雙層培養容器以及培養方法
2023-08-13 17:36:31
專利名稱：雙層培養容器以及培養方法
技術領域：
本發明涉及細胞或微生物的培養容器以及培養方法，特別涉及保存培養液、實現最佳培養環境、內容物的易提取性優異，適合於浮遊細胞的培養和使用小珠、無紡織布等載體的附著細胞培養的培養容器以及使用所述培養容器的培養方法。
背景技術：
過去，作為細胞培養用的培養容器，已知的有在由透氣性好的塑料製成的袋中填充培養液的裝有培養基的袋。例如實開平2-93999號公報中公開了裝有培養基的袋，它是在由柔韌的塑料片形成的袋狀主體上端部中間安裝配置除菌過濾器的溶劑注入軟管和培養基導出口，在袋狀主體內封入經過滅菌的培養基組成的袋。另外實開平3-172169號公報中公開了一種保存兼組織培養用容器，其由非透氣性材料包裝密封內部容納組織培養用培養基的透氣性組織培養用密封容器組成，在組織培養時除去非透氣性材料使用。特開平4-71482號公報中公開了裝有液體培養基的包裝袋的製造方法，它是在由透氣率高的薄膜組成的、經γ射線滅菌的培養袋中，無菌填充經過濾除菌的液體培養基，對其填充口進行無菌密封后，再由透氣率低、並經γ射線滅菌的2次包裝材料無菌包裝製成的。
發明公開發明要解決的課題細胞培養通常是在可以控制氣體的組成的培養箱內進行，所以當同時培養偏嗜不同氣體濃度的多種類細胞時，應用過去的培養袋，則必需要有氣體濃度不同的多個培養箱，需要大的空間，除此之外操作也很複雜，耗時多。另外培養時，過去的培養袋只能以扁平狀態擺放在培養箱內的網架上，即不能重疊放置或吊起，所以必需要有大的空間。
另外過去的培養袋的壁薄，形狀穩定性差，在流通過程中有可能破損，操作時需要相當注意，非常麻煩。即使如上述專利文獻2、3所述，保存時在外側使用非透氣性的包裝材料，培養袋在內側處於浮動狀態，形狀不穩定；或附著在外側的包裝材料上，其狀態與單層培養袋沒有大差別，所以在缺乏形狀穩定性、流通過程中有可能破損方面沒有變化。
而且過去的培養袋，在細胞培養完畢後取出內容物時，是將培養袋吊起，通過重力而取出內容物，所以相當費時間，效率低。即使要暫時對培養袋內加載內壓而取出內容物，袋自身會膨脹，取出也很困難。
本發明是鑑於過去涉及培養容器的上述問題進行研究，目的在於提供即使同時培養偏嗜不同氣體濃度的多種類細胞，也不需要多個不同的培養箱，培養時可以重疊放置或吊起，能夠節約空間；在流通過程中不易破損，利於作為流通容器；在細胞培養完畢後，可以高效取出內容物的培養容器。
本發明的另一目的在於提供使用上述培養容器培養細胞、微生物的方法。
發明內容
為達到上述目的，本發明所提供的雙層培養容器的特徵是具備具有注入·抽出口的透氣性培養容器、罩在該培養容器上的氣密性容器、和使該培養容器和該氣密性容器之間能夠形成空間並把該培養容器保持在該氣密性容器內的培養容器保持手段，在細胞或微生物培養時，在該培養容器和該氣密性容器間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
本發明的一個方面是雙層培養容器，其中，該培養容器保持手段是使該培養容器部分連接到該氣密性容器上的手段。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，它是在該氣密性容器中設置通氣口，該通氣口與該培養容器和該氣密性容器之間的空間是連通的。