蓽茇在製備抑制神經炎症的藥物中的應用的製作方法
2023-08-13 09:07:01 1
專利名稱：蓽茇在製備抑制神經炎症的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蓽茇或其提取物在製備抑制神經炎症的藥物中的應用，特別涉及蓽茇或其提取物在製備通過抑制神經炎症來治療中樞神經系統疾病的藥物中的應用。
背景技術：
免疫系統在維護組織穩態以及應對感染和傷害中起著重要的作用。小膠質細胞是中樞神經系統常駐免疫細胞，是單核吞噬細胞家族的成員之一，參與腦內的固有免疫反應。正常情況下小膠質細胞起免疫監視作用，通過簡單的吞飲起到清除代謝產物，維護組織穩定的淨化作用。在正常的生理條件下，大腦被認為是免疫豁免的。實際上，抗原呈遞被主動抑制，小膠質細胞維持在靜息狀態，而免疫組分被血腦屏障排除在大腦之外。然而，神經損傷或有毒物質的存在，會刺激免疫細胞促炎症介質的釋放，這些促炎性介質誘發了神經炎症反應。當神經炎症在適當的時機以適當的程度出現時，它可以解除誘發刺激，並恢復大腦的穩態和功能。有益的急性神經炎症反應可修復已有的損害，並將進一步損傷降至最低。然而如果小膠質細胞發生了持續的過度激活，那麼促炎症因子(如TNF-α，IL-I β和PGE2)的長時間無調控釋放創建了一個不利的神經毒性環境，損害了神經元，並損傷了大腦的正常功能(Block M. L. and Hong J. S. Microgliaand inflammation-mediated neurodegeneration!multiple triggers with a commonmechanism. Prog. Neurobiolj 2005，76:77 - 98.)。近十多年來，臨床研究和動物實驗的證據說明了腦內神經炎症與多種中樞神經系統疾病密切相關，如帕金森病(Parkinson』 s disease, H))、阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)、多發性硬化(multiple sclerosis, MS)、痛癇(epilepsy)和腦缺血(cerebral ischemia)等(Zipp F，Aktas 0. The brain as a target ofinflammation:common pathways link inflammatory and neurodegenerative diseases.Trends Neurosci，2006，29:518 - 527)。中樞神經系統疾病往往伴有神經元細胞的大量壞死以及凋亡，而這些壞死病灶周圍聚集大量活化的小膠質細胞，並且可以檢測到其分泌的各種免疫因子和細胞毒因子，包括花生四烯酸代謝產物前列腺素E2 (prostaglandinE2，PGE2X 細胞因子(cytokine)、炎性趨化因子(inflammatory chemokines)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、活性氧自由基(reactive oxygen species，R0S)和興奮性胺基酸如穀氨酸等(Brown GC，Bal-Price A. Inflammatory neurodegeneration mediated bynitric oxide, glutamate, and mitochondria. Mol Neurobiolj 2003，27:325-355)，它們對周圍神經元的存亡起著決定性的作用，更為重要的是這些因子之間相互作用和相互調節，當它們過度產生時，彼此擴大各自的毒性，最終導致神經元的損傷、變性甚至死亡(BlockML,Zecca Lj Hong JS. Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecularmechanisms. Nat Rev Neuroscij 2007, 8: 57 - 69) □因此小膠質細胞介導的炎症反應在中樞神經系統疾病的病情進程中的作用逐漸被人們所重視。所以針對神經炎症尋找能夠抑制小膠質細胞激活、阻斷神經毒性物質釋放的藥物為治療中樞神經系統疾病提供了一個富有吸引力的藥物研發方向(Klegeris A, McGeer EG, McGeer PL. Therapeutic approaches toinflammation in neurodegenerative disease. Curr Opin Neurol, 2007，20:351 - 357)。蓽茇是中、蒙、藏醫習慣用藥，味辛、性熱，臨床用於治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、寒瀉、嘔吐等症狀。蓽茇中含有豐富的生物鹼、醯胺類、木脂素類、萜類、甾醇類及其它類的化合物，其中生物鹼和醯胺類約35種，尤其是胡椒鹼的含量不少於2. 5%。目前文獻中還未見報導蓽茇提取物及胡椒鹼可以抑制神經炎症，並據此對中樞神經系統疾病治療方面的相關研究。
發明內容
