一種丹參和三七製劑的質量控制方法
2023-08-13 10:56:01 1
專利名稱：一種丹參和三七製劑的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物的質量控制領域，具體為指紋圖譜領域，具體涉及丹參和三七複方的HPLC-DAD指紋圖譜鑑定方法。其可作為含有丹參和三七藥材的複方製劑質量控制的指標之一。
背景技術：
含有丹參和三七的製劑，通常亦被稱為複方丹參製劑，在臨床上廣泛用於治療心血管疾病。常見的有複方丹參片，複方丹參滴丸，丹七片，冠心丹參片等。
丹參和三七是複方丹參製劑的兩個主要組成藥物，其中丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的乾燥根，具祛瘀止痛，活血通經，清心除煩之功效，用於月經不調，經閉痛經，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痺疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛；三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的乾燥根，具散瘀止血，消腫定痛之功效。用於咯血，吐血，衄血，外傷出血，跌扑腫痛等症。
現代研究表明丹參的活性成分主要為二萜醌類脂溶性及丹參酚酸類水溶性有效成分，丹參酚酸類成分具抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗氧化及保護心臟微血管內皮細胞等作用；丹參酮等脂溶性成分能擴張冠狀動脈，提高冠脈血流，保護心肌及廣譜抑菌作用。三七皂苷類成分是三七的主要活性成分，具抗血栓形成，擴張血管及保護心肌等作用。
目前關於丹參和三七複方製劑指紋圖譜鑑定方法的研究報導，大多為丹參或三七單味藥材的鑑定，如丹參藥材乙醇提取物高效液相色譜指紋圖譜研究(中國藥學雜誌2004年8月第39卷第8期)、三七指紋圖譜研究(Strait Pharmaceutical Journal Vol14 No52002)。現有技術未能用指紋圖譜同時鑑定丹參和三七兩味藥中多類活性成分。
發明內容
本發明的目的在於建立一種能夠同時鑑定丹參和三七複方中丹參與三七兩味藥中多類活性成分的指紋圖譜。
本發明的另一目的在於將本發明的指紋圖譜用於含有丹參和三七藥材的複方製劑的質量控制。
本發明是這樣實現的
我們模擬了丹七片的處方(以下稱為丹七方)，通過對丹七方供試液製備方法，色譜條件選擇及色譜條件方法學研究，確定了丹七方HPLC-DAD指紋圖譜。該指紋圖譜可滿足對丹七方中丹參和三七的多類活性成分的同時檢測與分析。我們又進一步將此指紋圖譜用於含有丹參和三七藥材的複方製劑質量控制。
本發明的具體方案如下使用高效液相色譜儀，DAD檢測器，色譜工作站，將丹參和三七複方溶液，採用如下色譜條件色譜柱碳十八烷基鍵合矽膠填料色譜柱和預柱；柱溫25-35℃；流動相A為0.1-0.5％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％，採用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分鐘後梯度為55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B；流速1ml/min，在22～28分鐘時，流速為0.8ml/min；檢測波長203，281nm。
優選的柱溫是30℃。
優選的磷酸水的濃度為0.1％，為體積百分比。
供試品溶液的製備方法是取粉碎的丹參和三七，加入85-95％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，濾過；藥渣加水煎煮，放冷，濾過，合併濾液，濃縮至近幹，加50-90％甲醇溶解，定容。
優選的製備方法是取粉碎的同樣份數的丹參和三七，加入6-12倍重量份數的90％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，濾過；藥渣加水煮，加水量是藥材重量的10-30倍，放冷，濾過，合併濾液，於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解，定容。
上述液相色譜儀進樣量優選10μl。
本發明的指紋圖譜鑑定方法，記錄時間在85分鐘即可，用於鑑定丹七片，複方丹參滴丸時記錄時間為55-65分鐘即可。
下面是本發明的部分試驗1.供試品溶液的製備取粉碎的丹參和三七適量，加入90％乙醇，浸泡，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加適量水繼續煎煮2h，濾過，合併濾液，減壓回收乙醇至幹，加70％甲醇溶解並轉移至容量瓶定容至刻度，微孔濾膜過濾，得供試品溶液(0.024g生藥/ml)。進樣10μl進行色譜分析。
2.HPLC色譜分析條件色譜柱碳十八烷基鍵合矽膠填料色譜柱(4.6×250mm ID，5μm)和預柱(4.6×12.5mm ID，5μm)；柱溫30℃；流動相，A為0.1％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％，採用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分鐘後梯度為55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；檢測波長203，281nm。記錄時間85min。
