一種用於檢測婦科慢性盆腔炎的試劑盒及其檢測方法與流程

2023-09-11 20:18:55

本發明涉及醫學檢測領域，特別涉及一種用於婦科中慢性盆腔炎診斷用的適配子及其試劑盒。
背景技術：
：慢性盆腔炎是指女性內生殖器及其周圍結締組織、盆腔腹膜的慢性炎症。其主要臨床表現為月經紊亂、白帶增多、腰腹疼痛及不孕等，如已形成慢性附件炎，則可觸及腫塊。症狀可見：1)慢性盆腔痛：慢性炎症形成的瘢痕粘連以及盆腔充血，常引起下腹部墜脹、疼痛及腰骶部酸痛。常在勞累、性交後及月經前後加劇。2)不孕及異位妊娠：輸卵管粘連阻塞可致不孕和異位妊娠。急性盆腔炎後不孕發生率為20％～30％。3)月經異常：子宮內膜炎常有月經不規則；盆腔淤血可致經量增多；卵巢功能損害時可致月經失調。4)全身症狀：多不明顯，有時僅有低熱，易感疲倦。由於病程時間較長，部分患者可出現神經衰弱症狀，如精神不振、周身不適、失眠等。當患者抵抗力差時，易有急性或亞急性發作。體徵，若為子宮內膜炎，子宮增大、壓痛；若為輸卵管炎，則在子宮一側或兩側觸到呈索條狀的增粗輸卵管，並有輕度壓痛。若為輸卵管積水或輸卵管卵巢囊腫，則在盆腔一側或兩側觸及囊性腫物，活動多受限。若為盆腔結締組織炎時，子宮常呈後傾後屈，活動受限或粘連固定，子宮一側或兩側有片狀增厚、壓痛，宮骶韌帶常增粗、變硬，有觸痛。盆腔炎的檢查主要分為以下三步：第一步檢查臨床症狀。第二步白帶常規檢查,這項檢查主要是檢查陰道清潔度、細菌性陰道病包括黴菌、滴蟲等。第三步B超檢查,利用B超檢查可以識別來自輸卵管、卵巢及腸管粘連一起形成的包塊或膿腫有85％的準確性。但輕度或中等度的盆腔炎很難在B型超聲影象中顯示出特徵。如果進行以上三項檢查之後，並未發現明顯的盆腔炎特徵，還可以做相關的輔助檢查以確診是否患有盆腔炎。臨床上，主要有以下三項輔助檢查：第一項放射性同位素掃描近年來有人採用67鎵或111銦標記的白細胞作掃描以診斷腹腔膿腫，取得較高的準確率，應用111銦作掃描，準確率可高達85～100％。但目前臨床上尚少應用，第二項超聲檢查如果條件允許，還應給患者作超聲檢查以了解盆腔內有無包塊。如有包塊，看是否為膿腫。此法為非損傷性檢查，簡便易行，可靠性可高達90％以上。第三項計算機斷層掃描(CT)。但是以上檢測，檢測比較耗時，初篩複雜，效率低下，因此具有很大的改進空間。在現有技術中，已知的宮頸分泌物中，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量對慢性盆腔炎的診斷價值。通過抽取宮頸管內粘液作SIgA定量測定，盆腔炎病人的SIgA平均含量可以達到166.8mg/L，而正常婦女的結果為約9.8mg/L，二者差異顯著，因此，通過定量分析宮頸分泌物中SIgA的含量可以初步用來判斷時候患有慢性盆腔炎。雖然可以採用抗體通過酶聯免疫反應來定量分析宮頸分泌物中SIgA的含量，但是該方法對抗體的要求比較高，並且檢測成本也比較高，因此，對於貧窮落後地區，並不適宜大面積推廣。SELEX技術是20世紀90年代初發展起來的一種新的組合化學技術。利用該技術可以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合，形成靶物質-核酸複合物，洗脫未結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，並以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪的篩選。通過重複的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的核酸分子被洗去，而與革G物質有強親和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，最後佔據庫的大多數(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體後，經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研宄手段和工具。因此，採用selex技術，篩選特定的結合SIgA的適配體，進而將適配體製備成為特異性檢測SIgA含量的試劑盒具有較為重要的意義。技術實現要素：本發明的技術方案通過以下步驟實現：本發明的目的是提供一種SIgA的核酸適配體序列。本發明中，所述的SIgA的核酸適配體(序列1-15)能夠特異結合SIgA。本發明的進一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發明中根據對該序列應用，可進一步用於製備特異性結合SIgA的試劑盒。從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，(5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′)，其中N36為36個隨機寡核苷酸；從中篩選出與SIgA特異結合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物P1：TGACCTAACGGCATGACTTA；引物P2：GGTAACTGGTCCATGGTGCC，進行擴增並進行TA克隆入pMD19-T載體(購自上海博光生物公司)，轉化DH5a細菌(購自北京天根生物公司)；挑去白色菌落進行PCR確定陽性克隆後，抽提質粒並測序反應，上測序儀測序。本發明採用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術，以SIgA為正篩靶標，篩選與SIgA特異結合的核酸適配體，製得具有特異結合SIgA的序列，本發明中命名為適配體SIgAap-1～15。序列如下：SIgAap-1:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-2:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-3:UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-4:UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-5:UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-6:UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-7:UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-8:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-9:UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；SIgAap-10:TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-11:UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-12:UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-13:UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-14:UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-15:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；本發明的適配子可以用於構建試劑盒，該試劑盒可以用於特異性的分離和定量檢測SIgA，具有分離效果快，效率高，節省時間，節約成本的功效。具有很廣闊的應用前景。本發明的有益效果：獲得了一種能夠特異高效結合SIgA的適配子,通過將該適配子製備成為試劑盒即可定量的用於檢測SIgA的濃度，即可快速高效的用於慢性盆腔炎的快速篩查。具體實施方式實施例1:核酸適配體篩選從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′。