一種檢測神經細胞電信號的裝置的製作方法
2023-08-13 22:07:46 1
專利名稱：一種檢測神經細胞電信號的裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及檢測神經細胞電信號的裝置，特別涉及微電極陣列傳感器檢測神
經細胞電信號的裝置。
背景技術：
神經電信號的分析是目前神經信息學的研究的主要內容之一。現在比較常用的裝置是微電極陣列傳感器(Micro-Electrode Array, MEA) 。 MEA由嵌在基底物質上的微電極組成。微電極主要由金屬材料例如鉑，金，鈦氮化物和銦錫氧化物等構成。微電極在基底物質(通常是玻璃)上排成陣列。微電極與用金或透明的銦錫氧化物製成的導線相連，導線將微電極信號傳送到外部的放大器，或將外部施加的剌激傳送到微電極。在MEA設備中，被試細胞或組織直接在電極塗層物質上培養，可以允許測量到細胞外直接相鄰的局部電變化，同時並行記錄多個細胞的電生理信號。基於體外MEA技術的神經生物學的研究有兩個突出優點，一是可以同時記錄和剌激不同位點，二是非侵入式不會損傷細胞。所以MEA適用於在同一個培養樣本上進行長時程記錄，因而允許監視培養物對剌激的響應的較長時間的演變。但是現有MEA技術存在一個固有的瓶頸無法使細胞定向生長，在體外培養的神經細胞的突觸連接是隨機的，跟實際生物體中突觸的連接有很大不同，而且每一次體外培養，神經細胞的連接也是不同的。而每個神經元發放的電信號與這個神經元和周圍神經元的連接方式有很大關係。現有的這種體外隨機連接方式不僅讓神經生理的實驗無法具有精確的重複性，而且無法得到神經細胞連接的拓撲結構與神經信號對應關係。
實用新型內容本實用新型所要解決的技術問題是提供一種可控制神經細胞生長的圖案並獲得其電信號的檢測神經細胞電信號的裝置。 為了克服現有技術中體外培養的神經細胞隨機連接這個缺點，本實用新型檢測神經細胞電信號的裝置通過在各微室之間設置連通的微通道，使得在MEA上培養的細胞可以按照特定的方式連接，通過MEA的微電極記錄細胞的電信號，這樣可檢測到特定連接方式下的細胞的電信號，得到細胞電信號與其連接方式的關係。微室與微通道的排列方式可以根據生物體中的神經細胞和神經突觸的連接方式設置，這樣培養在該裝置上的神經細胞構成的網絡將可以模擬實際生物體內的神經網絡，因此檢測到的神經電信號與生物體內真實的神經電信號接近，從而檢測到的神經電信號會包含大量的生物學信息。微室與微通道的排列方式也可以按照人們想創造的神經網絡的連接方式設置，這樣培養在本裝置上的神經細胞就可以按照人們需要的連接方式連接，從而可以得到人工神經網絡，MEA的微電極可以將這個人工神經網絡的電信號檢測出來。 為了解決上述技術問題，本實用新型的技術方案如下 本實用新型檢測神經細胞電信號的裝置主要包括微電極陣列傳感器和細胞生長室，所述微電極陣列傳感器包括基底、設於所述基底上的大微電極和小微電極，所述細胞生長室固定在微電極陣列傳感器的基底上，所述細胞生長室包括兩個以上的敞口微室和對應的微通道，所述微電極陣列傳感器上的大微電極對應地置於所述微室內，相鄰的兩個微室內的大微電極之間由對應的微通道連通，所述微電極陣列傳感器上的小微電極對應地置於所述微通道內。 進一步地，本實用新型所述微室沿寬度方向置有一個大微電極，在所述微室內沿著微室的長度方向置有兩個以上大微電極，所述相鄰的兩個微室之間沿長度方向有兩個以上微通道，所述各微通道的寬度為僅容納一條神經突觸。 進一步地，本實用新型每個微室內僅置有一個大微電極，相鄰的兩個微室之間有一個微通道，所述微通道的寬度為僅容納一條神經突觸。 與現有技術相比，本實用新型的優點是(l)由於本實用新型設有微室和微通道，使得體外培養的神經細胞在微室和微通道內，按照微室和微通道的排列方式進行定向生長；(2)微室與微通道的排列方式可以根據生物體中的神經細胞和神經突觸的連接方式設置，這樣培養在該裝置上的神經細胞構成的網絡將可以模擬實際生物體內的神經網絡，通過微室與微通道內的微電極檢測到神經電信號，因此檢測到的神經電信號與生物體內真實的神經電信號接近，從而檢測到的神經電信號會包含大量的生物學信息。(3)微室與微通道的排列方式也可以按照人們想創造的神經網絡的連接方式設置，這樣培養在本裝置上的神經細胞就可以按照人們需要的連接方式連接，從而可以得到人工神經網絡，微電極可以將這個人工神經網絡的電信號檢測出來。
