Mmp表達抑制劑的製作方法
2023-09-11 14:47:30 1
專利名稱：Mmp表達抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物，其特徵在於，抑制癌細胞引起的細胞外基質分解酶(MMPmatrix metalloproteinase)的表達。
背景技術：
細胞外基質(也稱ECMextracellular matrix)是固定、粘附構成多細胞生物體的各細胞的不溶性成分的總稱。已知細胞外基質通過與細胞結合而影響細胞的增殖、分化，作為細胞外基質的主要物質，有膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等。已知細胞外基質可被稱為細胞外基質分解酶(MMPmatrix metalloproteinase，以下稱為「MMP」)的酶分解。MMP是受精卵在反覆進行細胞分裂、同時生成並分化組織時表達的酶，與癌的浸潤、轉移關係密切，對於癌的浸潤、轉移，癌細胞周圍和血管基底膜的細胞外基質的分解是必要的過程。
發明內容
所以，通過抑制MMP的表達能抑制癌的浸潤、轉移，但抑制MMP表達的高安全性藥物還沒有被開發出來，人們期待著這種藥物的出現。
本申請的發明人意外發現四烯甲萘醌(menatetrenone，維生素K-II)抑制MMP的表達。本發明的目的是提供具有抑制MMP表達、抑制癌細胞增殖效果的高安全性藥物。
本發明提供(1)一種MMP表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(2)如權利要求1所述的MMP表達抑制劑，其中所述MMP選自MMP-1、MMP-3、MMP-7或MMP-14；(3)一種uPA表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(4)一種癌的轉移、浸潤抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(5)如權利要求4所述的癌的轉移、浸潤抑制劑，其中所述癌是肝癌；(6)一種AP-1的活性抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(7)一種Ets-1表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(8)一種癌治療的預後改善劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分；(9)一種癌細胞轉移的抑制方法，該方法包括為抑制MMP的表達而給予有效量的四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物的步驟；(10)一種CDK抑制劑p16、p21或p27的表達促進劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
圖1(a)是表示四烯甲萘醌的添加量與各種肝癌細胞增殖的關係的曲線圖。
圖1(b)是表示利用RT-PCR法研究四烯甲萘醌的添加量與各種肝癌細胞中CDK抑制劑表達的關係的實驗結果圖。
圖1(c)是表示利用Western blot法研究四烯甲萘醌的添加量與各種肝癌細胞中CDK抑制劑表達的關係的實驗結果圖。
圖2是表示向各種肝癌細胞中添加四烯甲萘醌時的細胞周期圖。
圖3是表示向肝癌細胞中添加四烯甲萘醌時，對各種肝癌細胞浸潤的抑制結果圖。
圖4是表示利用RT-PCR法研究各種肝癌細胞中添加四烯甲萘醌時各種浸潤相關因子表達的實驗結果圖。
圖5是表示利用Western blot法研究各種肝癌細胞中添加四烯甲萘醌時各種浸潤相關因子表達的實驗結果圖。
圖6是表示利用凝膠移位試驗法研究添加四烯甲萘醌時轉錄因子活化的實驗結果圖。
圖7是表示利用RT-PCR法研究肝癌細胞中添加四烯甲萘醌時，對各種MMP啟動子活性的影響的實驗結果圖。
圖8是表示利用RT-PCR法研究四烯甲萘醌對TPA誘導的與癌的浸潤、轉移相關的基因表達的影響的實驗結果圖。
圖9是表示利用Western blot法研究四烯甲萘醌對TPA誘導的與癌的浸潤、轉移相關的蛋白質表達的影響的實驗結果圖。
具體實施例方式
下面對本發明的實施方式進行說明。以下的實施方式是為了說明本發明的示例，本發明並不只限定於該實施方式。只要不脫離本發明的宗旨，可以以各種方式實施。
四烯甲萘醌的化學名為2-甲基-3-四異戊烯基-1，4-萘醌(2-methyl-3-tetraprenyl-1，4-naphthoquinone)。結構式如下。
四烯甲萘醌是黃色結晶或油狀物質，無嗅無味，見光易分解。幾乎不溶於水。四烯甲萘醌也稱為維生素K-II，其藥理作用是在凝血因子(prothrombin、VII、IX、X)的蛋白質合成過程中，參與穀氨酸殘基轉變成具有生理活性的γ-羧基穀氨酸時的羧基化反應，促進肝中正常凝血酶原等的合成，激活生物體的止血機能，發揮生理上的止血作用。
