一種腸道致病菌的快速檢測方法
2023-08-13 22:01:36
專利名稱：一種腸道致病菌的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及細菌檢測技術，且特別涉及一種腸道致病菌的快速檢測方法。
背景技術：
腸道傳染病是全球性重要公共衛生問題之一，亞、非、拉地區尤為嚴重。根據WHO的資料，上述地區5歲以下兒童每年因腸道傳染病死亡者約500萬以上，發病約7.5億～10億人次。即使在經濟發達的國家和地區也存在上述問題，例如美國、日本等國出血性大腸桿菌O157H7腸炎的嚴重流行即可說明這一事實。我國是發展中國家，衛生基礎薄弱，經濟、文化等尚不發達，加以幅員遼闊，人口眾多，各地差別大而發展又不平衡，從而給腸道傳染病的預防和控制帶來一定困難。由於腸道傳染病是導致兒童營養不良、生長發育障礙和成人勞動力大量損失的重要因素之一，因而直接危害人民健康和社會經濟的可持續發展，必須引起足夠的重視(魏承毓.我國腸道傳染病的基本狀況與防制對策.中國公共衛生，2004.1，20(1))。
目前對腸道致病菌引起的疾病的通用檢測方法是先挑取少量糞便樣品平板劃線分離單菌落，再挑取單菌落進行二次培養，最後用生化鑑定和對O抗原和H抗原(主要是O抗原)的抗血清凝集反應鑑定所感染的細菌種類。此法的缺點在於靈敏度低，耗時長，漏檢率高，而且世界上沒有任何國家生產全套用於鑑定的抗血清。因此急需使用更快速、準確、可靠的方法檢測腸道重要致病菌。
其中PCR技術和生物晶片技術是目前較好的檢測腸道致病菌的方法。PCR技術本身的優越性無可厚非，自1989年開始被應用於臨床檢驗以來，以其快速、簡便、靈敏等優點很快地成為臨床實驗診斷學的一個技術熱點。而自1997年7月Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人發明了以生物晶片技術對微生物進行定種和表型分析的方法(第6,228,575號美國專利)以來，其因具有敏感度高、特異性強、大規模集成化、自動化、操作簡便快捷、效率高等特點，而受到科研人員的青睞。
但上述兩種方法目前尚無法用於臨床診斷，這是因為在檢測過程中，對糞便樣品處理主要存在兩方面的難點，其一是糞便樣品乾重的1/3為各種腸道內正常菌群，細菌的數量龐大，種類繁多，從大量的正常菌群中檢測致病菌難度大；其二是糞便樣品中的各種食物殘渣中含有膽鹽、膽紅素、尿膽素原、多聚糖等多種PCR抑制物，使得從糞便樣品中提取的DNA無法直接用PCR等方法檢測(Sandrina Stacy-phipps.1995.Multiplex PCRassay and simple preparation method for stool specimens detectEnterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection.J.Clin.Microbiol.331054-1059)。所以，目前還沒有從糞便中提取可用於PCR和生物晶片檢測的致病菌DNA的可靠方法。
目前對糞便的處理主要有以下幾種方法1)用特定試劑使糞便樣品中菌體DNA釋放出來。這種方法因糞便樣品成分複雜，使提取出的DNA雜質含量高，導致檢測的靈敏度低、特異性差、錯誤率高。
2)用一定的試劑處理糞便樣品後再將處理液過純化、分離柱，以此得到較純DNA。此方法因需要大量的純化、分離柱，一方面，導致費用較高；另一方面，樣品在過柱時損失較大，導致檢測靈敏度低、漏檢率高。
3)通過對傳統方法的適當改進來提取糞便樣品中DNA。此方法一般都存在靈敏度低，特異性差，漏檢率高的情況。
綜上所述，有必要發明出一種經過改進的糞便樣品處理方法，利用該方法可快速、可靠地提取到用於PCR或基因晶片等快速檢測腸道致病菌技術所需的DNA。
發明內容
鑑於上述情況，本發明的目的是提供一種快速處理糞便樣品的方法，以利於後續DNA提取工作的進行，使其適應腸道致病菌的快速檢測。
為了達到上述目的，本發明提出一種使糞便樣品中的腸道重要致病菌迅速增殖，從而快速、可靠得檢測出腸道致病菌種類的方法，該方法包括下列步驟步驟一，取欲檢測的糞便樣品，以無菌操作將其轉入至少20ml腸道致病菌所用的培養基中，室溫培養至少5小時；步驟二，按照常規方法提取上述培養後的樣品中的DNA；步驟四，利用PCR或生物晶片檢測技術對上述DNA進行處理，以鑑定上述樣品中的腸道致病菌種類。
