一種蛭弧菌消毒劑及其製備方法和用途的製作方法

2023-09-11 17:09:20

專利名稱：一種蛭弧菌消毒劑及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物製劑，尤其還涉及其製備方法和用途，具體的是一種應用於養殖業消毒的噬菌蛭弧菌顆粒劑。
背景技術：
卩遼菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)(以下簡稱蛭弧菌)是一種專門以捕食細菌為生的寄生性細菌，研究指出，蛭弧菌在淨化養殖水體水質、控制或減少水生動物疾病的發生與流行上效果顯著。近年來，關於蛭弧菌應用在貝類、蝦類、蟹類、魚類等水產養殖中的研究也越來越多，這些研究都表明，在養殖過程中添加了蛭弧菌可以起到疾病防治、提高成活率、增長體重體長和淨化養殖生態環境的效果。陳麗芸等研究發現，添加蛭弧菌後可以使大菱鮃紅嘴病的發生率由10. 17%降到O. 93%，說明蛭弧菌能有效預防紅嘴病的發
生，另外，在治療紅嘴病方面，添加蛭弧菌後能100 %治癒紅嘴病。因此，應用蛭弧菌防治水產動物細菌性病害和消毒具有良好的發展前景，然而，目前我國商品化的蛭弧菌製劑主要是水劑，還有少量的凍乾粉劑，蛭弧菌水劑因保存時間短，質量不穩定以及運輸不便等因素而影響了其使用效果，凍乾粉劑也因生產成本高而在很大程度上限制了其應用，而微生物固定化法可將游離微生物定位於限定的空間區域，並保持活性，且能反覆利用，尤其是包埋固定化法，因操作簡單，在製備過程中對微生物活性影響小，製備的顆粒強度較高，更是深受微生態製劑研發人員的青睞。固定化微生物技術是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集並保持生物活性，在適宜條件下能夠快速、大量增殖的生物技術。在微生物的固定化方法中，以包埋法最為常用。它的原理是將生物體細胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網絡中，通過聚合作用或通過離子網絡形成，或通過沉澱作用，或通過改變溶劑、溫度、PH值使細胞截留。凝膠聚合物的網絡可以阻止細胞的洩露，同時能讓基質滲入和產物擴散出來。包埋材料可以分為兩大類(I)天然高分子多糖類，如海藻酸鹽、瓊脂、明膠等，其中以海藻酸鈉和卡拉膠應用最多，它們具有固化方便，對微生物毒性小及固定化密度高等優點，但是它們抗微生物分解性能較差，機械強度低，但是可使用交聯劑進行穩定化處理，但活力和傳質性能又會下降。(2)合成高分子化合物，如聚丙烯酞胺等。這類交聯劑的突出優點是抗微生物分解性能好，機械強度高，化學性能穩定。但是聚合物網絡的形成條件比較劇烈，對微生物細胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。張小能等在《噬菌蛭弧菌顆粒劑製備條件的優化》中用海藻酸鈉包埋法研究了噬菌蛭弧菌顆粒劑製備條件的優化，因為海藻酸鈉價格較高，製得的蛭弧菌顆粒劑成本較高，不適合大規模工業化生產。