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，它是在培養時，該培養容器的容器壁基本上是形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的稜柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，它是在該培養容器中填充·密封培養液，用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對該培養容器和該氣密性容器之間的空間進行置換形成的。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，它是在該培養容器中填充·密封培養液，對該培養容器和該氣密性容器之間的空間進行脫氣形成的。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，它是在該培養容器中填充·密封培養液，在該培養容器和該氣密性容器之間的空間封入氧吸收劑形成的。
本發明的另一個方面，提供雙層培養容器，該氣密性容器具有氧吸收部分或氧吸收層。
本發明的另一個方面，提供細胞或微生物的培養方法，它是在由具有注入·抽出口的透氣性培養容器和罩在該培養容器上的氣密性容器組成雙層培養容器，在該培養容器和該氣密性容器之間的空間，控制氣體組成進行培養的方法。
本發明的另一個方面，提供培養方法，它是從與該培養容器和該氣密性容器之間的空間相連通的通氣口注入·抽出控制氣體的組成的氣體的方法。
本發明的另一個方面，提供培養方法，它是在培養過程中，通過向該培養容器和該氣密性容器之間的空間注入壓縮氣體，抽出培養容器中內容物的方法。
發明的效果如果按照本發明，由於在細胞培養時，在培養容器和氣密性容器之間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體，所以當同時培養偏嗜不同氣體濃度的多種類細胞時，把為培養這些細胞的多個雙層培養容器配置在共同的恆溫室中，通過向這些雙層培養容器中注入必要氣體濃度的氣體，不需要多個培養箱，就可以簡單地進行細胞培養。另外如果按照本發明，使培養容器和氣密性容器之間可以形成空間，通過培養容器保持手段把培養容器保持在氣密性容器內，所以培養時，即使將雙層培養容器重疊放置，氣體也可以滲透到各培養容器中，不會對培養形成障礙。另外培養容器，即使將其豎立吊起，容器的形狀也不會變化，所以在恆溫室內可以以豎立吊起的狀態配置多個培養容器，與過去的培養容器相比，可以減少設置空間。
另外如果按照本發明，在培養後，通過在培養容器和氣密性容器之間的空間內注入壓縮空氣等壓縮氣體，可以迅速取出培養容器內的內容物，與過去的通過重力進行取出的方法相比，可以高效地進行內容物取出。
如果按照本發明的一個方面，培養容器，在培養時基本上形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的稜柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀，所以容器內的氣體擴散方向幾乎是氣體從360度方向面對容器中心部分擴散，所以與由扁平袋組成的過去的培養容器相比，在容器壁附近和遠離容器壁部分的各溶解氣體濃度差變小。因此可以使培養條件更加接近最佳培養條件，可以提高細胞等的培養效率和細胞培養的活度。
如果按照本發明的另一個側面，通過用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對培養容氣和氣密性容器之間的空間進行置換，或者對該空間進行脫氣，可以更加徹底防止培養液的氧化，延長培養液的保存時間。同樣通過在該空間中，封入氧吸收劑或者在氣密性容器中設置氧吸收部或氧吸收層，可以獲得同樣的效果。
附圖的簡單說明