在本發明中，作為「藥理學上允許的鹽」，例如，可以舉出與無機酸形成的鹽、與有機酸形成的鹽、與無機鹼形成的鹽、與有機鹼形成的鹽、與酸性或鹼性胺基酸形成的鹽等。相對1分子該化合物，酸、鹼以0.1～5分子的適宜比形成鹽。
作為與無機酸形成的鹽的優選例，例如，可以舉出與鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的鹽；作為與有機酸形成的鹽的優選例，例如，可以舉出與醋酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、硬脂酸、苯甲酸、甲磺酸、對甲苯磺酸等形成的鹽。
作為與無機鹼形成的鹽的優選例，例如，可以舉出鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、銨鹽等。另外，作為與有機鹼形成的鹽的優選例，例如，可以舉出與二乙胺、二乙醇胺、葡甲胺、N，N-二苄基乙二胺等形成的鹽。
作為與酸性胺基酸形成的鹽的優選例，例如，可以舉出與天冬氨酸、穀氨酸等形成的鹽；作為與鹼性胺基酸形成的鹽的優選例，例如，可以舉出與精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等形成的鹽。
作為本發明的藥物有效成分的四烯甲萘醌，可以是無水物，也可以形成水合物。另外，四烯甲萘醌不只限定以結晶多型存在，也可以是單一的結晶型，也可以是多種晶型的混合物。而且，本發明的四烯甲萘醌在生物體內分解產生的代謝物也包含在本發明的權利要求範圍內。
本發明中使用的四烯甲萘醌可以利用已經公知的方法製備，作為代表例，可以利用特開昭49-55650號公報中公開的方法容易地製備，除此以外，還可以從合成製造商處容易地購得。另外，四烯甲萘醌還可以作為膠囊劑、注射劑等製劑購入。本發明中的藥物可以直接使用四烯甲萘醌，或配合已經公知的藥學上允許的載體等(例如，賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯嗅劑、穩定劑、乳化劑、吸收促進劑、表面活性劑、pH調節劑、防腐劑、抗氧化劑等)、通常用作藥物製劑原料的成分，利用常規方法製成製劑。根據需要，還可以配合維生素類、胺基酸等成分。作為製劑的劑型，可以舉出片劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、敷劑等。
另外，在本發明中，對四烯甲萘醌的給藥形式沒有特別限定，優選經口給藥。四烯甲萘醌的膠囊劑可以以商品名Kaytwo膠囊劑(衛材株式會社制)、Glakay膠囊劑(衛材株式會社制)獲得，糖漿劑可以以商品名Kaytwo糖漿(衛材株式會社制)獲得，注射劑可以以商品名KaytwoN注射劑(衛材株式會社制)獲得。
四烯甲萘醌的優選給藥量為1～500mg/日，優選10～200mg/日，更優選30～135mg/日。
如上所述，MMP是指基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)，例如，已知有MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14等，在本說明書中，並不特別限定於此，其含義代表全部MMP。
另外，所謂uPA(尿激酶纖溶酶激活物，urokinase plasminogen activator)是纖溶酶激活物(PA)中的一種，是一種除了參與纖溶反應外、還參與癌的浸潤、轉移的酶。
實施例下面為表明本發明的有利效果，列舉了實施例、參考例，僅用作示例，本發明在任何情況下都不限定於下面的具體例。本領域普通技術人員可以適當變更以下實施例中記載的條件來實施本發明，所述變更包含在本申請權利要求的範圍內。
本發明人為研究四烯甲萘醌對癌細胞的(1)增殖和(2)浸潤、轉移產生怎樣的影響，進行了以下試驗。
(四烯甲萘醌對癌細胞增殖的抑制作用的研究)向肝癌細胞株HepG2、Huh7、Hep3B、HLE中添加四烯甲萘醌，使濃度分別為0M、10-6M、10-5M、10-4M，經48小時後，利用WST試驗進行細胞增殖的研究。結果如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，添加了四烯甲萘醌的任一個細胞與未添加四烯甲萘醌的對照肝癌細胞相比，其增殖被濃度依賴性地抑制。
(細胞周期調節基因表達的研究)為了研究細胞增殖抑制機理，著眼於參與細胞周期進行的基因的表達，利用RT-PCR法和Western blot法解析作為CDK抑制劑的p21、p27、p16的表達量因四烯甲萘醌的添加而發生怎樣的變化，上述CDK抑制劑具有阻礙使細胞周期進行的Cyclin dependent kinase(CDK)的作用。
(RT-PCR法)在本試驗中，向肝癌細胞株HepG2、Huh7、Hep3B、HLE中添加四烯甲萘醌，使濃度分別為0M、10-6M、10-5M、10-4M，經48小時後收集RNA，用1μg總RNA進行RT-PCR，研究p21、p27、p16的表達。進行以GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)為對照的RT-PCR。結果如圖1(b)所示。