在本發明的一較佳實施例中，上述步驟一所述的腸道致病菌所用的培養基的使用量為30ml。
在本發明的另一較佳實施例中，上述步驟一所述的室溫培養時間為5-6小時。
在本發明的另一較佳實施例中，上述步驟一所述的腸道致病菌所用的培養基為2×YT培養基。
基於上述技術方案，本發明僅需很少量的糞便樣品即可進行檢測，而且可快速、可靠地提取到用於PCR或基因晶片等快速檢測腸道致病菌技術所需的DNA。
為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下面特舉最佳實施例，作詳細說明如下。
具體實施例方式
下面通過最佳實施例對本發明作進一步的詳細說明。以下實施例僅僅是用於說明而不是限制本發明。
糞便樣品的培養取欲檢測的糞便樣品少許，例如約為0.3克，以無菌操作將其轉入30ml的2×YT培養基[培養基配方參見(美)J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南(第二版)，科學出版社，1999909]中，220rpm37℃培養5-6小時。此時糞便樣品中的致病菌濃度可達到提取基因組的較適濃度。
在上述糞便樣品的培養過程中，所選擇的培養基種類、培養基使用量和培養時間均為經大量實驗摸索後確定的最佳條件。
1.培養基在本發明的上述最佳實施例中，所選用的2×YT培養基因與一般的腸桿菌屬細菌的選擇性培養基相比，其營養成分豐富，可使包括大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等在內的絕大部分腸道致病菌快速增殖，而一般的腸桿菌屬細菌的選擇性培養基只能將大腸桿菌、志賀氏菌等少數腸桿菌屬細菌培養出來，而不能將絕大多數的腸道致病菌培養出來，因此使用2×YT培養基對培養腸道致病菌可獲得最好的培養效果，與其他培養基相比，導致漏檢的可能性小，增菌快速，體現了快速檢測的特點。
2.培養時間本發明對上述糞便的培養時間分別做了2小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時和6小時幾個梯度，實驗結果表明，當培養時間為2小時，待檢測細菌的特異PCR反應結果為陰性；當培養時間分別為4小時和4.5小時，待檢測細菌的特異PCR反應結果多數為陽性，但不穩定，有不同程度的陰性結果出現；當培養時間分別為5小時、5.5小時和6小時，待檢測細菌的特異PCR反應結果為穩定的陽性；培養時間過長(超過6小時)並不能使實驗效果更好，且影響此方法快速的特點，因此在本發明的最佳實施例中，確定5-6小時為最佳培養時間。
3.培養基使用量培養基使用量的選擇對是否能夠快速、可靠的進行後續腸道致病菌的檢測也具有重要作用，這是因為所選擇的培養基使用量既要保證快速富集到待檢測的致病菌，又要利用一定量的培養基來稀釋糞便樣品中的PCR抑制成分。本發明做了10ml、20ml和30ml幾個梯度，實驗結果表明，30ml培養基對PCR抑制成分的稀釋效果最好，20ml和10ml培養基的稀釋效果不穩定，有時會出現培養物中的PCR抑制成分濃度偏高，影響PCR擴增的情況。因為不同人的糞便樣品，以及同一個人不同時間的樣品中所含的PCR抑制成分的濃度不同，因此在本發明的最佳實施例中選擇了稀釋效果較好的30ml培養基。而大於30ml的使用量，會降低待測細菌的起始菌濃，使培養時間相應增加，從而達不到快速處理糞便樣品的效果。
為確定所需的最佳培養基使用量和培養時間，本發明利用550份來源不同的正常人糞便樣品，向其中混入待測細菌，形成起始菌濃≥103cfu/g的糞便模擬樣品，分別在下表所列的培養條件下進行實驗，並用特異PCR反應來檢測從糞便樣品培養物中提取的DNA的質量。在每個培養條件下進行10次重複實驗，10次重複實驗均得到陽性結果的用「+」表示；10次重複實驗中只有一部分得到陽性結果的用「±」表示；10次重複實驗均得到陰性結果的用「-」表示。經過一系列摸索實驗最終確定了30ml培養基培養5-6個小時為最佳培養條件。
表不同培養基使用量、培養時間條件下的特異PCR反應結果