3色譜條件的選擇及結果3.1洗脫系統的選擇及結果本實驗對3種流動相系統進行了選擇(1)乙腈-水梯度洗脫；(2)乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脫；(3)乙腈-0.1％甲酸梯度洗脫。
結果表明，乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脫吸收峰數目多，峰形好，基線平穩，優於乙腈-0.1％甲酸，乙腈-水梯度洗脫系統。乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脫效果相當，0.1％磷酸濃度較低，對色譜柱的損耗小，故更優的是乙腈-0.1％磷酸梯度洗脫。
3.2洗脫梯度、柱溫、及流速的選擇及結果對5個洗脫梯度，柱溫(25-35℃)及流速進行考察。結果確定洗脫梯度0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B(流動相A為0.1％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％)。或者在55分鐘後梯度為55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。優選的柱溫30℃3.3檢測波長的確定丹七方提取液中三七的主要成分為三七皂苷類；丹參的主要成分為丹參酚酸類水溶性及丹參醌類脂溶性成分。根據這些成分的紫外吸收特徵，設置203，254，270，281和286nm五個波長對色譜條件進行考察，結果表明三七皂苷類成分只在203nm低波長處出峰；丹參化學成分在各波長均有不同吸收，281nm比254，270和286nm能更好的兼顧丹參水溶性及脂溶性成分。綜合考慮，選擇203nm和281nm兩個波長。
3.4丹七方供試品溶液製備的方法及結果本試驗對丹七方的工藝進行了優化，旨在使丹七方供試液能全面反映其有效成分，同時減少糖類、鞣質等雜質的幹擾。
供試液1取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入30ml水浸泡1h，煎煮2h，放冷，濾過，濾液於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液2取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入30ml水浸泡1h，煎煮2h，放冷，濾過，濾液於50℃減壓濃縮至2ml，加3倍量95％乙醇醇沉，冰箱靜置過液，濾過，濾液於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液3取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過，濾液於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液4取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入70％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過，藥渣繼續用70％乙醇提取1次，合併濾液，濾液於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液5取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加入50％乙醇10ml繼續提取1次，合併濾液，濾液於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液6取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加水30ml煎煮2h，放冷，濾過，濾液於50℃減壓濃縮至2ml，加3倍量95％乙醇醇沉，冰箱靜置過液，濾過，濾液同90％乙醇提取濾液合併，於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液7取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加水30ml煎煮2h，放冷，濾過，合併濾液，於50℃減壓濃縮至近幹，加50％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液8取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加水30ml煎煮2h，放冷，濾過，合併濾液，於50℃減壓濃縮至近幹，加60％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
供試液9取粉碎的丹參0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加水30ml煎煮2h，放冷，濾過，合併濾液，於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解並轉移至50ml容量瓶定容。
