一種二次諧波高解析度成像方法及系統與流程
2023-09-11 19:20:00 2
本發明屬於光學顯微成像領域，尤其涉及一種二次諧波高解析度成像方法及系統。
背景技術：
近年隨著雷射技術、檢測技術和計算機技術的快速發展，利用二次諧波(second harmonic generation,SHG)進行生物組織的三維成像成為生物醫學成像領域中的熱門課題，引起了廣泛關注。二次諧波成像是一種三維光學成像技術，具有非線性光學成像所特有的高空間解析度和高成像深度。
SHG的激發效率與激發光的平方成正比，因此僅在焦點附近才有足夠的光子能量來激發，非線性效應的強局域性減少了成像時非焦點處發光產生的背景幹擾，提高了信噪比和三維空間解析度。同時使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低，因此能長時間對樣品進行成像而不影響其活性。由於二次諧波顯微成像使用近紅外的激發光，組織吸收和散射效應較小，激發光能深入組織內部，相比傳統的顯微鏡，如雷射掃描共焦顯微鏡，可以做更深層的成像。此外，二次諧波成像技術的發射與激發波長相距較遠，因此信號易於有效分離。對活體生物樣品，SHG還具有一些獨特的優點。SHG一般為非共振過程，光子在生物樣品中只發生非線性散射，不被吸收，因此不產生伴隨的光化學過程，可減小對生物樣品的損傷。另外，在許多情況下，組織的病變過程中的線性光學特性變化很小，傳統的線性光學成像技術較難檢測。生物組織發生病變時一般都會伴隨著組織結構、細胞形態及分子結構的變化，SHG對組織微觀結構變化高度敏感，所以有望將該方法用於某些疾病(如糖尿病、動脈硬化和一些視網膜疾病等)的早期檢測和診斷。二次諧波顯微成像技術不需進行樣品染色，因此對某些不能進行螢光標記的非中心對稱樣品，採用二次諧波顯微成像技術檢測有效。
然而，目前二次諧波顯微成像的空間解析度還受到物鏡數值孔徑等條件的限制，無法滿足所需要的更高的空間解析度成像要求。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在於提供一種二次諧波高分辨成像方法及系統，旨在提高二次諧波顯微成像的空間解析度，擴大其應用範圍。
本發明提供了一種二次諧波高解析度成像方法，包括以下步驟：
產生激發光；
對所述激發光進行調製，形成條紋激發光斑；
移動所述條紋激發光斑，並且在每移動一次之後，將所述條紋激發光斑在樣品上進行時間空間聚焦，以在樣品上激發出二次諧波；
逐次探測激發出的所述二次諧波；
根據探測到的所有二次諧波進行頻譜分析，獲得圖像。
進一步地，所述對所述激發光進行調製，形成條紋激發光斑，包括：
先將所述激發光準直，再將準直後的激發光轉換為線偏振光，再利用空間光調製器對所述線偏振光進行相位調製，產生條紋激發光斑。
進一步地，所述將所述條紋激發光斑在樣品上進行時間空間聚焦，包括：
對所述條紋激發光斑進行時間聚焦，同時使時間焦點與所述樣品的物平面重合。
進一步地，所述逐次探測激發出的所述二次諧波，包括：
在每次探測時，利用前向和/或背向二次諧波效應對所述激發出的二次諧波進行探測。
本發明還提供了一種二次諧波高解析度成像系統，包括：
激發光源，用於產生激發光；
空間光調製器，用於調製激發光，以產生條紋雷射光斑；
移動控制單元，用於控制所述空間光調製器所產生的條紋雷射光斑進行移動；
光柵，用於使每次移動後的所述條紋雷射光斑在樣品上進行時間聚焦，且使時間焦點與所述樣品的物平面重合，以在樣品上激發出二次諧波；
物鏡，用於收集產生的二次諧波；
探測器，用於記錄二次諧波。
進一步地，所述激發光源與所述空間光調製器之間還設有：
擴束準直裝置，用於調整所述激發光的尺寸並進行準直；
半波片，用於將準直之後的激發光變成線偏振光。
進一步地，所述空間光調製器與所述光柵之間還設有：
4f系統，用於將所述激發光中的0級衍射光截止。