本發明的目的在於提供蓽茇或其提取物在製備抑制神經炎症的藥物中的應用。並提供蓽茇或其提取物在製備通過抑制神經炎症來治療中樞神經系統疾病的藥物中的應用。本發明還提供蓽茇或其提取物在製備抑制小膠質細胞激活作用的藥物中的應用。本發明還提供蓽茇或其提取物在製備減輕多巴胺神經元損傷的藥物中的應用。其中，蓽茇提取物是以醇為提取液進行提取獲得的提取物，蓽茇提取物的製備方法，包括如下步驟I)取蓽茇乾燥果實，用重量是所述蓽茇乾燥果實的8-10倍的70-95% (是體積百分比)乙醇水溶液作為提取劑對所述蓽茇乾燥果實進行提取，得到提取液；2)將步驟I)得到的提取液濃縮成相對密度為1-1. I的濃縮液；3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心後的上清液經過DlOl大孔吸附樹脂柱吸附；4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的DlOl大孔吸附樹脂柱用5_15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，5)將步驟4)洗脫過的DlOl大孔吸附樹脂柱用10_20倍柱體積的60_70%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，即得到蓽茇提取物。在步驟I)中，為了提取充分，蓽茇乾燥果實可以先粉碎，再提取，上述提取的次數可以為3次，所述提取劑是85% (體積百分比)的乙醇水溶液。在步驟2)中，所述濃縮是在50_70°C下減壓濃縮，優選是在60°C、真空度0. OlPa下濃縮；所述濃縮液的相對密度是I. 08。在步驟3 )中，所述稀釋是指將步驟2 )的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水後的總重量與所述蓽茇乾燥果實質量的比例是I: I ;所述離心是1000g-2000g下，離心10分鐘。在步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5 )中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優選是20倍柱體積的70 %乙醇水溶液洗脫。所述步驟5)得到第3至20個柱體積的洗脫液後，可進行乾燥，乾燥的步驟如下將收集的洗脫液減壓濃縮，然後真空冷凍乾燥。本發明還提供一種藥物，其有效成分為上述蓽茇提取物；所述藥物為抑制神經炎·症和/或抑制小膠質細胞激活作用和/或減輕多巴胺神經元損傷和/或治療中樞神經系統疾病的藥物。
上述抑制神經炎症和/或抑制小膠質細胞激活作用和/或減輕多巴胺神經元損傷和/或治療中樞神經系統疾病的藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、黏膜組織；或是被其他物質混合或包裹後導入機體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。上述藥物可以製成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。本發明採用的細胞模型是小膠質細胞激活模型，是100ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)對BV2細胞系形成的細胞模型。實驗證明加入LPS (終濃度100ng/ml)和蓽茇提取物(終濃度O. 25mg/ml)共培養24h，蓽茇提取物能夠顯著減輕LPS引起的BV2細胞激活，降低細胞內環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, C0X-2)的蛋白水平，減少炎症因子前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)的釋放。為進一步確定蓽茇提取物抑制小膠質細胞活化的作用機制，通過對NF- K B信號通路的研究，蓽茇提取物能夠通過抑制LPS引起的I K B降解，從而減輕核轉錄因子NF- K B的p65亞基核轉位水平，進而減少炎症相關基因的表達。為進一步確定蓽茇提取物通過抑制神經炎症來起到神經保護作用，又採用小鼠炎症動物模型。上述小鼠炎症動物模型是通過對C57小鼠腹腔注射5mg/kg的LPS形成的動物模型。蓽茇提取物治療組是C57小鼠腹腔注射LPS後2h進行120mg/kg的蓽茇提取物灌胃給藥，之後7d持續給藥、每日給藥I次。實驗證明通過觀察對小膠質細胞標誌物CDlIb的免疫染色，發現蓽茇提取物E能夠減輕LPS引起的中腦黑質部位小膠質細胞的激活；通過對多巴胺能神經元特異性標誌物酪氨酸輕化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的免疫染色及蛋白免疫印跡方法檢測,蓽發提取物對抗LPS引起的免疫炎症損傷的神經保護藥效與LPS模型組有顯著性差異。上述實驗表明，蓽茇提取物可以抑制神經炎症、抑制小膠質細胞的激活作用，保護多巴胺能神經元，從而可以通過抑制神經炎症來治療中樞神經系統疾病。
圖I為實施例I製備的蓽茇提取物的HPLC的圖譜。圖2為不同藥物處理BV2細胞系進行細胞形態學觀察來檢測蓽茇提取物抑制小膠質細胞激活的藥效。圖3為BV2細胞NADPH氧化酶p67及MHC II類分子0X-6的表達情況。圖示為不同藥物處理BV2細胞24h，進行免疫螢光染色p67和0X-6。圖4為在BV2細胞系中藥物處理24h後，C0X-2的表達情況及PGE2釋放水平。圖示為不同藥物處理BV2細胞24h，通過免疫螢光染色和Western blot方法檢測C0X-2蛋白水平的變化情況，收集細胞上清通過ELISA法檢測PGE2釋放水平。**代表與Control組相比，Ρ〈0· 001 ；#代表與LPS模型組相比，Ρ〈0· 05。
圖5為在BV2細胞系中藥物處理Ih後，I K B及NF- K B亞基p65蛋白水平變化情況。圖示為不同藥物處理BV2細胞lh，通過免疫螢光染色檢測I K B、p65蛋白水平的變化情況，通過突光強度分析p65的核轉位情況；通過Western blot方法檢測I κ B蛋白水平的變化情況。**代表與Control組相比，P〈0. 001 ；#代表與LPS模型組相比，P〈0. 05 ；##代表與LPS模型組相比，P〈0. 001。圖6為在小鼠炎症模型中7d進行中腦黑質部位小膠質細胞表面標誌物CDllb免