圖1是本實用新型檢測細胞電信號裝置的第一種實施方式的結構示意圖； 圖2是圖1的A-A剖視圖； 圖3是本實用新型檢測細胞電信號裝置的第二種實施方式的結構示意圖； 圖4是圖3的A-A剖視圖； 圖5刻有微通道圖案的掩膜的結構示意圖； 圖6是本實用新型在製作細胞生長室過程中光刻膠與掩膜覆蓋於矽基底上時的結構示意圖； 圖7是本實用新型光刻膠微通道固定於矽基底上的結構示意圖； 圖8是本實用新型光刻膠微室與微通道位於矽基底上時的結構示意圖； 圖9是本實用新型PDMS澆注在光刻膠模具上的結構示意圖； 圖10是脫模PDMS腔壁的結構示意圖； 圖11是本實用新型微電極陣列傳感器的結構示意圖； 圖12是圖11的俯視圖。
具體實施方式圖l和圖2示出了本實用新型檢測細胞電信號裝置的第一種實施方式的結構。該檢測神經細胞電信號的裝置包括微電極陣列傳感器和細胞生長室。微電極陣列傳感器包括基底l，在基底1上設有大微電極和小微電極；細胞生長室固定在基底1上。細胞生長室包括第一微室51、第二微室52、第三微室53和第一微通道7、第二微通道6。其中，第一微室51、第二微室52和第三微室53的上方均為敞口狀。第一微室51、第二微室52和第三微室53平行排列。各微室之間通過腔壁46隔離。微電極陣列傳感器上的大微電極對應地置於微室內，具體地說，可在第一微室51內沿著其長度方向a置有三個大微電極54，在第二微室52內沿著其長度a的方向置有三個大微電極55，在第三微室53內沿著其長度a的方向置有三個大微電極56。第一微室51內的大微電極和與第一微室51相鄰的第二微室52內的大微電極之間對應地通過三個第一微通道7連通，第二微室52的大微電極和與第二微室52相鄰的第三微室53的大微電極之間對應地通過三個第二微通道6連通。圖1隻示出了分別在第一微室51和第二微室52內且處於同一水平線上的大微電極之間由第一微通道7連通的結構形式。事實上，本實用新型可以通過第一微通道7將第一微室51內的任一大微電極與第二微室52內的任一大微電極連通，但各微通道之間不應交叉。同樣，圖1隻示出了分別在第二微室52和第三微室53內且處於同一水平線上的大微電極之間由第二微通道6連通的結構形式。而本實用新型也可以通過第二微通道6將第二微室52內的任一大微電極與第三微室53內的任一大微電極連通，各微通道之間不交叉。微電極陣列傳感器上的小微電極對應地置於微通道內，在各第一微通道7和第二微通道6內，沿著微通道長度c的方向，每個微通道內均可置有兩個小微電極3。 各第一微通道7和各第二微通道6的寬度d為僅夠容納一條神經突觸。這樣做的目的是一條神經突觸上的電信號僅被一個微通道中的小微電極檢測到，一個微通道中的小微電極僅能檢測到一條神經突觸的電信號，從而使得微通道中的小微電極檢測到的電信號與神經突觸形成一一對應關係。 小微電極3的直徑與所要檢測的神經突觸的直徑相等或者略小於神經突觸直徑，這是為了既使小微電極能構完全位於微通道中，又能檢測到神經突觸的電信號。否則，若小微電極過小，會導致小微電極與神經突觸可能不接觸，從而檢測不到神經突觸的電信號。[0025] 大微電極的直徑約為所要檢測的神經細胞的直徑，這樣做的目的是既使大微電極能構完全位於微室中，又能檢測到神經細胞的電信號。否則，若大微電極過小，只能檢測到神經細胞部分表面上的電信號。 圖3和圖4示出了本實用新型檢測細胞電信號裝置的第二種實施方式的結構。該檢測神經細胞電信號的裝置包括微電極陣列傳感器和細胞生長室。微電極陣列傳感器包括基底l，在基底1上設有大微電極和小微電極；細胞生長室固定在基底1上。在該實施方式中，細胞生長室包括九個微室和二十四個微通道，九個微室在基底1上排列成三排三列的陣列，其中每個微室的上方均為敞口。微室之間通過腔壁46隔離。相鄰的兩個微室之間通過一個微通道連通。具體地說，例如，第一微室10和第二微室11通過第一微通道15連通，第二微室1與第四微室12通過第二微通道16連通，第四微室12和第三微室9通過第三微通道17連通，第三微室9與第一微室10通過第四微通道14連通，其它微室之間的連接與此類似。除了圖3已示出的微室之間微通道的連接方式外，本實用新型還可以選擇在第一微室10和第四微室12之間連通有微通道，或者是在第三微室9和第二微室11之間連通有微通道(未在圖中示出)，但各微通道之間不應交叉。 如圖3所示，微電極陣列傳感器上的大微電極18對應地置於微室內，微電極陣列傳感器上的小微電極19對應地置於微通道內。具體地說，每個微室內置有一個大微電極18，每個微通道內沿著長度e方向可置有兩個小微電極19。[0028] 每個微室的大小為僅容納一個神經細胞。微室的大小可略大於一個神經細胞的大 小，但不能過大，否則一些較短的神經突觸可能伸不進微通道內。 每個微通道的寬度f為僅容納一條神經突觸。這樣做的目的是一條神經突觸上的 電信號僅被一個微通道中的小微電極檢測到，一個微通道中的小微電極僅能檢測到一條神經 突觸的電信號，使得微通道中的小微電極檢測到的電信號與神經突觸形成一一對應關係。 大微電極18的直徑約為所要檢測的神經細胞的直徑，這樣做的目的是既使大微 電極18能構完全位於微室中，又能檢測到神經細胞的電信號，否則，若大微電極18過小，只 能檢測到神經細胞部分表面上的電信號。 小微電極19的直徑與所要檢測的神經突觸的直徑相等或者略小於神經突觸直 徑，這是為了既使小微電極能構完全位於微通道中，又能檢測到神經突觸的電信號，否則， 若小微電極過小，會導致小微電極與神經突觸可能不接觸，從而檢測不到神經突觸的電信號。 以上是本實用新型的兩種實施方式，在應用中，可根據所要檢測的細胞的數量設 置微室的數量；根據生物體中不同的神經細胞排列和連接的方式設置微室和微通道的排列 方式，從而在本實用新型裝置上培養的神經細胞的連接方式可以模擬生物體中的神經細胞 的連接方式，因此培養在本裝置上的神經細胞的電信號與生物體中的神經細胞的電信號類 似，測到的電信號攜帶了更多生物學信息；也可以按照想要創造的人工神經網絡的連接方 式設置微室與微通道的排列方式，從而本裝置上培養的細胞就會連接成想要的人工神經網 絡，通過MEA的微電極檢測得到人工神經網絡的電信號。 下面給出本實用新型第二種實施方式的製備方法。 —、細胞生長室的製備 (1)用CAD軟體設計出需要的圖案，如圖5所示，製作出有微通道圖案23的掩膜 20。 (2)矽基底準備。將矽片放入Piranha溶液(16%濃硫酸30%雙氧水=7 : 3) 煮沸清洗15min，用去離子水衝洗5遍後用氮氣吹乾，並在20(TC熱板上烘焙30min，如圖6 所示，製成矽基底22。 (3)甩塗。甩塗第一層光刻膠21，如圖6所示，將光刻膠SU-85膠21倒在矽基底
22中央，用手握住矽片邊緣使之傾斜並緩慢旋轉，使SU-85膠21覆蓋住矽基底22大部分區
域。靜置15min，使SU-85膠21初步平坦化，同時消除掉傾倒過程中產生的氣泡。用旋塗機
以4000rpm的速度甩塗60秒，使膠分布較為均勻，厚度大約為3 y m，靜置10min。 (4)軟烘。將甩塗有光刻膠21的矽基底22放在熱板上，以5°C /min的速率由室
溫逐步升到13。C，期間在65。C和13。C分別保持3min和6min。之後以0. 5°C /min的速率緩
慢降至室溫。 (5)曝光。將刻有圖案23的第一層掩膜20覆蓋在光刻膠21的表面，如圖6所示， 然後曝光。採用I線接觸式曝光機(波長365nm)。如圖7所示，製作出光刻膠微通道24模 具。光刻膠21在曝光後留下的部分即形成光刻膠微通道24。 (6)PEB(Post E鄧osure Bake，曝光後烘)烘焙。將上述模具置於熱板上，以5°C / min的速率由室溫逐步升到13°C ，期間在65°C和13°C分別保持lmin和5min。之後以0. 5°C / min的速率緩慢降至室溫。[0041] (7)製作掩膜。用CAD軟體設計出需要的圖案，製作出微室的掩膜。 (8)甩塗第二層光刻膠。SU-850光刻膠作為第二層光刻膠，以1000rpm的速度在
有微通道的矽基底上甩塗60秒。 (9)軟烘。
(10)曝光。將刻有微室圖案的第二層掩膜與第一層光刻圖形對準，第二次曝光，如
圖8所示，製作出光刻膠微室25模具。由於第一層光刻膠和第二層光刻膠的材料不同，調
整曝光時間和光源波長，可保證此次曝光不損壞已經製作出的微通道。 (ll)PEB(Post Exposure Bake，曝光後烘)烘焙。將上述光刻膠模具進行PEB烘
焙，具體方法同步驟6。 (12)顯影。顯影在通風櫥中進行，顯影液的主要成分是PGMEA。在光刻膠模具與 顯影液分別靜置達到室溫後，將模具放入顯影液中顯影6min，光刻膠的非感光區溶解於顯 影液中，之後分別用異丙醇和去離子水清洗乾淨，並用氮氣吹乾。 (13)硬烘。將上述光刻膠模具置於熱板上，緩慢加熱到200°C ，保持30min，再緩慢
降溫至室溫。 (14)PDMS澆注。按照PDMS預聚體(Sylgard184矽橡膠)和PDMS固化劑(3-環氧 丙氧丙基三甲氧基矽烷)的比例為10 : l，稱量PDMS預聚體6. 5克，P匿S固化劑0. 65克 置於試管中，混合均勻。分別用低真空抽30分鐘，高真空抽15分鐘，至無氣泡生成為止。將 混合液體緩慢澆注於光刻膠模具上，在7(TC的環境下靜置一小時使之固化，形成如圖9所 示的PDMS腔壁46，腔壁46中有光刻膠微室24和光刻膠微通道25。 (15)脫模處理。將上述PDMS腔壁從光刻膠模具上剝離，這樣，光刻膠模具上的圖 案就完好地轉移到PDMS腔壁上，在PDMS腔壁中形成了微室和微通道，如圖10。沿著圖10 虛線處切割PDMS腔壁，使微室的開口暴露出來，成為敞口的微室，即形成細胞生長室，"敞 口"的目的是為了細胞可以放入。 二、定製的MEA 電極的位點和大小如圖11和圖12所示。大微電極18和小微電極19的排列方式
對應微室和微通道的排列方式。 三、細胞生長室與MEA的封裝 將MEA水平放置，將細胞生長室的下端粘合在MEA的基底1表面，封裝過程中要保 證微室和微通道覆蓋微電極陣列傳感器上的對應電極。覆蓋是指電極完全位於微室或微通 道的下方而沒有暴露出來。最終完成品如圖3和圖4。 四、本實用新型裝置的工作過程 將不同的神經細胞培養在不同的微室內的大微電極上，幾天以後每個細胞的突觸 將沿著微通道生長，在微通道內連接起來，形成了定向生長的神經網絡，這時可以通過微電 極將神經細胞電信號檢測出來。
權利要求一種檢測神經細胞電信號的裝置，其特徵是它包括微電極陣列傳感器和細胞生長室，所述微電極陣列傳感器包括基底、設於所述基底上的大微電極和小微電極，所述細胞生長室固定在微電極陣列傳感器的基底上，所述細胞生長室包括兩個以上的敞口微室和對應的微通道，所述微電極陣列傳感器上的大微電極對應地置於所述微室內，相鄰的兩個微室內的大微電極之間由對應的微通道連通，所述微電極陣列傳感器上的小微電極對應地置於所述微通道內。
2. 根據權利要求1所述的一種檢測神經細胞電信號的裝置，其特徵是所述微室沿寬度方向置有一個大微電極，在所述微室內沿著微室的長度方向置有兩個以上大微電極，所述相鄰的兩個微室之間沿長度方向有兩個以上微通道，所述各微通道的寬度為僅容納一條神經突觸。
3. 根據權利要求1所述的一種檢測神經細胞電信號的裝置，其特徵是每個微室內僅置有一個大微電極，相鄰的兩個微室之間有一個微通道，所述微通道的寬度為僅容納一條神經突觸。
專利摘要本實用新型公開了一種可控制神經細胞生長的圖案並獲得其電信號的檢測神經細胞電信號的裝置。它主要包括微電極陣列傳感器和細胞生長室，微電極陣列傳感器包括基底、設於基底上的大微電極和小微電極，細胞生長室固定在微電極陣列傳感器的基底上，細胞生長室包括兩個以上的敞口微室和對應的微通道，微電極陣列傳感器上的大微電極對應地置於微室內，相鄰的兩個微室內的大微電極之間由對應的微通道連通，微電極陣列傳感器上的小微電極對應地置於微通道內。本實用新型使得體外培養的神經細胞可按照微室和微通道的排列方式進行定向生長，可得到與生物體內神經細胞接近的神經電信號，或得到人們需要的連接方式的人工神經網絡的電信號。
文檔編號C12M1/34GK201488996SQ2009201907
公開日2010年5月26日 申請日期2009年8月6日 優先權日2009年8月6日
發明者劉軍, 劉峰, 葉學松, 李一喬, 王鵬, 高天昀 申請人:浙江大學