一種複合結構人造血管的靜態製備方法

2023-08-13 12:56:56

專利名稱：一種複合結構人造血管的靜態製備方法
技術領域：
本發明屬於人造血管的製備領域，特別涉及ー種複合結構人造血管的靜態製備方法。
背景技術：
目前大口徑血管移植物在臨床應用中已經取得了較好的效果，但普通小口徑人造血管幾乎沒有抗血栓性。我國智慧財產權系統顯示，目前已有智慧財產權項目通過對血管內壁進行表面修飾的方法減少血栓的形成，如專利申請號為200610166568. 6的《一種織物增強的複合人造血管》中提出由抗凝血層、織物增強層和弾性粘結層組成的複合人造血管，在一定程度上提高了人造血管通暢率；但織物增強層與抗凝血層之間需要弾性粘結層連接，致使管壁較厚，不利於應用在小口徑人造血管上，且其結構複雜，製備困難，塗層量不可控。常見的醫用人造血管材料一般為疏水性材料表面自由能高，材料本身易與血漿蛋白發生相互作用，形成附壁血栓。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種複合結構人造血管的靜態製備方法，該人造血管的內徑可以< 6mm，血管徑向軸向的強伸性能好、管壁更薄更符合小口徑血管的要求，該製備方法簡單，塗層與管坯之間的粘附カ好，不易剝離。本發明的ー種複合結構人造血管的靜態製備方法，包括通過機織、針織、編織或非織造得到人造血管的管坯，然後將所述的管坯置於細菌纖維素生物反應器中，用第一管狀部件穿過管坯，使得管坯與所述的第一管狀部件同軸套於第二管狀部件的管腔內，且第一管狀部件和第二管狀部件與管坯之間分別留有空隙；高溫滅菌後，向第一管狀部件與第二管狀部件的間隙中倒入含細菌纖維素生產菌株的液體培養基，再向第一管狀部件內注入氧氣或空氣，並將密閉容器中充滿氧氣或空氣，最後於20 32°C下靜態培養2-20天後在管坯內外表面複合上一層納米纖維素膜，即可。所述的非織造為針刺或水刺法。
所述的含細菌纖維素生產菌株的液體培養基的製備方法為將細菌纖維素生產菌株接入液體培養基中擴培，於20-30°C、100-250r/min條件下搖床培養或者靜置培養12 48h。所述的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp·)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp·)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、產喊菌屬(Alcaligenessp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氣菌屬(Azotobacter sp. )、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)或紅茶菌(kombucha)。所述管坯由有機或者無機物組成，為高分子聚合物、多糖類、纖維素、纖維素衍生物、瓊脂、甲殼素、殼聚糖、殼聚糖衍生物、紗布、棉布、紙張、海藻酸類、透明質酸、多肽、蛋白質、明膠、膠原、真絲、羊毛、聚穀氨酸、矽膠、橡膠、木材、澱粉、塑料、滌綸、丙綸、尼龍、奧綸、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、聚四氟乙烯、聚丙烯醯胺、二氧化矽、玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、金屬鹽、金屬氧化物中的一種或幾種。本發明所用的細菌纖維素生物反應器，包括密閉容器，第二管狀部件，第一管狀部件和圓柱空心塞；所述第一管狀 部件與第二管狀部件同軸套於第二管狀部件管腔內，第二管狀部件的開口處通過圓柱空心塞與第一管狀部件密封，第一管狀部件與第二管狀部件的間隙為倒入發酵培養基的空間；所述的第二管狀部件，第一管狀部件和圓柱空心塞皆位於密閉容器內；所述的第一管狀部件和第二管狀部件的材料均為具有透氣但不透水性能的材料。所述的第一管狀部件和第二管狀部件均為圓柱狀、多岔管狀或手形中空狀。