疫組化結果。圖7為在小鼠炎症模型中7d進行中腦黑質部位多巴胺能神經元標誌物TH免疫組化結果，及中腦黑質紋狀體部位TH蛋白含量的水平。**代表與Control組相比，P〈0. 001 ；##代表與LPS模型組相比，P〈0. 001。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中使用的細胞系如下小膠質瘤細胞系BV2是小鼠源的小膠質瘤細胞系，購自中國協和醫科大學基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心(3111C0001CCC000063)。 下述實施例中的試驗方法如下I.蛋白免疫印跡 Western blotI. I蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠電泳(I)在Bio-Rad公司的灌膠模具上組裝gel sandwich,把用75%酒精擦乾淨的兩玻璃板和中間I. Omm厚的隔板的下緣處於同一直線上，組裝嚴密以防漏膠；(2)按下表I中SDS-PAGE分離膠配方，製成10%的分離膠；表I. SDS-PAGE分離膠配方
ItMio%分離膠
H2O(Inl)4
~I. 5M Tri s-HCl, pH 8. 8 (ml)H
30% (g/ml) polyacrylamide (ml)3. 3
~10%SDS( μ I)100
~10%APS( μ I)100
TEMED(μ I)5 7(3)立即將分離膠注入膠槽的兩玻璃板之間，後注入去離子水，室溫靜置45-60min,使膠聚合；(4)待分離膠聚合後，吸出上層無離子水，並用濾紙吸乾殘餘水分；並再用無離子水洗凝膠頂部數次，以去除可能未完全聚合的丙烯醯胺，最後濾紙吸乾殘餘水分；(5)按下表2中SDS-PAGE濃縮膠配方，製成5%的濃縮膠； 表2. SDS-PAGE濃縮膠配方
權利要求
1.蓽茇或其提取物在製備抑制神經炎症的藥物中的應用。
2.蓽茇或其提取物在製備抑制小膠質細胞激活作用的藥物中的應用。
3.蓽茇或其提取物在製備減輕多巴胺神經元損傷的藥物中的應用。
4.蓽茇或其提取物在製備治療中樞神經系統疾病的藥物中的應用。
5.根據權利要求1-4中所述的應用，其特徵在於所述蓽茇提取物是以醇為提取液進行提取獲得的提取物。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述蓽茇提取物的製備方法，包括如下步驟 1)取蓽茇乾燥果實，用重量是所述蓽茇乾燥果實的8-10倍的體積百分比是70-95%的乙醇水溶液作為提取劑對所述蓽茇乾燥果實進行提取，得到提取液； 2)將步驟I)得到的提取液濃縮成相對密度為1-1.I的濃縮液； 3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心後的上清液經過DlOl大孔吸附樹脂柱吸附； 4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的DlOl大孔吸附樹脂柱用5-15倍柱體積的體積百分比是10-20%的乙醇水溶液洗脫，將洗脫過的DlOl大孔吸附樹脂柱用10-20倍柱體積的體積百分比是60-70%的乙醇水溶液洗脫，收集第3至20個柱體積的洗脫液，即得到來自蓽茇的提取物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述蓽茇提取物的製備方法中 步驟I)中，所述提取的次數為3次，所述提取劑是體積百分比是85%的乙醇水溶液； 步驟2)中，所述濃縮是在50-70°C下減壓濃縮，優選是在60°C、真空度O. OlPa下濃縮；所述濃縮液的相對密度是I. 08。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述蓽茇提取物的製備方法中步驟3)中，所述稀釋是指將步驟2)的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水後的總重量與所述蓽茇乾燥果實質量的比例是1:1 ;所述離心是在1000g-2000g下，離心10分鐘。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述蓽茇提取物的製備方法中步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5)中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優選是20倍柱體積的70%乙醇水溶液洗脫。
10.一種藥物，其有效成分為權利要求5-9中任意一項所述的蓽茇提取物；所述藥物為抑制神經炎症和/或抑制小膠質細胞激活作用和/或減輕多巴胺神經元損傷和/或治療中樞神經系統疾病的藥物。
全文摘要
本發明公開了蓽茇或其提取物在抑制神經炎症的藥物中的應用。所述蓽茇提取物是以醇為提取液進行提取獲得的提取物。實驗證明，蓽茇或其提取物可以抑制小膠質細胞激活，減輕神經炎症的發生，從而達到治療中樞神經系統疾病的效果。
文檔編號A61K36/67GK102908401SQ20121035676
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者楊慧, 吳霞, 曲鵬程, 段春禮, 魯鈴鈴, 張建亮 申請人:首都醫科大學