圖1是有關本發明一個實施方案的雙層培養容器的平面圖。
圖2是圖1的A-A斷面圖。
圖3是圖1的B-B斷面斜視圖。
圖4是培養容器的平面圖。
圖5是為了表示預先設置的通氣口，切去一部分氣密性容器表示的斜視圖。
圖6是表示後設置通氣口的雙層培養容器的斷面圖。
圖7是表示容器壁的各種形狀的斷面圖。
圖8是表示把過去的容器和本發明的培養容器分別豎立吊起狀態的側斷面圖。
圖9是表示培養容器製造方法的斷面圖。
圖10是表示有關本發明另一實施方案雙層培養容器中的培養容器的平面圖。
圖11是表示有關本發明另一實施方案雙層培養容器的平面圖。
圖12是表示培養容器保持手段另一例的斷面圖。
圖13是表示本發明另一實施方案的斷面圖。
圖14是表示本發明另一實施方案的斷面圖。
圖15是表示本發明另一實施方案的斷面圖，(a)是斷面圖，(b)是(b)的E-E斷面斜視圖。
圖16是表示本發明另一實施方案的斷面圖。
圖17是表示本發明另一實施方案的斷面圖。
實施本發明的最佳方案以下參照附圖，對本發明的實施方案進行說明。
圖1～圖4表示有關本發明雙層培養容器的一個實施方案，圖1是其平面圖、圖2是圖1的A-A向視圖、圖3是圖1的B-B斜視圖、圖4是培養容器的平面圖。
雙層培養容器1由培養容器2和氣密性容器3組成。
本發明中培養容器2，在培養時，優選容器壁形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的稜柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。本說明書中，所謂「實質圓筒狀」的含義，如圖7(a)所示，不僅是指正圓的圓筒，還包括如圖7(d)所示的形狀多少有變化的圓形斷面或橢圓斷面等，在不影響實現本發明目的的範圍內，使正圓產生形狀變化的斷面形狀的圓筒。同樣所謂「橫斷面基本上為正多邊形的稜柱體狀」的含義，不僅是指斷面為正三角形、正方形(示於圖7(e))、正五邊形、正六邊形(示於圖7(b))，正八邊形(示於圖7(c))等正多邊形的稜柱體，還包括在不影響實現本發明目的的範圍內，多少使這些正多邊形產生變形的橫斷面形狀的稜柱體。
培養容器2由透氣性優異的塑料形成，具備把多根(圖示例中為5根)圓筒5配置成遊泳氣墊形狀的圓筒部4和與圓筒部4長度方向兩端相連接形成的端部2a、2b，作為整體是平面視圖為矩形的袋狀容器，兩端部2a、2b的外邊緣部分分別密封，端部2a、2b表面是平坦形狀，各圓筒5通過端部2a、2b相互連通。端部2a中，設置為培養液、細胞、細胞生長因子等各種藥品類的注入·抽出口6，與培養容器2的內部連通。這樣的注入·抽出口，可以根據所需目的設置相應的必要數量，根據需要還可以設置連接用的軟管和在其頂端部設置連接器。
製造該培養器2時，如圖9所示，通過使矩形的撓性塑料片7、8以一定間隔相對配置，在四邊的邊緣部分7a、8a處用熱封進行連接後，通過沿相對片材7、8長度方向的對應線7b和8b、7c和8c、7d和8d、7e和8e，對兩片材料7、8進行部分熱封，可以形成由5根圓筒5組成的圓筒部分4。
這樣可以通過在對具有撓性的柔軟培養容器2的相對壁面進行熱封的同時，填充一定量或一定量以上的培養液，使培養容器2具有形狀保持性，防止或者降低培養容器2和氣密性容器3之間的附著，並且可以防止或降低氣體對培養容器2的擴散損失。此外作為使其具有形狀保持性的手段，除了熱封以外，還可以進行用夾具、夾子或磁鐵等按壓容器的手段，進行按壓，使相對的撓性容器壁部分接觸。另外，作為為了防止或降低附著的手段，也可以在培養容器2和氣密性容器3之間的容器壁之間夾入為防止附著的組件，或在各容器壁上設置凹凸部分。