所述的第二管狀部件和第一管狀部件的橫截面形狀均為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形、菱形或五角星形。所述的第一管狀部件的下端可密閉於第二管狀部件和圓柱空心塞內(如圖I所示)，也可伸出圓柱空心塞(如圖2所示)。所述的具有透氣但不透水性能的材料選自矽膠、陶瓷、紙、玻璃紙、無紡布、紫砂、尼龍、奧綸、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯乙醇、滌綸、特氟綸、膨體聚四氟乙烯、真絲、尼龍纖維、滌綸纖維、丙綸纖維、再生纖維素纖維、GERO-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、TEXAPR0E、DENTIKS、KING-TEX中的一種或幾種組合。所述的細菌纖維素生物反應器在使用時，將管坯與所述的第一管狀部件同軸套於第二管狀部件管腔內。本發明的設計方案I)材料依據使用要求，管坯的材料使用纖維材料。這些材料可以是具有生物相容性的醫用高分子材料。納米纖維素塗層使用細菌發酵得到的納米纖維素。2)管坯結構設計管坯的管壁採取機織、針織、編織或非織造結構，通過採用比較合適的紗線排列和配比、再加上與之相對應的加工方式，實現一種人造血管管壁上帶有較大孔隙但結構穩定的織物結構。3.)納米纖維素覆膜基本技術路線如下將管坯置於細菌纖維素生物反應器(如圖I或圖2所示)中，用管狀部件穿過管坯，管狀部件和與管坯之間分別留有空隙，高溫滅菌後，在反應器中倒入無菌的發酵培養基、接入細菌纖維素生產菌種子液，置於一定溫度下靜態培養2-20天後在管坯內外表面複合上一層納米纖維素膜，最後將製備的複合結構人造血管材料從模具上取下，然後浸泡於O. 5 2 七％的NaOH溶液中，70-100°C水浴處理30_120min，使細菌纖維素材料呈白色半透明後即可，洗滌至中性，即得細菌纖維素複合結構人造血管產品。本發明得到的複合結構人造血管包括紡織基的管坯和納米纖維素塗層，所述管坯的內徑可以小於或等於6mm;所述管坯的管壁結構為機織、針織、編織或非織造，其孔隙較大且結構穩定；所述管坯的材料為纖維材料。本發明將紡織基的管坯浸在培養液中，細菌產生的納米纖維素在紡織基管坯上以貫穿結構生長形成纖維素塗層，最終形成細菌纖維素塗層的人造血管。納米細菌纖維素在紡織基管坯上直接生長，形成貫穿結構的塗層，克服了上述小口徑血管結構複雜、製備困難的問題；管坯為單層紡織基，且為了滿足納米細菌纖維素塗層要求，管坯具有大孔隙和結構穩定的性能，得到的小血管管壁更薄；納米細菌纖維素塗層是由細菌分泌，以貫穿的形式生長粘附到紡織基管坯上，可通過控制生長時間、生長條件等控制其生長的量和方向，所以塗層量可控且塗層更均勻；納米纖維素塗層具有較高的生物相容性和優異的生物力學性能，且為親水性材料表面自由能低，材料本身不易與血漿蛋白發生相互作用，防止附壁血栓形成，提高了小口徑人造血管的通暢率。有益效果(I)本發明的管坯為單層紡織基，具有大孔隙和結構穩定的性能，得到的小血管徑向軸向的強伸性能好、管壁更薄更符合小口徑血管的要求；(2)納米細菌纖維素在紡織基管坯上直接生長，形成貫穿結構的塗層，結構簡單、製備容易，塗層與管坯之間的粘附力好，不易剝離；(3)納米細菌纖維素塗層是由纖維素細菌分泌，以貫穿的形式生長粘附到紡織基 管坯上，可通過控制生長時間、生長條件等控制其生長的量和方向，所以塗層量和均勻性人為可控；(4)納米細菌纖維素塗層具有較高的生物相容性和優異的生物力學性能，且為親水性材料表面自由能低，材料本身不易與血漿蛋白發生相互作用，有效防止附壁血栓形成。(5)納米纖維素塗層的人造血管管壁密閉性好，不需要預凝血，後整理工序可以適當簡化。