發明內容
本發明的所要解決的技術問題是提供一種成本較低，活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑。
為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種蛭弧菌顆粒劑的製備方法，包括以下步驟(I)蛭弧菌菌液的製備將蛭弧菌菌種接種於IOOmL 1/10NB培養基中，同時加入100L的，於35°C _37°C溫度下100r/min-800r/min下搖床振蕩培養24h_48h,優化的,搖床振蕩為500r/min,使蛭弧菌菌液濃度為 I. OX 109CFU/mL-l. OX 1013CFU/mL ；(2)蛭弧菌包埋顆粒的製備取質量分數為1% -10%濃度的瓊脂膠體溶液和步驟(I)製得蛭弧菌菌液，體積比為20 100-50 100，放入攪拌器中，並加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的
體積比為I : 100-5 100 ；攪拌器在30°C恆溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質量分數為1% -10%的CaCl2溶液中固化12h-24h，然後收集蛭弧菌固定化顆粒於_20°C _30°C條件下冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。大腸桿菌菌懸液的的濃度為I. OX 106CFU/mL-l. OX 109CFU/mL。瓊脂膠體溶液也可以用明膠代替。蛭弧菌包埋顆粒的製備中還加入戊二醛交聯劑，體積分數為O. 1% _1%。蛭弧菌菌種為市場上銷售的蛭弧菌製劑,經增殖、純化,保存備用。大腸桿菌菌懸液為常規微生物實驗製得。本發明的有益效果是採用瓊脂膠體溶液、明膠溶液包埋法和戊二醛交聯法相結合的方式，製備一種活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑，經濟安全、保存時間長，可以用於水產養殖、畜禽養殖等多個行業。
具體實施例方式實施例I(I)蛭弧菌菌液的製備將蛭弧菌菌種接種於IOOmL 1/10NB培養基中，同時加入100L濃度為I. OX 106CFU/mL大腸桿菌菌懸液，於35°C溫度下100r/min下搖床振蕩培養48h，菌落總數檢測蛭弧菌菌液濃度為I. OX 109CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的製備取IOOg瓊脂粉，用滅菌蒸餾水製備質量分數為I %濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟
(I)製得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為20 100，放入攪拌器中，並加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為I : 100，加入戊二醛交聯劑，使溶液中戊二醛體積分數為O. 1%。攪拌器在30°C恆溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質量分數為1%的CaCl2溶液中固化12h，然後收集蛭弧菌固定化顆粒於-20°C條件下冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。實施例2(I)蛭弧菌菌液的製備將蛭弧菌菌種接種於IOOmL 1/10NB培養基中，同時加入IOOL濃度為I. OX 109CFU/mL大腸桿菌菌懸液，於35°C溫度下800r/min下搖床振蕩培養48h，菌落總數檢測蛭弧菌菌液濃度為I. OX 1013CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的製備取IOOOg瓊脂粉，用滅菌蒸餾水製備質量分數為10%濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟(I)製得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為50 100，放入攪拌器中，並加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為5 100，加入戊二醛交聯劑，使溶液中戊二醛體積分數為I%。攪拌器在30°C恆溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質量分數為10%的CaC12溶液中固化24h，然後收集蛭弧菌固定化顆粒於_30°C條件下冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。實施例3(I)蛭弧菌菌液的製備將蛭弧菌菌種接種於lOOmLl/lONB培養基中，同時加入100L濃度為I. OX IO9CFU/mL大腸桿菌菌懸液，於35°C溫度下500r/min下搖床振蕩培養48h，菌落總數檢測蛭弧菌菌液濃度為 I. OX 1013CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的製備取500g瓊脂粉，用滅菌蒸餾水製備質量分數為5%濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟
(I)製得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為30 100，放入攪拌器中，並加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為3 100，加入戊二醛交聯劑，使溶液中戊二醛體積分數為O. 5% O攪拌器在30°C恆溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質量分數為5%的CaCl2溶液中固化24h，然後收集蛭弧菌固定化顆粒於-30°C條件下冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。
權利要求
1.一種蛭弧菌消毒劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)蛭弧菌菌液的製備 將蛭弧菌菌種接種於lOOmLl/lONB培養基中，同時加入IOOL的大腸桿菌菌懸液，於35 0C _37°C溫度下100r/min-800r/min下搖床振蕩培養24h_48h，使蛭弧菌菌液濃度為I.OX 109CFU/mL-l. OX 1013CFU/mL ； (2)蛭弧菌包埋顆粒的製備 取質量分數為1% -10%濃度的瓊脂膠體溶液和步驟(I)製得蛭弧菌菌液，體積比為20 100-50 100，放入攪拌器中，並加入花生油和交聯劑，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為I : 100-5 100 ； 攪拌器在30°C恆溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質量分數為1% -10%的CaC12溶液中固化12h-24h，然後收集蛭弧菌固定化顆粒於_20°C _30°C條件下冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。
2.根據權利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的製備方法，其特徵在於所述交聯劑為戊二醛，戊二醛的體積分數為O. 1% -1%。
3.根據權利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的製備方法，其特徵在於所述蛭弧菌菌液的製備中以500r/min搖床振蕩培養。
4.根據權利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的製備方法，其特徵在於所述大腸桿菌菌懸液的的濃度為 I. OX 106CFU/mL-L OX 109CFU/mL。
5.一種按照權利要求I製備的蛭弧菌顆粒劑，為白色固體顆粒。
6.一種按照權利要求I製備的蛭弧菌顆粒劑的用途，可以用於水產養殖、畜禽養殖等環境的消毒。
全文摘要
本發明公開了一種蛭弧菌消毒劑及其製備方法和用途，具體的是一種噬菌蛭弧菌顆粒劑，屬於微生物固定化領域。包括以下步驟(1)蛭弧菌菌液的製備將蛭弧菌菌種接種於大腸桿菌菌懸液中增殖培養，使蛭弧菌菌液濃度為1.0×109CFU/mL-1.0×1013CFU/mL；(2)蛭弧菌包埋顆粒的製備將蛭弧菌菌液與瓊脂膠體溶液、戊二醛和花生油恆溫攪拌30min，滴入到CaCl2溶液中固化，冷凍乾燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。本發明採用包埋法和戊二醛交聯法相結合的方式，製備一種活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑，經濟、安全、保存時間長，可以用於水產養殖、畜禽養殖等多個行業。
文檔編號A01N25/12GK102870819SQ20121031339
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者邵緒霞 申請人:青島叄鼎衛生製品有限公司