製備丹七方各供試品溶液，液相色譜儀自動進樣10μl進行色譜分析。結果表明單純水提，70％乙醇及90％乙醇提取均不能很好的兼顧丹七方水溶性及脂溶性成分；90％乙醇與水提取相結合比90％乙醇與50％乙醇提取相結合效果好，但水提部分經醇沉對原兒茶醛略有損失，故可不經過醇沉；樣品用70％甲醇溶解比用50％及60％甲醇溶解能更好的兼顧水溶性及脂溶性成分。綜上，選取最優的供試液9的製備工藝。
3.5檢測方法的方法學考察3.5.1供試品溶液穩定性及儀器精密度實驗按「1」項下方法製備丹七方供試品溶液，分別在0、2、4、12、18、24小時檢測指紋圖譜(見圖1-1，1-2)，考察丹七方供試品溶液的穩定性以及高效液相色譜儀的精密度。結果表明丹七方供試液在24小時內穩定，高效液相色譜儀的精密度也符合要求。
3.5.2供試品溶液測定的重複性實驗取同一批丹參及三七藥材粗粉(40目)，按「1」項下方法平行製備3份丹七方供試溶液，檢測HPLC指紋圖譜(見圖2-1，2-2)，考察丹七方的提取方法及指紋圖譜檢測方法的穩定性和重複性。結果表明丹七方供試液製備方法穩定可靠，具有很好的重現性。
3.5.3記錄時間的確定丹七方供試液在「2」項色譜條件下的2小時記錄圖和空白對照圖(見圖3-1，3-2)，考察最佳記錄時間。結果表明，80min以後基本無樣品中的成分，因而確定最佳記錄時間為85min。
3.5.4標準品對照實驗採用原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮IIA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1為參照物，精密稱定適量，用70％甲醇溶解，製成標準品溶液，記錄色譜圖(見圖4)。
結論通過對丹七方供試液製備方法，色譜條件選擇及色譜條件方法學研究，確定的現有丹七方色譜分析條件可滿足對丹七方中丹參和三七的多類活性成分的同時檢測與分析。
我們將此指紋圖譜條件進一步用於含有丹參和三七藥材的複方製劑的質量控制。具體如下1.複方丹參製劑的供試液製備取丹七片(去糖衣)、複方丹參片和複方丹參滴丸(去除薄膜衣)適量，研成粉末，用70％甲醇溶解並轉移到容量瓶中定容。超聲提取，放冷，加入70％甲醇補足重量。溶液過0.45μm濾膜，即得。
2.用本發明的指紋圖譜條件對複方丹參製劑的供試液進行HPLC-DAD色譜分析，即得複方丹參製劑指紋圖譜。
圖1-1供試品溶液穩定性及儀器精密度實驗色譜圖(203nm)，其中色譜圖WDQ00135～WDQ00140分別為0～24小時色譜1-2供試品溶液穩定性及儀器精密度實驗色譜圖(281nm)，其中色譜圖WDQ00135～WDQ00140分別為0～24小時色譜2-1供試品溶液測定的重複性實驗色譜圖(203nm)圖2-2供試品溶液測定的重複性實驗色譜圖(281nm)圖3-1記錄時間實驗的色譜圖(203nm其中WDQ00120為空白；WDQ00121為供試品)圖3-2記錄時間實驗的色譜圖(281nm其中WDQ00120為空白；WDQ00121為供試品)圖4標準品對照試驗的色譜5是實施例1中的丹七方指紋圖譜圖6是實施例2中市售丹七片的指紋圖譜圖7是實施例3中市售批號為040602的複方丹參片的指紋圖譜圖8是實施例3中市售批號為050308的複方丹參片的指紋圖譜圖9是實施例3中市售批號為03121024的複方丹參片的指紋圖譜圖10是實施例4中批號為20020921的複方丹參滴丸的指紋圖譜圖11是實施例4中批號為20030604的複方丹參滴丸的指紋圖譜圖12是實施例4中批號為20040303的複方丹參滴丸的指紋圖譜圖13是實施例5中丹七方的指紋圖譜。
圖14是實施例5中丹七片的指紋圖譜。
圖15是實施例5中複方丹參片的指紋圖譜。
圖16是實施例5中複方丹參滴丸的指紋圖譜。
圖17是實施例6中丹七片的指紋圖譜。
圖18是實施例6中複方丹參滴丸的指紋圖譜。
以上附圖中各數字表示的是1.原兒茶醛 2.三七皂苷R1 3.人參皂苷Rg1 4.丹酚酸B 5.人參皂苷Rb1 6.隱丹參酮 7.丹參酮IIA
具體實施例方式實施例11實驗材料1.1儀器與器材Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，包括G1312A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱，G1315A DAD檢測器，HP Chemstation色譜工作站(美國惠譜公司)；旋轉薄膜蒸發儀(瑞士Büchi公司)。
1.2試劑及試藥藥材丹參(陝西天士力植物藥業有限公司，陝西商洛)，經李萍教授鑑定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的乾燥根；三七(雲南文山)，經李萍教授鑑定為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的乾燥根。
2.實驗方法2.1色譜條件色譜柱C18色譜柱(ZORBAX ODS 4.6×250mm ID，5μm)和C18預柱(4.6×12.5mmID，5μm)；柱溫30℃；流動相，A為0.1％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％，採用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；檢測波長203，281nm。記錄時間85min。