作為透氣性培養容器2，優選使用透氣性好，並可以承受γ射線滅菌材質的容器。例如以聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、乙烯醋酸乙烯共聚物(EVA)、乙烯丙烯酸乙酯共聚物(EEA)、乙烯甲基丙烯酸甲酯共聚物(EEMA)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)和聚丙烯(PP)或聚乙烯等的聚合物共混物等軟質塑料為材料的薄膜袋以及吹塑成型袋等容器。除此之外，不通過γ-射線進行滅菌時，可以使用特氟隆(註冊商標)、矽酮橡膠、4-甲基戊烯-1的均聚物或共聚物、丁二烯的均聚物或共聚物。作為共聚物的其它單體，可以使用碳原子數為2～24的α-烯烴和苯乙烯等，還可以使用對含前述α-烯烴的1種、2種或2種以上的聚合物進行共混的材料。
在圖1的實施方案中，如圖3所示，氣體從各圓筒5的容器壁沿箭頭C方向，也就是從360度方向面對各圓筒5的中心部分擴散，所以容器壁附近和離容器壁最遠的中心部分的各溶解氣體的濃度差別變小，可以使培養條件更接近最佳培養條件。另外在培養時，根據需要，以不使細胞破壞的程度，對培養空器2進行振蕩、搖動或使其進行旋轉運動。這樣可以防止在浮遊細胞或微生物的培養時，可以看到的細胞或微生物的沉降，並促進對培養液的攪拌，所以從保持均勻性觀點考慮是理想的。
培養容器2的端部2a、2b的培養容器長度方向外側和圓筒部4的培養容器寬度方向外側，也就是培養容器2的四邊，如圖4所示通過對2枚片材進行熱封，形成密封部2c、2d、2e、2f。這些密封部中，密封部2d形成切去氣體注出口部分的形狀，以便不妨礙設置後面將要敘述的氣密性容器3的氣體注出口。
氣密性容器3，為了使氣體能夠在其與內側的培養容器2之間流通，是其尺寸大小可以形成足夠空間的容器，作為整體形成平面視圖為矩形、並且封閉其四邊。氣性密性容器3，例如是使2枚氣密性塑料片材重合進行熱成型，使中央部分膨脹突出，並且在四邊形成密封部3a、3b、3c、3d而製造。在氣密性容器3的一側端部設置氣體注入口9，在另一端部設置氣體排出口10，與容器3內部連通。氣體注入口9、氣體排出口10構成本發明的通氣口。另外，通氣口可以兼作注入口9和氣體排出口10使用，至少設置1個，優選設置2個。另外培養氣體的組成，可以根據要培養的細胞和微生物進行適當選擇。培養氣體可以是間歇流動或連續流動，通過調整培養氣體的壓力，可以在加載壓力的狀態下培養和在變化壓力的狀態下培養。
氣密性容器3的密封部3a、3b，使其分別夾持培養容器2的密封部2c、2d，並與該密封部2c、2d熔合，這樣形成氣密性容器3和培養容器2的接合部12、13。，接合部分12、13使培養容器2和氣密性容器3之間可以形成空間，具有把培養容器2保持在氣密性容器3內的功能，構成本發明的培養容器保持手段。
如圖5所示，通氣口可以在製造雙層培養容器時，預先在氣密性容器3的端部形成，或者以沒有設置通氣口的雙層培養容器的形式流通，之後在培養時如圖6所示，在氣密性容器3密封部以外的部分安裝通氣口14。
作為氣密性容器3，可以是單層或多層的吹塑成型袋和單層或多層的薄膜袋，沒有特別限制。當是單層吹塑成型袋或薄膜袋時，優選是含有容易與培養容器表面層進行熱封、並且具有撓性材質的薄膜，例如由聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、乙烯-烯烴共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)等組成的塑料薄膜。特別優選由與容器主體的表面積相同或同系列的材質組成。還優選同時使用氧吸收劑。
當賦予高氣密性時，優選使用多層薄膜，作為具有氣密性的材料，優選使用如雙軸向取向聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、雙軸向取向尼龍薄膜等單層或多層拉伸薄膜，由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)、聚乙醇酸、芳香族聚醯胺、聚偏氯乙烯(PVDC)等組成的薄膜，各種聚偏氯乙烯塗布薄膜，蒸鍍鋁或蒸鍍氧化矽的聚酯或聚醯胺薄膜等合成樹脂薄膜和以上述塑料薄膜作為密封膠的多層薄膜。
為了形成這些多層膜，除了共擠出吹塑以外，還可以應用幹複合、夾層複合、擠塑複合等已知的任意層合方法。
在雙層培養容器1的流通階段，通過用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳氣的混合氣體對培養容器2和氣密性容器3之間的空間進行置換，或對該空間進行脫氣，可以提高培養液的保存性，延長保存時間。同樣在該空間中封入氧吸收劑或者通過在氣密性容器3中設置氧吸收部或氧吸收層，也可以獲得同樣的效果。
氧吸收劑或氧吸收樹脂，可以使用已知的任意材料。例如作為鐵系的氧吸收劑，優選使用含鐵或鐵系化合物的鐵粉和滷化金屬的混合物。作為鐵粉，只要是能夠產生氧吸收反應，對其純度沒有特別限制，例如可以使用還原鐵粉、噴霧鐵粉、電解鐵粉等鐵粉，鑄鐵、鋼材等各種鐵的粉碎物和研磨材料，以及碳化鐵、羰基鐵、氧化亞鐵、氫氧化亞鐵矽酸鐵等鐵系化合物。一般優選粒狀材料，作為粒徑，考慮到使用操作性、可以減薄氧吸收層的膜厚、薄膜外觀上出現的氧吸收劑的凹凸情況，優選1～80μm範圍，特別優選1～50μm範圍。
作為鐵系氧吸收劑助劑的滷化金屬，可以使用如鹼金屬或鹼土類金屬的氯化物、溴化物或碘化物，優選使用鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋇等的氯化物或碘化物。鐵粉每100重量份的滷化金屬配合量優選為0.1～20重量份，特別優選0.1～5重量份。從各成分不容易分離的觀點考慮，優選滷化金屬預先與鐵粉混合，進行添加。優選的氧吸收劑，是含有鐵粉和滷化金屬的鐵粉系組合物，特別優選使滷化金屬附著在鐵粉上的滷化金屬覆蓋鐵粉系的組合物。
鐵系的氧吸收劑，既可以把它裝在透氣性的培養容器2和罩在該容器上的氣密性容器3之間形成的空間或與之相連的空間中，並使其不會漏到無紡織布或者是紙等材料上使用，還可以混合到構成容器的出入口嘴、蓋等的一部分樹脂中。另外還可以在氣密性容器3的任意層中，作為氧吸收層使用，為了能夠觀察到氣密性容器3的內部，優選在氣密性容器3的一個側面或一部分使用。
鐵系氧吸收劑相對於樹脂的配合量，優選為10～70重量％範圍，更優選10～60重量％範圍。如果氧吸收劑的配合量低於10重量％，則吸收氧的能力不充分；如果高於70重量％，則有時注射成型、壓塑成型、制膜加工等加工將變得困難。氧吸收層的膜厚，不限於何種構成材料，優選為10～100μm範圍，特別優選20～80μm範圍。如果氧吸收層的膜厚比10μm薄，則薄膜單位面積的氧吸收劑量將會變少，得不到充分的氧吸收性能。另外如果比100μm厚，則薄膜的總厚度將會變厚，有時會產生使用操作不方便或在成本上發生問題。
作為氧吸收樹脂，可以使用含有金屬系氧化催化劑和氧化性樹脂或氧化性有機成分的樹脂、多酚類、含有抗壞血酸類等和鹼性物質的樹脂。
作為氧化性樹脂或氧化性有機成分，是在過渡金屬系催化劑的作用下，由於空氣中的氧作用而受氧化的樹脂或有機成分。
作為氧化性樹脂，可以使用(1)如聚丙烯的具有叔碳原子的樹脂；(2)如乙烯-一氧化碳共聚物的具有羰基的樹脂；(3)MXD6等具有苯環的聚醯胺樹脂；(4)如聚丁二烯、聚異戊二烯及它們的共聚物的在主鏈上具有不飽和雙鍵的樹脂；(5)在側鏈上具有如環己烯基等的不飽和雙鍵的樹脂；(6)如聚環己二烯等的環狀共軛二烯系樹脂等。作為氧化性有機成分，可以列舉(7)抗壞血酸；(8)半胱氨酸等，它們在與碳酸鈉、乙酸鉀等鹼性物質共同存在下，吸收水分、吸收氧。
作為金屬系氧化催化劑，優選鐵、鈷、鎳等周期表中第VIII族的金屬化合物，此外還可以列舉銅、銀等(第I族)，錫、鈦、鋯等(第IV族)，釩、(第V族)，鉻(第VI族)，錳(第VII族)的金屬化合物。這些金屬化合物中，鈷化合物的吸收氧的速度大，所以特別優選。過渡金屬催化劑，一般以上述過渡金屬的低價數無機酸鹽或有機酸鹽或絡合物的形式使用。相對於樹脂，這些催化劑可以以100至2000ppm的量使用。
氧化性樹脂或氧化性有機成分，與使用鐵系氧吸收劑時相反，不會損壞透視性，所以可以優選使用。還可在透氣性培養容器2和氣密性容器3的一方或雙方的任意部分或全體部分中，作為氧吸收層使用。還可以把它混合在位於培養容器2和氣密性容器3之間形成的空間或與之相連空間中的任意容器構成組件，例如出入口嘴、蓋等的一部分樹脂中使用。
作為在氣密性容器3中設置氧吸收層的材料結構例子，可以是以下的任意結構，但並不局限於此。
氧吸收層(單層時)；外層/氧吸收層(2層時)；外層/氧吸收層/密封膠層；外層/氣密層/氧吸收層/密封膠層；外層/氣密層/氧吸收層/氣密層/密封膠層。
製造本實施方案的雙層培養容器時，根據需要還可以在製造封入氧吸收劑的雙層培養容器後實施γ射線滅菌(或紫外線滅菌、電子射線滅菌、加熱滅菌)，接著無菌填充培養液，並且無菌密封填充口，即完成製造。
以前的容器，在培養時如果將其吊起，則如圖8(a)所示形狀變形，在容器壁附近和遠離容器壁部分的氣體擴散不均勻性非常嚴重，不能形成最佳氣體組成，所以不能向這樣吊起，但是上述實施方案的雙層培養容器，則如圖8(b)所示，在培養時即使將雙層培養容器豎立吊起，容器的形狀也不發生變化，因此可以把多個雙層培養容器以豎立吊起的狀態配置，可以減少配置空間。
圖10和圖11表示有關本發明雙層培養容器的另一個實施方案，在本實施方案中，是在製造設置注入·抽出口6a、6b的培養容器2之後，如圖11所示，使用2枚氣密性材料進行熱封，使其罩住培養容器2形成氣密性容器3，製造雙層培養容器1。
在這個例子中，首先設置注入·抽出口·氣體排出口收存部16、氣體注入口收存部17以及前述注入·抽出口收存部18，然而使包括前述注入·抽出口收存部18的、以C-C劃分的部分19形成未密封部分，用構成氣密性容器3的氣密性材料罩住注入·抽出口6a、6b、氣體注入口9、氣體排出口10。這時可以向注入·抽出口·氣體排出口收存部16內封入氧吸收劑。通過這樣的操作，通過氣體排出口10可以使其具有除去容器主體內的氧的功能，與此同時，在使用時，還可以除去氧吸收劑。
接著把這樣製造的雙層培養容器1的1個或多個置於滅菌袋中，實施γ射線滅菌。然後在無菌環境下打開滅菌包裝，從位於沿C-C開啟的未密封部分19的注入·抽出口6a無菌填充培養液，然後進行無菌密封。之後剩下注入口收存部18，進行熱封，製成雙層培養容器。通過這樣的操作，可以獲得注入·抽出口6a、6b受到氣密性材料保護的優點。
在使用時，沿D-D對抽出口·氣體排出口收存部分16開封，就可以使用，注入·抽出口6b已經經過γ射線的滅菌處理，保持著滅菌狀態，所以具有在注入細胞等時，只對外側進行消毒，不用對抽出口6b進行滅菌的優點。
另外當把氣體排出口10兼作為氣體注入口9使用時，可以不設置前述氣體排注入口9以及氣體注入口收存部17，即使設置，也可以不開封。
在上述實施方案中，培養容器保持手段，由連接部12、13構成，但是培養容器保持手段，並不只限於這樣的連接手段，例如圖12的斷面圖所示，可以通過使由剛性塑料形成的氣密性容器3內側的四個角與培養容器2外側的四個角直接接觸，在容器的長度方向形成支撐培養容器2的培養容器支撐臂15來保持培養容器2。關鍵是只要能夠使培養容器2和氣密性容器3之間形成空間，並且能夠把培養容器2保持在氣密性容器3內的手段，則不論何種手段均可。
在上述實施方案中，是把多個圓筒並列配置成遊泳氣墊狀構成的培養容器，培養容器還可以是由一個圓筒構成的。使容器壁形成稜柱體狀、球狀、半球狀也是同樣的，可以考慮各種變更的例子。
培養容器和氣密性容器，既可以是分別由具有撓性的柔軟塑料組成的袋狀容器，也可以是具有剛性的瓶等容器，還可以是它們的組合。
圖13～圖17是表示本發明另一實施方案的與圖2相同斷面的斷面圖。在圖3的例子中，培養容器2是對相對的壁面實施熱封，形成遊泳氣墊狀，並賦予其形狀保持性。圖13～圖17示出對培養容器2不實施熱封，也不使其具有形狀保持特性時的示例。也就是在本發明中，只要是在培養容器2和氣密性容器3之間能夠形成空間，可以防止或降低氣體對培養容器2擴散的損失，並且能夠把培養容器2保持在氣密性容器3內的手段，則可以採用任何手段，圖13～圖17出示了這些例子的情況，以下進行說明。圖13～圖17中，與圖1～圖12實施方案相同的構成要素，用相同的符號表示，在此省略其說明。
在圖13的實施方案中，氣密性容器3是由具有剛性的塑料形成的容器，透氣性培養容器2是由具有撓性的柔軟塑料形成的容器，在容器2和3之間，鋪滿無紡布等由具有透氣性的材料構成的透氣性墊17。通過該透氣性墊17，形成為容納在兩容器2、3之間控制氣體的組成的氣體的空間。在細胞培養過程中，有時需要用顯微鏡等觀察細胞的生長性，所以不一定要全面鋪設透氣性墊17，可以空出一部分不鋪設透氣墊，只要在可以發揮其功能的範圍內進行設計即可。另外為了使透氣性墊17不產生移位，還可以用已知手段將其粘接或固定在氣密性容器3中。另外在該實施方案中，培養液等的注入·抽出口6的內端部6a在培養容器2內不突出出來，所以取出培養液時，在培養容器2內不會殘存部分培養液，是很方便的。
在圖14的實施方案中，氣密性容器3、培養容器2雙方均是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，在容器2和3之間，鋪滿透氣性墊17，形成容納氣體用的空間。當沿縱向吊起該雙層容器1時，通過由板狀或多根棒狀組件等具有剛性的組件構成的增強夾具18支撐容器的兩側，可以得到與圖8(b)相同的效果，即使培養容器2沒有形成遊泳氣墊的形狀，仍然可以使其形成具有形狀保持性的狀態。
在圖15(a)的斷面圖以及圖15(a)的E-E斷面斜視圖(沒有示出氣密性容器3)的15(b)所示的實施方案中，氣密性容器3、培養容器2的雙方均是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，在容器3的內側平面周邊部分和容器2的外側平面周邊部分之間，安裝增強夾具19，該夾具19分別是由矩形框狀的具有剛性的組件和在該框狀組件上張開的網20組成的。通過該增強夾具19，在容器2、3之間形成氣體容納用的空間，對氣密性容器3的內側和增強夾具19沒有進行固定，以使氣密性容器3的內側和增強夾具19的外側之間形成間隙21，在通過向容器2、3之間的空間注入壓縮空氣等壓縮氣體取出培養容器內的內容物時，不會妨礙壓縮氣體的流通。
在圖16和圖17的實施方案中，氣密性容器3隻有一面是具有剛性的塑料組成，而另一面是具有撓性的柔軟塑料組成的容器；透氣性培養容器2是由具有撓性的柔軟塑料組成的容器，面向氣密性容器3剛性側面的培養容器3的側面附著在氣密性容器3的內側，只在其相反側面和氣密性容器3柔軟側的內側之間形成容納氣體用的空間。另外在這些實施方案中，根據需要氣密性容器3兩面的容器壁可以採用具有撓性的柔軟材料和具有剛性的材料。
產業上的實用性本發明，作為細胞和微生物的培養容器和培養方法是可以利用的，特別是可以作為保存培養液、實現最佳培養環境、內容物的易抽出性優異，作為適合於浮遊細胞培養和使用小珠和無紡織布等載體的附著細胞培養的培養容器和使用該容器的培養方法，是可以利用的。
權利要求
1.雙層培養容器，它的特徵是具備具有注入·抽出口的透氣性培養容器、罩在該培養容器上的氣密性容器、和使該培養容器和該氣密性容器之間能夠形成空間並把該培養容器保持在該氣密性容器內的培養容器保持手段，在細胞或微生物培養時，在該培養容器和該氣密性容器間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
2.根據權利要求1中所述的雙層培養容器，其中，該培養容器保持手段是使該培養容器部分連接到該氣密性容器上的手段。
3.根據權利要求1或2中所述的雙層培養容器，其中，在該氣密性容器中設置通氣口，該通氣口與該培養容器和該氣密性容器之間的空間是連通的。
4.根據權利要求1～3任意一項中所述的雙層培養容器，其中，在培養時，該培養容器的容器壁基本上是形成圓筒狀、橫斷面為正多邊形的稜柱體狀、球狀或半球狀的任意一種形狀。
5.根據權利要求1～4任意一項中所述的雙層培養容器，其中，在該培養容器中填充·密封培養液，用惰性氣體或惰性氣體與二氧化碳的混合氣體對該培養容器和該氣密性容器之間的空間進行置換。
6.根據權利要求1～4任意一項中所述的雙層培養容器，其中，在該培養容器中填充·密封培養液，對該培養容器和該氣密性容器之間的空間進行脫氣。
7.根據權利要求1～6任意一項中所述的雙層培養容器，其中，在該培養容器中填充·密封培養液，在該培養容器和該氣密性容器之間的空間封入氧吸收劑。
8.根據權利要求1～7任意一項中所述的雙層培養容器，其中，該氣密性容器具有氧吸收部分或氧吸收層。
9.培養方法，它是在由具有注入·抽出口的透氣性培養容器和罩在該培養容器上的氣密性容器組成的雙層培養容器的該培養容器和該氣密性容器之間的空間，控制氣體組成進行培養的方法。
10.根據權利要求9中所述的培養方法，其中，從與該培養容器和該氣密性容器之間的空間相連通的通氣口注入·抽出控制氣體的組成的氣體。
11.根據權利要求9或10中所述的培養方法，其中，在培養過程中，通過向該培養容器和該氣密性容器之間的空間注入壓縮氣體，抽出該培養容器中內容物。
全文摘要
本發明提供即使同時培養偏嗜不同氣體濃度的多種類細胞時，也不需要多個培養箱的培養容器和培養方法。雙層培養容器1具備具有注入·抽出口6的透氣性培養容器2、罩在該培養容器2上的氣密性容器3、和使該培養容器2和該氣密性容器3之間可以形成空間，把該培養容器2保持在該氣密性容器3內的連接部12、13，在細胞或微生物培養時，在該培養容器2和該氣密性容器3間形成的空間中容納控制氣體的組成的氣體。
文檔編號C12N1/00GK1942575SQ200580011298
公開日2007年4月4日 申請日期2005年4月7日 優先權日2004年4月13日
發明者波多野靖, 松木理三郎 申請人:東洋制罐株式會社