所用引物:F：5，-TGACCTAACGGCATGACTTA-3R：5，-GGTAACTGGTCCATGGTGCC-3將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA,產物經2％瓊脂糖凝膠電泳並切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。80μgRNA文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然後與10ugSIgA蛋白37℃孵育40min，反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然後將濾膜剪碎，置於洗脫緩衝液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸銨，l.6mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉澱RNA，並重新溶解於20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉錄出RNA文庫用於下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行16輪。將最後一輪篩選得到的適配子上測序儀測序。測定得到序列如SEQIDNO：1-15所示。實施例2特異性高親和力的SIgA結合適配子的獲得將RNA適配子分別取1.5μg，用牛小腸鹼性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，純化回收去磷酸化的RNA；通過T4多核苷酸激酶標記[γ-32P]ATP於去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標記的RNA適配子分別與不同濃度(1-200nM)的SIgA蛋白37℃孵育30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，乾燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與SIgA蛋白的解離常數。結果如下：名稱解離常數Kd(nM)SIgAap-19.7SIgAap-28.5SIgAap-37.6SIgAap-48.8SIgAap-59.0SIgAap-610.2SIgAap-711.3SIgAap-89.7SIgAap-99.4SIgAap-108.6SIgAap-1111.3SIgAap-129.5SIgAap-138.8SIgAap-149.5SIgAap-1510.5PBS空白對照無結合能力實施例3所述適配子特異性分析以及穩定性分析從以上結果可以看出，本發明的15個適配子具有非常強的結合特性，現有技術中也沒有所述結合特性的適配子能夠結合SIgA蛋白。實施例4降解活性分析分別採用人血白蛋白，IgA，IgG，血紅蛋白與15條適配子進行特異性檢測，經過結合試驗發現，這些適配子都不與這些蛋白相結合，而只與SIgA蛋白結合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.5ug，分別置於常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過RT-PCR檢測，發現四周的放置其結構穩定，沒有被降解。實施例5臨床試驗分析將15個適配子分別用於檢測同樣的婦女陰道分泌物的臨床樣本，包括有慢性盆腔炎組和健康對照組，其中慢性盆腔炎組為60例，健康對照組為10例，以婦女的陰道分泌物作為待檢樣本。將70組婦女陰道分泌物加入到無菌離心管中，加入PBS溶液震蕩溶解。分別將偶聯有磁珠的15組適配子與70組的陰道分泌物溶液混合孵育20分鐘，而後磁分離，即可獲得相應的分離的SIgA蛋白，通過檢測發現，在60例慢性盆腔炎組中，15組適配子均檢測到高濃度的SIgA蛋白，平均檢測濃度為158.1mg/L，並且分布均勻，而在健康組中SIgA蛋白的濃度平均為10.2mg/L同樣分布均勻，由此可見，可以採用本發明的15種適配子可以快速的實現100％的初步篩選的檢測效果。具有極高的準確性。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。序列表〈110〉楊嶺燕〈120〉一種用於檢測婦科慢性盆腔炎的試劑盒及其檢測方法〈210〉1〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-1UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉2〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-2UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉3〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-3UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉4〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-4UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉5〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-5UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉6〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-6UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉7〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-7UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉8〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-8UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉9〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-9UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；〈210〉10〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-10TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉11〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-11UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉12〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-12UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉13〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-13UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉14〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-14UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉15〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-15UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp