與豇豆豆莢顏色相關的基因、KASP標記及其應用

2023-08-13 23:03:28 1

與豇豆豆莢顏色相關的基因、kasp標記及其應用
技術領域
1.本發明屬於植物分子標記輔助育種技術領域，具體涉及與豇豆豆莢顏色相關的基因、kasp標記及其應用。


背景技術：

2.豇豆豆莢富含蛋白質、磷脂、膳食纖維等有益成份，是保健療疾的佳蔬，被列為亞洲十大栽培蔬菜之一，在農業生產中佔有重要地位。豇豆嫩莢顏色是豇豆重要的品質特徵，在不同品種間呈白色、綠色、紫色和斑紋等多種顏色。不同程度的紫色與花青素積累的程度有關。富含花青素不僅賦予植物斑斕的色彩，還能在預防與年齡相關的退行性疾病方面發揮重要作用，深受消費者的青睞。目前，現有的豇豆品種生產上仍以高產綠莢為主。因此，選育富含花青素的豇豆新品種，改善其內在營養和外觀品質，是豇豆育種的主要目標之一，對豇豆產業發展具有重要意義。之前有研究通過整合代謝組學和轉錄組學分析研究了紫色莢果顏色的可能機制，發現一些轉錄因子(tf)可能參與了紫色莢果中花青素積累的調節。然而，控制紫莢的關鍵候選基因仍然未知。現有與豇豆莢色基因緊密連鎖的分子標記為dcaps標記，該標記需要先進行pcr擴增，然後再進行酶切處理，最後再進行電泳檢測，步驟較多，程序繁瑣，且所需內切酶成本較高，同時還可能會產生氣溶膠汙染環境，也不適用於高通量的分子檢測平臺。因此，挖掘控制長豇豆莢色的關鍵基因，並開發操作便捷、周期短、通量高的功能分子標記，對於提高豇豆育種效率、縮短育種年限至關重要。
3.競爭性等位基因特異性pcr(kompetitive allele-specific pcr，kasp)技術是近些年來發展起來的一種主要基於snp的高通量基因分型技術。相較於傳統的分子標記(rflp，sts、ssr等)有其獨特的優勢，kasp不依賴於凝膠電泳，不需要酶切及專門的設備，可以使用常規的qpcr儀器進行snp基因分型，因具有成本低，靈活性高，兼容性好，準確性高，周期短、可操作性強等優點而在農作物性狀改良等領域具有巨大的應用潛力。因此，開發適合於高通量分子檢測平臺的豇豆莢色kasp分子標記對於推廣普及分子標記技術的應用，提高豇豆莢色育種效率和育種水平具有重要意義。


技術實現要素：

4.為了克服上述現有技術的不足，本發明挖掘了與豇豆豆莢顏色相關的關鍵基因vu05g004180，在該基因上的第1393:1394核苷酸位點間存在ct雙鹼基插入/缺失多態性，同時基於該snp位點開發了於豇豆豆莢顏色相關的kasp標記，為豇豆豆莢顏色的鑑定以及豇豆豆莢顏色的選育提供了新的途徑。
5.為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案是：
6.本發明第一方面提供了基因vu05g004180在豇豆豆莢顏色選育中的應用，基因vu05g004180具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
7.本發明第二方面提供了與豇豆豆莢顏色相關的kasp標記vumyb-kasp1在豇豆豆莢顏色選育中的應用，所述kasp標記vumyb-kasp1為第一方面所述的vu05g004180基因上的第
1393:1394核苷酸位點間ct鹼基的插入/缺失。
8.本發明第三方面提供了用於擴增kasp標記vumyb-kasp1的引物在豇豆豆莢顏色選育中的應用。
9.本發明公開了與豇豆豆莢顏色相關的關鍵基因vu05g004180，其核苷酸序列如seq idno.1所示，在該基因上的第1393:1394核苷酸位點間存在ct鹼基的插入/缺失多態性，基於該snp位點，本發明開發了於豇豆豆莢顏色相關的kasp標記，利用該標記只需要對待測植株dna進行一次pcr擴增即可得到鑑定結果，操作簡單，無需進行caps標記的酶切反應和indel標記複雜耗時的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，而是在螢光定量pcr儀中通過螢光檢測到的基因分型值和分布圖就可以簡便、準確地鑑選出具有目的基因的植株，實現了有利基因的轉移和基因聚合，實現了由「經驗育種」到定向「精確育種」的轉變。
10.優選地，vumyb-kasp1的引物包括如seq id no.3所示的vumyb-kasp1-f1、如seq id no.4所示的vumyb-kasp1-f2和如seq id no.5所示的vumyb-kasp1-r。
11.優選地，所述豆莢顏色包括綠色和紫色。
12.本發明第四方面提供了一種豇豆豆莢顏色的選育方法，該方法包括以下步驟：
13.s1、提取待測豇豆的基因組dna；
14.s2、以待測豇豆提取的dna為模板，利用vumyb-kasp1標記引物進行pcr擴增與螢光檢測，所述vumyb-kasp1標記引物包括兩條正向引物和一條反向引物，且在兩條正向引物的5』端添加螢光報告基團hex和fam；
15.s3、反應結束後統計檢測到的鹼基類型，其中-/-為純合紫色基因型，ct/ct為純合綠莢基因型，ct/-為雜合紫莢基因型。
16.優選地，所述vumyb-kasp1標記引物為第三方面所述的引物。
17.更優選地，所述vumyb-kasp1標記引物包括如seq id no.3所示的vumyb-kasp1-f1、如seq id no.4所示的vumyb-kasp1-f2和如seq id no.5所示的vumyb-kasp1-r。
18.優選地，pcr擴增的體系為10μl，包括1.0μl 10ng
·
μl-1
的dna檢測模板，10μm的vumyb-kasp1標記的兩條正向引物及一條反向引物各0.1、0.1、0.3μl，5μl的flu-arms 2
×
pcr mix,3.5μl無菌水。
19.優選地，pcr擴增的反應程序為：95℃變性10min；95℃變性15s，61℃
→
55℃，每個循環下降0.6℃，退火60s，10個循環；95℃變性15s，55℃退火60s，28個循環；30℃讀數30s。
20.優選地，螢光檢測的參數設置為：將allele 1鹼基設定為ct鹼基缺失，記為-/-，螢光reporter設定為hex；allele 2鹼基設定為ct/ct，螢光reporter設定為fam。
21.與現有技術相比，本發明的有益效果是：
22.本發明發掘了控制豇豆豆莢顏色的關鍵基因vu05g004180及不同基因型之間的snp(vu05g004180第1393:1394位點間存在的ct鹼基插入/缺失)，同時開發出一個可用於豇豆豆莢顏色鑑定的kasp分子標記vumyb-kasp1。vumyb-kasp1包含2條分別長49bp的正向引物vumyb-kasp1-f1和vumyb-kasp1-f2、以及一條長21bp的反向引物vumyb-kasp1-r。利用vumyb-kasp1鑑定豇豆豆莢顏色，只需要對待測植株dna只進行一次pcr擴增即可得到鑑定結果，操作簡單，無需進行caps標記的酶切反應和indel標記複雜耗時的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，而是在螢光定量pcr儀中通過螢光檢測到的基因分型值和分布圖直接鑑定得到豇豆純合紫莢基因型(雙鹼基缺失，-/-)或雜合紫莢基因型(ct/-)及綠莢基因型ct/ct，檢測
效率可高達99％。
附圖說明
23.圖1為豇豆wss1和prs商品期豆莢顏色的對比；
24.圖2為在vu05染色體上檢測到與紫色莢果相關的位點；
25.圖3為bsa測序親本綠色和紫色莢豇豆材料vu05g004180基因編碼區雙鹼基變異的sanger測序局部圖(互補鏈)；
26.圖4為vumyb-kasp1在淡綠莢親本wss1和紫莢親本prs中的螢光檢測結果示意圖；
27.圖5為vumyb-kasp1在豇豆綠莢品系wss1和紫莢品系以及其雜交種、f2群體中的螢光檢測結果示意圖；
28.圖3-5中，樣本根據其基因型分為i類、ii類和iii類。i類的各樣本分布靠近x軸，表示該snp為純合紫莢基因型-/-；ii類的各樣本分布靠近y軸，表示該snp為純合綠莢基因型ct/ct；iii類的各樣本大致分布於x軸和y軸的對稱軸位置，表示該snp為雜合紫莢基因型ct/-；
×
表示未檢測到相應snp。
29.圖6為vumyb-kasp1在96份豇豆材料上進行豆莢顏色鑑定的螢光檢測結果圖。
具體實施方式
30.下面對本發明的具體實施方式作進一步說明。在此需要說明的是，對於這些實施方式的說明用於幫助理解本發明，但並不構成對本發明的限定。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及的技術特徵只要彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
31.下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為可通過常規的商業途徑購買得到。
32.實施例1豇豆豆莢顏色kasp標記的獲取
33.(1)對廣東省農業科學院蔬菜研究所葉菜豆類研究室種質資源庫中的紫色莢果品系prs和淺綠色莢果品系wss1進行雜交(圖1)，得到304個f2個體，其中紫色莢果220個，白色莢果84個。根據f1的表型(紫色莢果)和f2個體間的分離比為3:1(χ2＝1.12,p》0.05)，確定莢果紫色是由一個基因控制，紫色是顯性性狀。為進一步探索該基因的位置，利用混合集團分離分析(bsa)和高通量測序技術對兩個親本和兩個包含30個f2極端表現型個體的擴增池進行測序分析(由百邁克生物科技有限公司完成)。在質量控制之後，對兩個父節點和兩個bulk執行小變量(snp和indels)調用，然後計算兩個池之間的δ(snp-index)值。在vu05染色體上確定了一個位點與紫色莢果相關(圖2)，這與表型分離的遺傳分析一致。為了進一步縮小候選區域，在250kb步長的50kb窗口中研究了δ(snp-index)》0.9的變體數。最後，鑑定出一個0.55mb的基因組區域(3.10-3.65mb)，由54個基因組成。為了進一步探索與紫色莢果相關的候選基因，對prs和wss1莢果的轉錄組進行了研究，共檢測到981個差異表達基因(degs)，其中兩個差異基因vu05g004180和vu05g004220位於bsa揭示的候選區域。在擬南芥中，vu05g004220與at5g15310(atmyb16)同源，編碼一個mixta-like轉錄因子，控制毛狀體成熟和角質層形成(camoirano,a.,arce,a.l.,ariel,f.d.,et al..(2020).class i tcp transcription factors regulate trichome vuanching and cuticle development in arabidopsis.jexp bot 71,5438-5453.)。同時，基於全基因組的ont和illumina數據，沒有
在prs中檢測到覆蓋vu05g004220的變異。vu05g004180與擬南芥中的at1g66380(atmyb114)同源，後者編碼轉錄因子myb家族的一個成員(r2r3-myb)，並參與花青素生物合成的調控(heppel,s.c.,jaffe,f.w.,takos,a.m.,et al..(2013).identification of key amino acids for the evolution of promoter target specificity of anthocyanin and proanthocyanidin regulating myb factors.plant mol biol 82，457-471.yan，h.，pei，x.，zhang，h.，et al..(2021).myb-mediated regulation of anthocyanin biosynthesis.int j mol sci 22.)。與紫色莢果品系(prs)相比，淺綠色莢果品系(wss1)的vu05g004180外顯子中檢測到雙鹼基插入(ct)，該雙鹼基插入紫莢材料vu05g004180基因上1393和1394鹼基之間，於該基因654bp的編碼序列末端密碼子區域內部(seq id no.2所示序列的第652和653鹼基之間)，sanger測序進一步驗證了該結果(圖3)。推測該雙鹼基可能參與調控其自身的轉錄。因此，初步認定vu05g004180(vumyb114)可能是控制豇豆紫莢的候選基因。
34.vu05g004180(vumyb114)的核苷酸序列(seq id no.1)：
35.aagttttacgactattgatataatctcaaataatcaacaaatacataaaaaagaaaaatcccaaacaagataatatcttatttgtatataagtttacaaaactgatcttctgcaaccaagatttcgaaggccataaaaaaattcttgtataagagttatatatgttacctagtataaaactcttaacagtgacttaagttcttaagcatgcattatattcactacatccaatagtccatgaaaacttattcgaaatttttgaagattggtccattggcatcaaaatgatcattcctaaaggacactgctcaattccatgtgtatatattttacagggttatgcattctgagcataactttatctttttaagacacatatattatatatagtttgagaaaaacgttttctctccaagtatatcaccttaggtatcaccattgtgcaagcagcttgtgtgattatggaaggaagattatcaggtgtgaggaaaggagcatggagtcaaactgaagatgaacttctcagagaatgcgtgcaactctatggggaaggaaaatggcaccttgttcctcaaagagcaggtttctttcatctctttctttatgttatcattttcctcttcttcatttcttttacacaacattctcataaacatttttatgagtcatatgatgttatgttttgtacacgtagggttgaacagatgcaggaagagttgtaggctgagatggttgaactatttgaaaccaaatatcaagcgaggtgattttagtgaagatgaggtcgatttgatcatcagattgcataagcttctggggaacaggtttctatatatttgctgtataagatttattcaaagacataaaacaaacgaatacttttatattatgagtattatttatagaatatgtttaatttttgtacacatattcgacattatacaaaggtcaacagaatagcaatcatgaaacgacaactttgttggatgcaggtggtctctgatcgcaggaagacttccgggaagaacttcgaacgatgtgaagaattactggaacacgaacatgcgccgcaaagtacaatctcacagcaaagatgaggagaacaacaacaagaacaacgtgaaagaatccgaaagaagttggaaaccccaccaccaagtgataaagcctgtgcctcgagctttgccaaaagcatcacccttggtgcaaagccaattcatgagttgttcgaaagttggagttagtgaagctgtttcagcagcctctgagaattggtgggaaactctgttagatgagaaggaagataacattgcagttaacgacagcacgtgcttcccacgtgcaaaagatggatcctttgaactttggaatgaagaacttggttccattgcttgagtttcttgaagaaggtgaaacatggatcgattttcttcttaattaacctaccacattcgccatctctctcatgcctttatttccataagaaggcacttcaattagttcaaacttaggtttcatttactttagaaaataagttcttgctagaggcactggttaagaaacaaaaaacaagaaataatttattggaaagtatgtaggaatgatacttaatgttgtgtttgaatgaaacaaatttaaaagagttcattgatttaaacaattttattttagtttactca(下劃線加粗字體為ct鹼基插入/缺失突變位點)。
36.vu05g004180(vumyb114)的編碼序列(seq id no.2)：
37.atggaaggaagattatcaggtgtgaggaaaggagcatggagtcaaactgaagatgaacttctcagagaatgcgtgcaactctatggggaaggaaaatggcaccttgttcctcaaagagcagggttgaacagatgcaggaagagt
tgtaggctgagatggttgaactatttgaaaccaaatatcaagcgaggtgattttagtgaagatgaggtcgatttgatcatcagattgcataagcttctggggaacaggtggtctctgatcgcaggaagacttccgggaagaacttcgaacgatgtgaagaattactggaacacgaacatgcgccgcaaagtacaatctcacagcaaagatgaggagaacaacaacaagaacaacgtgaaagaatccgaaagaagttggaaaccccaccaccaagtgataaagcctgtgcctcgagctttgccaaaagcatcacccttggtgcaaagccaattcatgagttgttcgaaagttggagttagtgaagctgtttcagcagcctctgagaattggtgggaaactctgttagatgagaaggaagataacattgcagttaacgacagcacgtgcttcccacgtgcaaaagatggatcctttgaactttggaatgaagaacttggttccattgctt(ct鹼基插入位點)ga。
38.(2)根據vu05g004180(vumyb114)的雙鹼基缺失位點(ct)設計5對kasp標記。利用5對kasp標記設計引物在親本間進行擴增檢測，共檢測到2對引物在親本間存在差異snp。以kasp標記vumyb-kasp1(其引物如seq id no.3、4、5所示)在親本間的擴增為例，如圖4所示，淡綠莢親本wss1的四次重複檢測結果靠近y軸，並聚集為i類，基因型為ct；紫莢親本prs的四次重複檢測結果靠近x軸，並聚集為ii類，基因型為-/-(雙鹼基缺失)。
39.(3)利用在親本間有多態性的2對kasp標記在f2群體中進行多態性驗證，發現vumyb-kasp1能將f2群體各單株聚為三類，如圖5所示，靠近y軸的樣本聚集為i類，為純合綠莢基因型ct；靠近x軸的樣本聚集為ii類，為純合紫莢基因型-/-(雙鹼基缺失)；靠近x、y對稱軸位置的樣本聚集為iii類，為雜合紫莢基因型ct/-。而且vumyb-kasp1在f2群體中的基因型檢測結果與莢色表型鑑定結果一致性較高，達100％。因此，kasp標記vumyb-kasp1可作為鑑定豇豆莢色的候選分子標記。
40.豇豆豆莢顏色kasp標記引物vumyb-kasp1-f1，包括兩條長46bp的正向引物vumyb-kasp1-f1和vumyb-kasp1-f2，以及一條長29bp的反向引物vumyb-kasp1-r(在兩條正向引物的5』端分別添加有螢光報告基團hex和fam)，具體如下：
41.vumyb-kasp1-f1(seq id no.3)：
42.gaaggtgaccaagttcatgcttgaagaacttggttccattgctac；
43.vumyb-kasp1-f2(seq id no.4)：
44.gaaggtgaccaagttcatgcttgaagaacttggttccattgcttg；
45.vumyb-kasp1-r(seq id no.5)：
46.aagaaaatcgatccatgtttcaccttctt。
47.實施例2豇豆莢色kasp標記的應用
48.(1)選取96個本研究室收集的農藝性狀優良的豇豆種質資源(自2018年-2022年間在廣東省內收集的地方種、農家種及市面上購買的商品種)，在苗期取葉片，利用基因組dna提取試劑盒或ctab法提取每個單株的基因組dna備用。
49.(2)利用vumyb-kasp1標記引物(seq id no.3、4、5)對步驟(1)中提取的96份dna樣品進行擴增與螢光檢測。pcr擴增的體系為10μl，包括10ng
·
μl-1
的dna模板1.0μl，10μm的vumyb-kasp1標記f1、f2及下遊通用引物r各0.1、0.1、0.3μl，flu-arms 2
×
pcr mix 5μl，無菌水3.5μl。pcr反應程序為：95℃變性10min；95℃變性15s，61℃
→
55℃(每個循環下降0.6℃)退火60s，10個循環；95℃變性15s，55℃退火60s，28個循環；30℃讀數30s。
50.(3)螢光參數設置時(bio-rad，cfx96 touch)：將allele 1鹼基設定為-/-(ct鹼基缺失)，螢光reporter設定為hex；allele 2鹼基設定為ct/ct，螢光reporter設定為fam。
51.(4)運行程序，反應結束後統計每個單株檢測到的鹼基類型(ct/ct或-/-或
ct/-)，-/-為純合紫色型，ct/ct為純合綠莢型，ct/-為雜合紫莢型。
52.(5)種植步驟(1)中的豇豆材料，結莢期調查並統計每個種的莢色情況，綠色或紫色。
53.(6)對步驟(4)中統計到的基因型(圖6)與步驟(5)中統計的表型做比較分析，得出一致性高達99％，達到了分子標記篩選的目的。
54.以上對本發明的實施方式作了詳細說明，但本發明不限於所描述的實施方式。對於本領域的技術人員而言，在不脫離本發明原理和精神的情況下，對這些實施方式進行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發明的保護範圍內。