這裡需要說明的是，在上述快速處理糞便樣品的方法中，糞便樣品的檢測量、培養基的使用量和培養基種類以及培養時間並非特別限定於上述的數值。所屬技術領域的技術人員應該知道，這些具體數值僅是通過一系列的梯度實驗摸索出來的最佳試驗數值。
糞便樣品DNA的提取接下來可用傳統方法或基因組DNA提取試劑盒提取上述培養後菌液的DNA。以下以使用天為時代科技有限公司生產的離心柱型血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒I提取上述處理後的糞便樣品基因組為例來進行說明。
1)對於每一個待測的樣品，平行取2個1.2ml培養後菌液加入到2個1.5ml滅菌離心管中，12000rpm室溫離心8分鐘，棄上清。
2)加入250μl緩衝液GA將菌體重懸。
3)加入10μl 50mg/ml的蛋白酶K，充分混勻；再加入250μl緩衝液GB，充分混勻，70℃水浴至溶液澄清(約20分鐘)。
4)加入250μl無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉澱。
5)將所得的溶液和絮狀沉澱全部轉移到一個吸附柱CB中(吸附柱放入廢液收集管中)12000rpm室溫離心1分鐘(直至液體全部離下)，棄液。
6)加入500μl去蛋白液GD(已混入無水乙醇)，12000rpm室溫離心30秒，棄廢液。
7)加入700μl漂洗液GW(已混入無水乙醇)，12000rpm室溫離心30秒，棄廢液。
8)加入500μl漂洗液GW(已混入無水乙醇)，12000rpm室溫離心30秒，棄廢液。
9)將吸附柱CB放回廢液收集管中，12000rpm室溫離心2分鐘，儘量去除漂洗液。
10)將吸附柱CB轉入一個乾淨的離心管中，加入100μl 70℃的洗脫緩衝液，室溫靜置5分鐘，12000rpm室溫離心30秒。
11)將離心得到的溶液再加入到吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm室溫離心兩分鐘。
12)收集離下液，100℃水浴5分鐘，自然冷卻至室溫，此時可直接使用用於PCR操作、生物晶片檢測，或放入-20℃凍存(此提取物最多存放一個星期)。
糞便樣品DNA的檢測最後，利用公知的PCR或生物晶片檢測技術對上述得到的DNA進行處理，以鑑定待測樣品中腸道致病菌的種類。
綜上所述，本發明通過對培養基種類、培養時間和培養基使用量的選擇，獲得最佳的糞便樣品的培養條件，從而實現了僅需很少量的糞便樣品即可快速、可靠檢測出腸道致病菌的目的。
雖然本發明已以最佳實施例披露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，可做些許的更動與改進，因此本發明的保護範圍應以權利要求所界定者為準。
權利要求
1.一種腸道致病菌的檢測方法，其特徵是包括以下步驟步驟一，取欲檢測的糞便樣品，以無菌操作將其轉入至少20ml腸道致病菌所用的培養基中，室溫培養至少5小時；步驟二，按照常規方法提取培養後的樣品中的DNA；步驟三，利用PCR或生物晶片檢測技術對上述DNA進行處理，以鑑定上述樣品中的腸道致病菌種類。
2.根據權利要求1所述的腸道致病菌的檢測方法，其特徵是上述步驟一中，腸道致病菌所用的培養基的使用量為30ml。
3.根據權利要求1所述的腸道致病菌的檢測方法，其特徵是上述步驟一中，室溫培養時間為5-6小時。
4.根據權利要求1-3之任一所述的腸道致病菌的檢測方法，其特徵是上述步驟一中，腸道致病菌所用的培養基為2×YT培養基。
全文摘要
本發明涉及一種腸道致病菌的快速檢測方法。該方法包括以下步驟首先，取欲檢測的糞便樣品，以無菌操作將其轉入至少20ml腸道致病菌所用的培養基中，室溫培養至少5小時；然後，按照常規方法提取培養後的樣品中的DNA；最後，利用PCR或生物晶片檢測技術對上述DNA進行處理，以鑑定上述樣品中的腸道致病菌種類。本發明僅需很少量的糞便樣品即可快速、可靠地檢測出腸道致病菌的種類。
文檔編號C12Q1/04GK1982475SQ20051013212
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月16日 優先權日2005年12月16日
發明者王磊, 馮露, 韓巍青, 李雅玥 申請人:天津生物晶片技術有限責任公司