得SEQ ID NO2中第67位半胱氨酸殘基(tgt)Cys67點突變為酪氨酸Tyr67(tat)的突變等位基因etrw02(即SEQ ID NO1中第200位g→a)。
採用BioDev PCR產物快速純化回收試劑盒並應用Promega pGEM-T EasyVector Systems對PCR產物進行克隆，連接產物通過轉化進入到E.coli DH5α中，然後在含Ap(50μg/ml)/IPTG/X-gal的LB平板上選擇白斑。經核苷酸序列分析證明67位半胱氨酸殘基(tgt)確實已點突變為酪氨酸(tat)。將該點突變的基因定名為小麥乙烯受體基因突變體etrw02。
實施例5小麥乙烯受體蛋白及其突變體etrw02在酵母菌中表達及其乙烯結合能力本實施例中，使用中間過渡載體—轉運載體pPIC9K(購自Invitrogen公司)。pPIC9質粒由兩區段組成，一區段來源於常用的大腸桿菌克隆載體pBR322，包括複製起始區(ori)和氨苄青黴素抗性基因片斷；另一區段來源於巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)染色體上的酒精氧化酶基因片段的表達盒，主要結構如下酒精氧化酶基因的5』旁側序列—酒精氧化酶基因啟動子—酒精氧化酶基因終止區-3』旁側序列。外源植酸酶基因插入到酒精氧化酶基因啟動子之後。
將實施例2獲得的小麥乙烯受體基因，實施例4獲得的突變體ETRW02基因和擬南芥野生型etr1基因插入到轉運載體pPIC9的多克隆位點上(EcoRI酶切位點)，與a-因子信號肽編碼序列正確融合，受可誘導的酵母酒精氧化酶AOX1啟動子控制，得到重組轉運載體pPETRW01(小麥野生型)、pPETRW02(小麥突變體)和pPETRA01(擬南芥野生型)。
以pPETRW02為例，在重組畢赤酵母的構建過程中，首先要將重組轉運載體pPETRW02中的來源大腸桿菌的DNA部分用限制性內切酶BglII切去，用剩下的DNA部分電擊轉化畢赤酵母，通過其上的酒精氧化酶基因的3』旁側序列和5』旁側序列與酵母染色體上的同源序列進行同源重組，將位於酒精氧化酶基因的3』旁側序列和5』旁側序列之間的植酸酶基因雙交換整合到酵母染色體上，並替換下染色體上的酒精氧化酶基因，使酵母由能利用甲醇為碳源生長變為不能利用甲醇生長，利用此標記初步篩選到重組酵母(mut-)，進一步通過受體酵母為His缺陷型而重組後將變為非缺陷型這一標記，最終篩選到重組酵母P.pastorispPETRW02。
按相同方法，獲得重組酵母pPETRW01和pPETRA01(對應於小麥乙烯受體蛋白和擬南芥的etr1)。
採用14C標記乙烯利(購自Sigma公司)，研究小麥乙烯受體基因及其突變體ETRW02在酵母菌中的乙烯結合功能。
結果表明，含擬南芥野生型ETR1的酵母菌的乙烯結合能力為5700±21014C2H4dpm/mg，含小麥的ETR1的酵母菌的乙烯結合能力為1456±13314C2H4dpm/mg，而65位半胱氨酸被取代的突變體ETRW02的乙烯結合能力為580±10514C2H4dpm/mg。小麥的ETR1的乙烯結合能力比擬南芥野生型ETR1低約4倍，而小麥ETR1突變體乙烯結合能力比擬南芥野生型ETR1低10倍。
實施例6小麥乙烯受體蛋白基因突變體etrw02的植物表達載體在本實施例中，將etrw02中BamH1/EcoR1片段克隆到pUC衍生質粒pAB80(p35s-gusA-Tnos)(購自Stratagene公司)上，替代gusA基因，使etrw02基因被控制在CaMV 35s啟動子(全植株表達)之下。具體步驟如下1.用PCR引物AB33和AB34擴增得到etrw02 5』端3.1kb片段。擴增產物用BamH1/EcoR1酶切，將酶切片段連接到用同樣雙酶切的pAB80質粒上，得質粒pBWE-2。
AB33上遊引物(-440 to-417)5』端含有BamH1酶切位點5』-CCCGGATCCTCTTCTCCGATCAATTCTTCCC-3』(SEQ ID NO8)AB34下遊引物(+2657 to+2638)，5』端含有EcoR1酶切位點5』-CCGGAATTCGCCTTTACATGCCCTCG-3』(SEQ ID NO9)2.用PCR引物AB35和AB36擴增得到etrw02 3』端3.9kb。擴增產物經EcoR1酶切後連接到同樣用EcoR1酶切的pBWE-2質粒上。這樣克隆有正確表達方向的質粒稱謂pBWE22。
AB35上遊引物(+2638 to+2657)，3』端含有EcoR1酶切位點5』-CGAGGGCATGTAAAGGCGAATTCCGG-3』(SEQ ID NO10)AB36下遊引物(+5659 to+2640)，5』端含有EcoR1酶切位點5』-CCGGAATTGGTCTAAACAACGCCAAG-3』(SEQ ID NO11)3.pBWE22上的SalI/ClaI片段(含完整的突變體基因etrw02，其表達由CaMV 35s啟動子控制)插入到二元載體pAB2(Stratagene公司)中，得到質粒pBWE220。
按相同方法，獲得含完整的野生型基因etrw01，其表達由CaMV 35s啟動子控制的質粒pBWE110。
實施例7花期延長的轉基因香石竹的構建將二元載體pBWE220分別利用三親結合方法從E.coli中轉到Agrobacteriumtumefaciens AGLO(購自Stratagene公司)，助質粒為pRK2013(購自Stratagene公司)。而後用Agrobacterium tumefaciens轉染香石竹葉片。在、待分化培養基上長出分化芽後，轉入生根培養基誘導生根。一周後於溫室培養共得到12株經Southern和Northern雜交證明確實含有小麥etrw02(67位半胱氨酸被酪氨酸取代的突變體)基因片段的轉基因植株。
轉基因植株的花期與非轉基因植株比較，大約一半的轉基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了8天，延遲期最長達20天。轉基因花不表現花瓣內捲曲的典型的乙烯依賴性衰敗現象，轉基因植株的花瓣始終保持堅挺，直至逐步褪色和腐爛。
按相同方法，使用質粒pBWE110將野生型的小麥乙烯受體蛋白基因轉入香石竹，獲得轉基因的植株，結果大約三分之一的轉基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了4天，延遲期最長達10天。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國農業科學院原子能利用研究所120小麥乙烯受體蛋白及其編碼序列13002527816011170PatentIn version 3.121012112226212DNA213小麥(Triticum aestivum)220221CDS222(1)..(2223)2234001atg gat tgt aaa ggc ttt gtt ccc caa tgg gac ccg gat cag ttg tta48Met Asp Cys Lys Gly Phe Val Pro Gln Trp Asp Pro Asp Gln Leu Leu1 5 10 15atc aaa tta acg tat acc tcc ata ttc ttt att gca tgg gcc ata cct96Ile Lys Leu Thr Tyr Thr Ser Ile Phe Phe Ile Ala Trp Ala Ile Pro20 25 30ccc atc cat att agg ggt gaa ttc ttc gtt act aag gtc gct ttt aaa144Pro Ile His Ile Arg Gly Glu Phe Phe Val Thr Lys Val Ala Phe Lys35 40 45ttt cca tat aaa agc tgg gta ctc gtc gtg cag ttt ggt gct ttt ata192Phe Pro Tyr Lys Ser Trp Val Leu Val Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile50 55 60gtt ctt tgt gga gca aca cat ctt atc aac ttg tgg act ctc acc ccc240Val Leu Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Leu Thr Pro65 70 75 80cat aca agg act gtg gcg ata gtg aaa cca aac gca tta gtc ttg act288His Thr Arg Thr Val Ala Ile Val Lys Pro Ash Ala Leu Val Leu Thr85 90 95gct gta gtg tcc tgt gca acg 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1.一種分離的小麥乙烯受體蛋白多肽，其特徵在於，它包含具有SEQ IDNO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結合功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-2223位的序列；(b)具有SEQ ID NO8中1-2223位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達小麥乙烯受體蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的小麥乙烯受體蛋白特異性結合的抗體。
10.一種改變植物成熟性的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列，所述的小麥乙烯受體蛋白多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結合功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發明提供了一種新的乙烯受體蛋白－小麥乙烯受體蛋白，編碼小麥乙烯受體蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種小麥乙烯受體蛋白的方法。本發明還公開了編碼這種小麥乙烯受體蛋白的多核苷酸的用途，尤其是用於改變植物的成熟性。
文檔編號C07K14/415GK1480464SQ0213678
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月4日 優先權日2002年9月4日
發明者林敏 , 楊滔, 王憶平, 陸偉, 林 敏 申請人:中國農業科學院原子能利用研究所