2.2供試品溶液的製備取粉碎的丹參1.2g，三七1.2g，加入90％乙醇25ml，浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，濾過；藥渣加40ml水繼續煎煮2h，濾過，合併濾液，於50℃減壓回收乙醇至幹，加70％甲醇溶解並轉移至100ml容量瓶定容至刻度，微孔濾膜過濾，得供試品溶液。
3.實驗結果將供試品溶液進樣10μl進行色譜分析，即得丹七方指紋圖譜，記錄時間為85min。見圖5。
實施例2取市售丹七片(湖南安邦製藥有限責任公司，批號040803)20片，去糖衣並研磨成粉末，精密稱取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量。溶液過0.45μm濾膜。其它條件同實施例1。進樣10μl進行色譜分析，得丹七片HPLC-DAD指紋圖譜，見圖6。
實施例3取市售複方丹參片(廣東白雲山製藥廠，批號03121024；南京同仁堂製藥有限責任公司，批號040602；浙江胡慶餘堂製藥有限責任公司，批號050308)20片，研磨成粉未，精密稱取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量。溶液過0.45μm濾膜。其它條件同實施例1。進樣10μl進行色譜分析，得3個廠家複方丹參片HPLC-DAD指紋圖譜，見圖7-9。
實施例4取市售複方丹參滴丸(天津天士力製藥有限責任公司，批號20020921，20030604，20040303)75粒，精密稱定，研成粉未，去除薄膜衣，用70％甲醇溶解並轉移到25ml棕色容量瓶中定容。超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量。溶液過0.45μm濾膜。其它條件同實施例1。進樣10μl進行色譜分析，得3個批號複方丹參滴丸的HPLC-DAD指紋圖譜。見圖10-12。
實施例5用上述實施例同樣的方法，只是將洗脫梯度改為55分鐘後55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。分別對丹七方，丹七片，複方丹參片(廣東白雲山製藥廠，批號03121024)及複方丹參滴丸(天津天士力製藥有限責任公司，批號20020921)進行色譜分析，得指紋圖譜見圖13-16。
實施例6用實施例1、2、4的方法，只是記錄時間改為60分鐘，分別對丹七片和複方丹參滴丸(天津天士力製藥有限責任公司，批號20020921)進行色譜分析。得指紋圖譜見圖17-18。
綜上，本發明所建立的丹參和三七複方的HPLC-DAD指紋圖譜可用於同時檢測丹參中丹酚酸B等酚酸類水溶性成分和丹參酮IIA等二萜醌類脂溶性成分以及三七中皂苷類成分，方法可靠、穩定，可用於含有丹參和三七的複方製劑的質量控制。
權利要求
1.丹參和三七複方製劑的指紋圖譜鑑定方法包括建立標準的指紋圖譜、用相同方法測定待測樣品的指紋圖譜、將待測品的指紋圖譜與標準指紋圖譜對比，其特徵採用如下方法獲得指紋圖譜使用高效液相色譜儀，DAD檢測器，色譜工作站，將丹參和三七複方溶液，採用如下色譜條件色譜柱碳十八烷基鍵合矽膠填料色譜柱和預柱；柱溫25-35℃；流動相A為0.1-0.5％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％，採用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分鐘後梯度為55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B；流速1ml/min，在22～28分鐘時，流速為0.8ml/min；檢測波長203，281nm。
2.權利要求1的指紋圖譜鑑定方法，其中柱溫是30℃。
3.權利要求1的指紋圖譜鑑定方法，其中磷酸水的濃度為0.1％。
4.權利要求1的指紋圖譜鑑定方法，其中標準圖譜供試品溶液的製備方法是取粉碎的丹參和三七，加入85-95％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，濾過；藥渣加水煎煮，放冷，濾過，合併濾液，濃縮至近幹，加50-90％甲醇溶解，定容。
5.權利要求4的指紋圖譜鑑定方法，其中樣品的製備方法取粉碎的同樣份數的丹參和三七，加入6-12倍重量份數90％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，濾過；藥渣加水煮，加水量是藥渣重量的10-30倍，放冷，濾過，合併濾液，於50℃減壓濃縮至近幹，加70％甲醇溶解，定容。
6.權利要求1的指紋圖譜鑑定方法，其中待測樣品的製備方法為將待測樣品製劑去糖衣或去除薄膜衣，研成粉末，用70％甲醇溶解並定容，超聲提取，放冷，加入70％甲醇補足重量，過濾，即得。
7.權利要求1的指紋圖譜鑑定方法，液相色譜儀進樣量為10μl。
全文摘要
本發明涉及天然藥物的質量控制領域，具體為指紋圖譜領域，具體涉及丹參和三七複方的HPLC－DAD指紋圖譜鑑定方法。本發明可作為含有丹參和三七藥材的複方製劑如丹七片、複方丹參片及複方丹參滴丸等的質量控制指標之一。
文檔編號G01N33/15GK1806819SQ200510095180
公開日2006年7月26日 申請日期2005年11月2日 優先權日2005年11月2日
發明者李萍, 韋英傑, 李松林 申請人:中國藥科大學