(Western blot法)在本試驗中，向肝癌細胞株HepG2、Huh7、Hep3B、HLE中添加四烯甲萘醌，使濃度分別為0M、10-6M、10-5M、10-4M後，從以上細胞中分別提取蛋白質，利用SDS-PAGE電泳後，印跡(blot)在PVP膜上，與抗p21、p27抗體一同孵育，利用ECL法研究p21、p27的蛋白質表達。結果如圖1(c)所示。
由圖1(b)、圖1(c)可知，在HepG2細胞中，可以觀察到p27和p21的mRNA隨四烯甲萘醌的添加濃度依賴性地增加。在Hep3B細胞中，可見p21和p16的輕度增加，但未觀察到p27的變化。在Huh7細胞中，未觀察到上述蛋白的表達。
(細胞周期的研究)對於四烯甲萘醌對癌細胞的細胞周期的影響，利用流式細胞儀(FACS)解析添加了四烯甲萘醌的肝癌細胞的DNA量分布。在本試驗中，向肝癌細胞株HepG2、Huh7、Hep3B、HLE中添加四烯甲萘醌，使濃度分別為0M、10-6M、10-5M、10-4M，經48小時後，利用FACS觀察細胞周期的變化。結果如圖2所示。由圖2可知，由於四烯甲萘醌的添加，任一個細胞中均可觀察到G1期細胞的比率隨濃度依賴性地增加，G2期細胞減少。這暗示在肝癌細胞的細胞周期中，四烯甲萘醌抑制由G1期進入S期的過程，認為四烯甲萘醌通過誘導G1停滯，從而抑制肝癌細胞的增殖。
(對癌細胞的浸潤、轉移的研究)為了研究四烯甲萘醌具有的抑制癌細胞的浸潤、轉移的作用，向肝癌細胞(HepG2)中添加四烯甲萘醌，使濃度為0M、10-6M、10-5M、10-4M後，測定癌細胞進入基質凝膠(matrigel)內的浸潤能力。在本試驗中，在雙室的上室塗布基質凝膠，在其上使癌細胞擴散，並添加四烯甲萘醌。在下室擴散NIH3T3細胞作為飼養細胞(feeder)。24小時後在顯微鏡下觀察通過基質凝膠移動至上室下表面的細胞數。結果如圖3所示。由圖3可知，四烯甲萘醌的添加濃度越大，移動至上室下表面的細胞數越少。根據該結果可知四烯甲萘醌濃度依賴性地抑制癌細胞進入基質凝膠內的浸潤能力。
利用下述試驗研究四烯甲萘醌對MMP表達的影響，所述試驗為(1)RT-PCR試驗，(2)Western blot試驗，(3)凝膠移位試驗，(4)MMP基因啟動子活性試驗，以及(5)TPA誘導時的基因表達試驗。
(RT-PCR法)為研究MMP的表達，利用RT-PCR法進行試驗。在本試驗中，研究向各種肝癌細胞(HepG2、Hep3B、Huh7)中添加四烯甲萘醌的情況下各種MMP(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-14(MT1-MMP))、影響MMP表達的轉錄因子Ets-1以及作為細胞外基質受體的β1整聯蛋白的表達。結果如圖4所示。由圖4可知，由肝癌細胞表達的MMP種類部分不同，但由於添加四烯甲萘醌，使得MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-14的mRNA表達被濃度依賴性地抑制。而且，轉錄因子Ets-1的表達也被濃度依賴性地抑制，β1整聯蛋白和GAPDH的mRNA的表達未見變化。
(Western blot法)為研究MMP的表達，利用Western blot法進行試驗。在本試驗中，研究向各種肝癌細胞(HepG2、Hep3B、Huh7)中添加四烯甲萘醌的情況下MMP-1和MMP-3的蛋白表達。結果如圖5所示。由圖5可知，由於添加四烯甲萘醌，使得MMP-1和MMP-3的蛋白表達被抑制。
(凝膠移位試驗)已知MMP與其啟動子區域同樣地具有與轉錄因子AP-1、Ets-1、Tcf/Lef等的結合位點，對MMP的表達進行調節。利用凝膠移位試驗，研究調節MMP表達的轉錄因子AP-1、Tcf/Lef的結合活性是否因添加四烯甲萘醌而發生變化。在本試驗中，向肝癌細胞HepG2中添加四烯甲萘醌，24小時後提取核蛋白，使其與用32P標記的具有AP-1、Tcf/Lef的結合位點的雙鏈DNA反應，然後進行凝膠移位試驗。結果如圖6所示。由圖6可知，四烯甲萘醌並未改變Tcf/Lef的結合活性，但濃度依賴性地抑制了AP-1的結合活性。與未標記的過量AP-1探針結合時，帶(band)隨濃度依賴性地減弱(圖中「10X」、「100X」)，與變異AP-1探針結合時，帶未發生變化(圖中「M」)。另外，利用抗c-fos抗體能觀察到帶的減弱、轉移(圖中「S」)。根據以上的結果可知四烯甲萘醌特異性抑制AP-1的結合。