圖I和圖2為本發明所用的細菌纖維素生物反應器的裝置剖視圖；圖中1-密閉容器，2-第二管狀部件，3-第一管狀部件，4-管坯，5-圓柱空心塞，6-倒入發酵培養基的空間(空隙)；圖3為實施例I中粘膠纖維管坯或者棉纖維管坯塗覆納米纖維素的掃描電鏡照片;圖4為實施例I中紗羅組織的管狀組織的組織圖；圖5為實施例I中纖維素塗層的管壁；圖6為實施例2中緯平針組織的組織圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例I管坯的材料採用50D/12f的粘膠有光絲；經緯紗結構為三股合編；管坯組織採用基礎組織為紗羅組織的管狀組織(如圖5所示由地經7、絞經8和緯紗9編織而成)。織物參數經密*糹韋密(根/IOcm)為400*100,折徑(mm)為10,總經根數(根)為40。織造組織圖見圖4。選擇木醋桿菌發酵的纖維素對管坯進行塗層。在生物反應器(圖I或圖2)中發酵培養2-20天，最終製得細菌纖維素塗層的人造血管。發酵培養工藝(I)菌種培養將木醋桿菌(Acetobacter xylinum)接入300mL液體培養基(每11水中，甘露醇2(^、蛋白腖38、酵母浸膏58，？!13.0，1211滅菌20min ;或葡萄糖200g，酵母浸膏 5g，胰蛋白腖 5g，檸檬酸 I. 15g，Na2HPO4 2. 7g，水 1L，ρΗ7· 5，121°C滅菌 20min)擴培，於20°C、100r/min條件下搖床培養或者靜置培養12h後備用；(2)細菌纖維素複合人造血管的發酵製備用第一管狀部件3穿過管坯4，使得管坯4與所述的第一管狀部件3同軸套於第二管狀部件2管腔內，第一管狀部件3和第二管狀部件2與管坯4之間分別留有空隙，向生物反應器(圖I)的空隙6中，注滿步驟(I)製備的含生產菌株的液體培養基，並確保不漏液，然後向第一管狀部件3內注入氧氣或空氣，並將整個發酵裝置(即密閉容器(I)中充滿氧氣或空氣)放入充滿氧氣或空氣的環境中，於20 32°C進行發酵培養2-20天，細菌纖維素產生菌便會在第二管狀部件2的內表面和第一管狀部件3的外表面上分別合成纖維素，並最終穿過管坯4並與其複合形成一個具備模具形狀的細菌纖維素複合結構人造血管整體材料，材料的SEM照片見圖3。實施例2管坯的材料採用50D/12f的粘膠有光絲；紗線結構為三股合編；組織採用基礎組織為緯平針組織的針織管狀組織。織物參數經密*緯密(個/5cm)為35*55,針筒直徑(mm)為 6。織造組織圖見圖6。選擇葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)發酵的纖維素對管坯進行塗層。在生物反應器(圖I)中發酵培養2-20天，最終製得細菌纖維素塗層的人造血管。塗覆納米纖維素的人造血管材料的電鏡照片與圖3結果類似。發酵培養工藝(I)菌種培養將葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)接入300mL液體培養基(每IL水中，甘露醇20g、蛋白腖3g、酵母浸膏5g，pH3. 0,121°C滅菌20min ;或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白腖5g，檸檬酸I. 15g，Na2HPO4 2. 7g，水1L，pH7. 5，121°C滅菌20min)擴培，於20°C、100r/min條件下搖床培養或者靜置培養12h後備用；(2)細菌纖維素複合人造血管的發酵製備用第一管狀部件3穿過管坯4，使得管坯4與所述的第一管狀部件3同軸套於第二管狀部件2管腔內，第一管狀部件3和第二管狀部件2與管坯4之間分別留有空隙，向生物反應器(圖I或圖2)的空間6中，注滿步驟(I)製備的含生產菌株的液體培養基，並確保不漏液，然後向第一管狀部件3內注入氧氣或空氣，並將整個發酵裝置放入充滿氧氣或空氣的環境中，於20 32°C進行發酵培養2-20天，細菌纖維素產生菌便會在第二管狀部件2的內表面和第一管狀部件3的外表面上分別合成纖維素，並最終穿過管坯4並與其複合形成一個具備模具形狀的細菌纖維素複合結構人造血管材料。實施例3管坯的紗線採用50D/12f的粘膠有光絲；組織採用基礎組織為繩編管狀組織。織物參數紗管個數為32,芯筒直徑(mm)為6。選擇紅茶菌(kombucha)發酵的纖維素對管坯進行塗層。在生物反應器(圖I)中發酵培養1-7天，最終製得細菌纖維素塗層的小口徑人造血管。塗覆納米纖維素的人造血管材料的電鏡照片與圖2結果類似。發酵培養工藝(I)菌種培養將紅茶菌(kombucha)按接入5片直徑O. 5cm圓片含菌BC膜的接 種量接入300mL液體種子培養基(每IL水中，綠茶5g，葡萄糖10、蛋白腖3g、酵母浸膏5g，ρΗ3· O,巴氏滅菌30min ;每IL水中，葡萄糖100g、蛋白腖3g、酵母浸膏5g,pH7. 