進一步地，所述4f系統包括第一透鏡、第二透鏡以及一個孔徑光闌，所述孔徑光闌置於第一透鏡的後焦面上，且第一透鏡的後焦面與第二透鏡的前焦面重合。
進一步地，所述物鏡與所述探測器之間還設有：
濾光片，用於篩選所需的二次諧波。
本發明與現有技術相比，有益效果在於：本發明提供的二次諧波高分辨成像方法，先對激發光進行調製，形成條紋激發光斑；然後通過移動所述條紋激發光斑，並且在每移動一次之後，將所述條紋激發光斑在樣品上進行時間空間聚焦，以在樣品上激發出二次諧波；最後逐次探測激發出的所述二次諧波，並根據探測到的所有二次諧波進行頻譜分析，獲得高空間解析度的圖像。
本發明提供的二次諧波高分辨成像系統，利用空間光調製器在顯微物鏡的物面形成條紋光斑對物體激發，並控制空間光調製器移動條紋，利用探測器記錄激發產生的二次諧波，記錄的二次諧波包含了超過衍射極限的高頻信息。由於激發光條紋與物體結構信息疊加，使得系統探測到更高頻率的物體信息，從而提高成像橫向解析度。同時利用光柵對雷射進行時間聚焦，只在時間焦點處才有二次諧波產生，從而又提高了成像的軸向解析度，並且可以進行層析成像。
本發明提供的二次諧波高分辨成像系統，結合所發明的成像方法對系統進行了設置，不僅結構簡單，而且成像效果顯著。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的二次諧波高分辨成像方法的實現流程示意圖；
圖2是本發明實施例提供的二次諧波高分辨成像系統。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
下面介紹一種二次諧波高分辨成像方法，請參閱圖1，本發明實施例提供的二次諧波高分辨成像方法，包括：
S101、產生激發光；
具體地，通過激發光源產生激發光，可以為雷射器。
S102、對激發光進行調製，形成條紋激發光斑；
具體地，先將雷射進行準直調整之後，變成線偏振光，然後通過空間光調製器和透鏡對激發光進行調整，形成條紋激發光斑。
S103、移動所述條紋激發光斑，並且在每移動一次之後，對將所述條紋激發光斑在樣品上進行時間空間聚焦，以在樣品上激發出二次諧波；
具體地，先利用光柵將條紋雷射光斑形成頻率連續分布的各組分光，然後與管鏡、物鏡等配合使用，將被光柵分開的連續頻率組分的光重新重疊，通過時間空間聚焦作用在樣品上激發出SHG(二次諧波)信號。
S104、逐次探測激發出的所述二次諧波；
具體地，探測二次諧波的光路為背向探測和/或前向探測，探測到的二次諧波會被相應連接的探測器接收。移動所述條紋光斑，使樣品上激發出新的二次諧波，探測新的二次諧波；
具體地，對於已形成的條紋激發光斑，讓條紋在某一個方向進行移動，每移動條紋一次，探測器對物成像一次。
S105、根據探測到的所有二次諧波進行頻譜分析，獲得圖像。
具體地，利用這些移動條紋對樣本所成的像進行頻譜分析，可以獲得系統截止頻率以外的高頻分量，即可提高該方向的解析度。轉動條紋，再重複上述過程，即移動條紋成像，就可提高該方向的解析度。依次類推，就可以提高該平面內各個方向的成像解析度。
本發明實施例還提供了一種二次諧波高解析度成像系統，包括：
激發光源，用於產生激發光；
空間光調製器，用於調製激發光，以產生條紋雷射光斑；
移動控制單元，用於控制所述空間光調製器所產生的條紋雷射光斑進行移動；
光柵，用於使每次移動後的所述條紋雷射光斑在樣品上進行時間聚焦，且使時間焦點與所述樣品的物平面重合，以在樣品上激發出二次諧波；
物鏡，用於收集產生的二次諧波；
探測器，用於記錄二次諧波。
如圖2所示，為本發明的二次諧波高分辨成像系統的一較佳實施例。其中所述系統包括激發光源1，空間光調製器5，光柵11，物鏡15以及探測器19和23。