(MMP基因啟動子活性試驗)下面，向肝癌細胞Huh7中導入MMP-1、MMP-3、MMP-7的啟動子報導基因(promoter reporter gene)，研究四烯甲萘醌對這些MMP啟動子活性的影響。MMP-1、MMP-3、MMP-7的啟動子-螢光素酶報導質粒(promoter-luciferase reporter plasmids)可以使用通過取代Ozaki I，Mizuta T，Zhao G，Zhang H，Yoshimura T，Kawazoe S，EguchiY，Yasutake T，Hisatomi A，Sakai T，Yamamoto K.Induction of multiple matrix metalloproteinase genes in human hepatocellular carcinoma by hepatocyte growth factor via a transcription factor Ets-1.Hepatol Res 2003；27288-300中報告的MMP啟動子-CAT報導質粒的報導基因部分而製備的物質。使用脂質轉染胺試劑(lipofectamine)向肝癌細胞Huh7中導入各種MMP-螢光素酶質粒，然後以各種濃度添加四烯甲萘醌，48小時後收集細胞，測定螢光素酶活性，研究四烯甲萘醌對MMP-1、MMP-3、MMP-7基因的啟動子活性的影響。
結果如圖7所示。由圖7可知，由於四烯甲萘醌的添加，使得Huh7細胞中的MMP-1、MMP-3、MMP-7的啟動子活性被濃度依賴性地抑制。特別是MMP-1和MMP-7，活性降低接近50％。由此表明四烯甲萘醌對MMP的表達抑制是通過抑制這些基因啟動子活性而實現的。
(TPA誘導時基因的表達試驗)已知表達被四烯甲萘醌抑制的MMP和Ets-1與uPA(尿激酶纖溶酶激活物，urokinase plasminogen activator)同樣都是由12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)誘導的基因。為研究四烯甲萘醌是否抑制被TPA活化的基因的表達，向培養的肝癌細胞HepG2中添加TPA，使濃度為20nM，再向其中添加四烯甲萘醌，利用RT-PCR法和Western blot法研究由TPA誘導的上述基因的表達是否受到影響。結果如圖8和圖9所示。由圖8可知，如果在肝癌細胞HepG2中添加20nM的TPA，則MMP-1、MMP-3、MMP-7和Ets-1、以及uPA的mRNA的表達增加。另一方面，作為uPA受體的uPAR和作為uPA抑制劑的PAI不受影響。如果向其中添加四烯甲萘醌，則由TPA誘導的MMP-1、MMP-3、MMP-7、Ets-1以及uPA的mRNA的表達被濃度依賴性地抑制。而且，由圖9可知，四烯甲萘醌也能夠濃度依賴性地抑制MMP-1和MMP-3的蛋白質水平的表達。該結果表明，在肝癌細胞中，四烯甲萘醌抑制由TPA誘導的MMP、Ets-1以及uPA等參與浸潤、轉移的基因的表達。
產業上的可利用性根據本發明，四烯甲萘醌能夠抑制轉錄因子Ets-1的表達和AP-1的結合活性，抑制並防止作為分解細胞外基質的酶的MMP以及作為與MMP一同參與癌的浸潤、轉移的酶的uPA的表達，從而能抑制癌細胞的浸潤、轉移。
權利要求
1.一種MMP表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
2.如權利要求1所述的MMP表達抑制劑，其中所述MMP選自MMP-1、MMP-3、MMP-7或MMP-14。
3.一種uPA表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
4.一種癌的轉移、浸潤抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
5.如權利要求4所述的癌的轉移、浸潤抑制劑，其中所述癌是肝癌。
6.一種AP-1活性抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
7.一種Ets-1表達抑制劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
8.一種癌治療的預後改善劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
9.一種癌細胞轉移抑制方法，該方法包括為抑制MMP的表達而給予有效量的四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物的步驟。
10.一種CDK抑制劑p16、p21或p27的表達促進劑，其含有四烯甲萘醌或其藥理學上允許的鹽或這些化合物的水合物作為有效成分。
全文摘要
細胞外基質分解酶(MMP)是受精卵在反覆進行細胞分裂、同時生成並分化組織時表達的酶，與癌的浸潤、轉移關係密切，對於癌的浸潤、轉移，癌細胞周圍和血管基底膜的細胞外基質的分解是必要的過程。通過抑制MMP的表達能抑制癌的浸潤、轉移，但抑制MMP表達的高安全性藥物還沒有被開發。本發明提供抑制癌細胞引起的MMP表達的製劑。
文檔編號A61P35/00GK1777413SQ200480010509
公開日2006年5月24日 申請日期2004年4月23日 優先權日2003年4月23日
發明者尾崎巖太, 張 浩, 水田敏彥, 山本匡介 申請人:衛材株式會社