5,121°C滅菌20min)擴培，於25°C、150r/min條件下搖床培養或者靜置培養24h後備用；(2)細菌纖維素複合人造血管的發酵製備用第一管狀部件3穿過管坯4，使得管坯4與所述的第一管狀部件3同軸套於第二管狀部件2管腔內，第一管狀部件3和第二管狀部件2與管坯4之間分別留有空隙，向生物反應器(圖I或圖2)的空間6中，注滿步驟(I)製備的含生產菌株的液體培養基，並確保不漏液，然後向第一管狀部件3內注入氧氣或空氣，並將整個發酵裝置放入充滿氧氣或空氣的環境中，於20 32°C進行發酵培養2-20天，細菌纖維素產生菌便會在第二管狀部件2的內表面和第一管狀部件3的外表面上分別合成纖維素，並最終穿過管坯4並與其複合形成一個具備模具形狀的細菌纖維素複合結構人造血管整體材料。實施例4管坯的紗線採用50D/12f的殼聚糖纖維；組織採用基礎組織為繩編管狀組織。織物參數紗管個數為32,芯筒直徑(mm)為6。選擇木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)發酵的纖維素對管還進行塗層。在生物反應器(圖I或圖2)中發酵培養1-7天，最終製得細菌纖維素塗層的小口徑人造血管。塗覆納米纖維素的人造血管材料的電鏡照片與圖2結果類似。發酵培養工藝(I)菌種培養將木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)接入300mL液體培養基(每IL水中，甘露醇20g、蛋白腖3g、酵母浸膏5g，pH3.0，12rC滅菌20min ;或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白腖5g，檸檬酸I. 15g,Na2HPO4 2. 7g，水lL，pH7. 5，121°C滅菌20min)擴培，於20°C、100r/min條件下搖床培養或者靜置培養12h後備用；(2)細菌纖維素複合人造血管的發酵製備用第一管狀部件3穿過管坯4，使得管坯4與所述的第一管狀部件3同軸套於第二管狀部件2管腔內，第一管狀部件3和第二管狀部件2與管坯4之間分別留有空隙，向生物反應器(圖I或圖2)的空間6中，注滿步驟
(I)製備的含生產菌株的液體培養基，並確保不漏液，然後向第一管狀部件3內注入氧氣或空氣，並將整個發酵裝置放入充滿氧氣或空氣的環境中，於20 32°C進行發酵培養2-20天，細菌纖維素產生菌便會在第二管狀部件2的內表面和第一管狀部件3的外表面上分別合成纖維素，並最終穿過管坯4並與其複合形成一個具備模具形狀的細菌纖維素複合結構人造血管整體材料。實施例5本發明所用的細菌纖維素生物反應器，包括密閉容器1，第二管狀部件2，第一管狀部件3和圓柱空心塞5 ;所述第一管狀部件3與第二管狀部件2同軸套於第二管狀部件2管腔內，第二管狀部件2的開口處通過圓柱空心塞5與第一管狀部件3密封，第一管狀部件3與第二管狀部件2的間隙為倒入發酵培養基的空間6 ;所述的第二管狀部件2，第一管狀部件3和圓柱空心塞5皆位於密閉容器I內；所述的第一管狀部件3和第二管狀部件2的材料均為具有透氣但不透水性能的材料。所述的第一管狀部件3和第二管狀部件2為圓柱狀，或多岔管狀，或手形中空狀。所述的第二管狀部件2和第一管狀部件3的橫截面形狀為圓形、方形、橢圓形、三 角形、心形、菱形或五角星形。所述的第一管狀部件3的下端可密閉於第二管狀部件2和圓柱空心塞5內(如圖I所示)，也可伸出圓柱空心塞5 (如圖2所示)。所述的具有透氣但不透水性能的材料選自矽膠、陶瓷、紙、玻璃紙、無紡布、紫砂、尼龍、奧綸、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯乙醇、滌綸、特氟綸、膨體聚四氟乙烯、真絲、尼龍纖維、滌綸纖維、丙綸纖維、再生纖維素纖維、GERO-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、TEXAPROE、DENTIKS、KING-TEX中的一種或幾種組合。所述的細菌纖維素生物反應器在使用時，將管坯4與所述的第一管狀部件3同軸套於第二管狀部件2管腔內。