具體地，激發光源1採用鈦寶石飛秒雷射器，產生的雷射為飛秒雷射，該雷射可實現物質的二次諧波激發。激發光源1和空間光調製器5之間設有第一擴束準直透鏡2和第二擴束準直透鏡3構成的擴束準直裝置、半波片4。激發光源1產生的雷射經由擴束準直透鏡2和擴束準直透鏡3構成的擴束準直裝置，變成所需尺寸的準直光，準直之後的雷射經半波片4變成線偏振光。
具體地，在本實例中，空間光調製器5採用的是全反射純相位型空間光調製器，利用SLM實現對入射光的相位調製，產生我們所需的激發條紋光斑。
具體地，空間光調製器5與光柵11之間設有4f系統，所述4f系統由一對透鏡——第一透鏡6和第二透鏡8，以及一個孔徑光闌7組成。孔徑光闌7擺在第一透鏡6的後焦面上，第一透鏡6的後焦面和第二透鏡8的前焦面重合。該4f系統將雷射中不需要的0級衍射光截止，即進行空間濾波。
具體地，光柵11與4f系統之間連接有半波片9和傅立葉透鏡10，其中光柵11為閃耀光柵。其中，半波片9的偏振方向和半波片4的偏振方向相同。閃耀光柵11面和傅立葉透鏡10的後焦面重合。經過半波片9後的雷射光斑經過傅立葉透鏡10後，在閃耀光柵11面即傅立葉透鏡10的後焦面上形成我們所需要條紋形狀的雷射光斑，然後以閃耀角入射閃耀光柵11。經過閃耀光柵11後，形成按照光譜頻率連續分布的各組分光。
具體地，光柵11與物鏡15之間設有管鏡12、激發濾光片13、雙色鏡14。在本實例中，物鏡15的焦平面和時間聚焦面重合。不同頻率連續分布的雷射經過管鏡12、激發濾光片13、雙色鏡14，並通過物鏡15的聚焦作用，在物鏡15的焦平面即時間聚焦面上被光柵分開的連續頻率組分的光將重新重疊。通過時間空間聚焦作用在物平面16上的激發出SHG信號。
以下對本實施例中的探測光路的結構進行詳細說明。
本發明實例探測光路分為兩部分——背向探測和前向探測。需要說明的是，兩部分可以分開使用也可以結合起來使用。
具體地，背向探測光路包括雙色鏡14，濾光片17，管鏡18以及被探測器19。在實施例中，背向探測光路中雙色鏡14對中心波長為810nm的脈衝雷射高透，對波長為405nm的SHG信號高反，雙色鏡14與入射光束之間的夾角為45°或135°。物平面16產生的背向SHG被足夠大數值孔徑的物鏡115接收，經雙色鏡114反射後，在傳導光路上依次經過接收濾光片17、管鏡18並被探測器19接收。
具體地，前向探測光路包括物鏡20，濾光片21，管鏡22以及探測器23。物平面16產生的前向SHG向前傳播，被數值孔徑足夠大的物鏡20收集之後經過接收濾光片21、管鏡22並被探測器23接收。
在本實例中，濾光片17、21採樣窄帶濾光片，僅讓SHG通過，並進入後續系統。管鏡18和22將信號收集在探測器上19、23上。探測器19和23採用面探測器，優選為CCD相機或CMOS相機。
本發明實施例實現二次諧波高解析度成像的理論公式包括：
激發二次諧波的激發條紋光為：
其中代表不同相位，m＝1,2,…,M。
經過光學系統之後探測器接收到的光強：
其中h2p(x)是有效雙光子點擴散函數，hem(x)該系統發射點擴散函數，s(x)是樣本函數。
傅立葉變換之後：
具體地：
可將各個頻率分量進行分離，復位並相加，並轉換到時域，即可得到該方向超分辨的圖像。
在本實例中，移動控制單元可使用計算機。空間光調製器5和探測器19、23與如計算機連接。通過計算機控制空間光調製器5可以形成條紋光斑，並可讓條紋在某一個方向進行移動，每移動條紋一次，探測器對物成像一次，並存儲在計算機中。利用這些移動條紋對樣本所成的像進行頻譜分析，可以獲得系統截止頻率以外的高頻分量，即可提高該方向的解析度。轉動條紋，再重複上述過程，即移動條紋成像，就可提高該方向的解析度。依次類推，就可以提高該平面內各個方向的成像解析度。
本實施例中通過時間空間聚焦作用，可以進行層析成像，提高軸向解析度。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。