權利要求
1.一種複合結構人造血管的靜態製備方法，包括 通過機織、針織、編織或非織造得到人造血管的管坯(4)，然後將所述的管坯(4)置於細菌纖維素生物反應器中，用第一管狀部件(3)穿過管坯(4)，使得管坯(4)與所述的第一管狀部件(3)同軸套於第二管狀部件(2)的管腔內，且第一管狀部件(3)和第二管狀部件(2)與管坯(4)之間分別留有空隙，高溫滅菌後，向第一管狀部件(3)與第二管狀部件(2)的間隙￠)中倒入含細菌纖維素生產菌株的液體培養基，再向第一管狀部件(3)內注入氧氣或空氣，並將密閉容器(I)中充滿氧氣或空氣，最後於20 32°C下靜態培養2-20天，SP可。
2.根據權利要求I所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述的非織造為針刺或水刺法。
3.根據權利要求I所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述的含細菌纖維素生產菌株的液體培養基的製備方法為將細菌纖維素生產菌株接入液體培養基中擴培，於20-30°C、100-250r/min條件下搖床培養或者靜置培養12 48h。
4.根據權利要求I或3所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、產喊菌屬(Alcaligenessp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氣菌屬(Azotobacter sp. )、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、木醋桿菌(Acetobacter xyIinum)或紅茶菌(kombucha)。
5.根據權利要求I所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述管坯(4)由有機或者無機物組成，為高分子聚合物、多糖類、纖維素、纖維素衍生物、瓊脂、甲殼素、殼聚糖、殼聚糖衍生物、紗布、棉布、紙張、海藻酸類、透明質酸、多肽、蛋白質、明膠、膠原、真絲、羊毛、聚穀氨酸、矽膠、橡膠、木材、澱粉、塑料、滌綸、丙綸、尼龍、奧綸、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、聚四氟乙烯、聚丙烯醯胺、二氧化矽、玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、金屬鹽、金屬氧化物中的一種或幾種。
6.根據權利要求I所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述的第一管狀部件(3)和第二管狀部件(2)均為圓柱狀、多岔管狀或手形中空狀。
7.根據權利要求I所述的一種複合結構人造血管的靜態製備方法，其特徵在於所述的第二管狀部件(2)和第一管狀部件(3)的橫截面形狀均為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形、菱形或五角星形。
全文摘要
本發明涉及一種複合結構人造血管的靜態製備方法，包括通過機織、針織、編織或非織造得到人造血管的管坯，然後將所述的管坯置於細菌纖維素生物反應器中，用第一管狀部件穿過管坯，第一管狀部件和第二管狀部件與管坯之間分別留有空隙，高溫滅菌後，向第一管狀部件與第二管狀部件的間隙中倒入含細菌纖維素生產菌株的液體培養基，再向第一管狀部件內注入氧氣或空氣，並將密閉容器中充滿氧氣或空氣，最後於20～32℃下靜態培養2-20天，即可。本發明的血管徑向軸向的強伸性能好、管壁薄符合人造血管的要求，管壁密閉性好，不需要預凝血；本發明的製備方法簡單，納米細菌纖維素塗層生物相容性和生物力學性能好。
文檔編號C12R1/065GK102657561SQ201210120998
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者蘭水, 李毓陵, 杜倩雯, 洪楓 申請人:東華大學