新型atp:檸檬酸裂解酶基因的製作方法

2023-08-13 15:36:46 2

專利名稱：新型atp:檸檬酸裂解酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型ATP 檸檬酸裂解酶基因。
背景技術：
脂肪酸是構成磷脂、甘油三酯等脂質的重要成分。含有2個以上不飽和鍵的脂肪 酸總稱為多不飽和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高-Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸等，具有種種生理活性(非專利文獻1)。雖然期待此多不飽和脂肪酸在各 個領域的應用，但其中也包含在動物體內不能合成的多不飽和脂肪酸。因此，開發出了培養 各種微生物以獲得多不飽和脂肪酸的方法。還進行了用植物生產多不飽和脂肪酸的嘗試。 在這種情況下，已知多不飽和脂肪酸例如作為甘油三酯等脂質的組成成分，在微生物的菌 體內或植物種子中積累。此種在動物、植物及微生物中的新型脂肪酸合成如下進行，乙醯CoA由乙醯CoA羧 化酶(ACC)催化生成丙二醯CoA，丙二醯CoA和乙醯CoA由脂肪酸合成酶催化合成脂肪酸。 已知這些反應在動物、微生物等中的細胞質中進行，在植物中的葉綠體中進行。作為這些在細胞質中新合成的脂肪酸、膽固醇的原料的乙醯CoA通過ATP:檸檬酸 裂解酶(E. C. 2. 3. 3. 8，以下有時也記為ACL)的作用由檸檬酸供給。ACL是催化以下反應的酶。式 1檸檬酸+ATP+CoA§乙醯CoA+草醯乙酸+ADP+Pi該酶在真核生物中的動物、植物、黴菌等中廣泛分布，其在細胞內定位於細胞質 (非專利文獻2)。至今為止已用一些生物報導了 ACL基因。例如，在動物中，已克隆了 作為來自智人(Homo sapiens)及褐家鼠(Rattusnorvegi cus)的基因的ACL基因(非 專利文獻3、非專利文獻4)。在植物中，已克隆了作為來自擬南芥(模式種哥倫比亞) (Arabidopsis (ecotypeColumbia))的基因的 ACLA_l、-2、_3 和 ACLB_1、_2 (非專利文獻 5)。 在絲狀菌中，已克隆了作為來自大孢糞殼黴菌(Sordaria macrospora)的基因的ACLA和 ACLB基因(非專利文獻6)。已報到了作為脂質生產菌高山被孢黴(Mortierella alpina)(以下有時也記為 「高山被孢黴(M. alpina)」)，在細胞質組分中有ATP 檸檬酸裂解酶活性(非專利文獻7)。至今為止，使用這些已知ACL基因已進行了如下嘗試，使來自大孢糞殼黴菌 (Sordaria macrospora)的ACL基因與脂肪酸合成酶(FAS)同時在酵母中高表達，從而提高 宿主的總脂肪酸量(專利文獻1)；或使來自褐家鼠(Rattus norvegicus)的ACL基因在植 物內高表達，從而增加宿主的總脂肪酸量(非專利文獻8)。專利文獻1美國專利公報第2006/0051847非專利文獻ILipids.，39，ppl 147 (2004)非專利文獻2Adv Appl Microbiol.，51，ppl—51 (2002)
4
非專利文獻3Eur J Bio Chem.，204，pp491_499 (1992)非專利文獻4J Bio chem.，265，ppl430-1435 (1990)非專利文獻5Plant Physiology.，130，pp740_756 (2002)非專利文獻6Curr. genet.，37，ppl89_93 (2000)非專利文獻7Microbiology.，146，pp2325_2331 (2000)非專利文獻8Plant Physiology.，122，ppl231_1238 (2000)

發明內容
但是，從至今為止已報導的ACL基因即使導入宿主細胞使其表達，也未能確認出 其單獨的效果，及能使其表達的宿主具有局限性等的觀點來看，該基因還不完善。因此，希 望鑑定出與目前為止不同的可增加宿主中的總脂肪酸量或脂質量的新型基因。本發明的目的在於提供如下蛋白質及核酸，其可通過在宿主細胞中表達或導入宿 主細胞，而使脂肪酸、脂質的含量增加。本發明者為解決上述課題進行了銳意研究。首先，進行脂質生產菌高山被孢黴 (Mortierella alpina)的EST分析，從中提取與已知ACL基因的同一性高的序列。而且為 了獲得編碼ACL的開放閱讀框(0RF)全長，通過cDNA文庫的篩選或PCR克隆了基因。使其 在不存在ACL基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達後，通過測定ACL活性， 來確認所述基因的ACL活性。而且，通過導入到作為脂質生產菌的高山被孢黴(Mortierella alpina)等的宿主 細胞中並使其高表達，從而嘗試使總脂肪酸量大量產生的發明者，成功地克隆了與以往量 的ACL表達的宿主相比可增加總脂肪酸量的、與新型ACL有關的基因，從而完成了本發明。 即本發明如下。(1)核酸，其包含以下(a) (e)中任一項所述的鹼基序列(a)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列中1個或多個氨 基酸發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成，且具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(b)鹼基序列，其與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列的互補鹼基序列組 成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(c)鹼基序列，其由與序列號9或序列號10所組成的鹼基序列有70%以上同一性 的鹼基序列組成，且編碼具有ATP 檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(d)鹼基序列，其編碼與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有70%以上 同一性的胺基酸序列，且編碼具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(e)鹼基序列，其與由編碼序列號11或12所示的胺基酸序列所組成的蛋白質的鹼 基序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有ATP:檸檬酸裂解酶活 性的蛋白質。(2)根據(1)中所述的核酸，其包含以下(a) (c)中任一項的鹼基序列(a)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列中1 10個氨 基酸發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成，且具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(b)鹼基序列，其與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列的互補鹼基序列組 成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且編碼具有ATP 檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。
(c)鹼基序列，其編碼與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有90%以上 同一性的胺基酸序列，且編碼具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(3)核酸，其包含以下(a) (c)中任一項所述的鹼基序列或其片段(a)鹼基序列，其如序列號9或序列號10所示。(b)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列組成的蛋白質。(c)鹼基序列，其如序列號5或序列號6所示。(4)蛋白質，其如以下(a)或(b)中任一項所述(a)蛋白質，其由序列號11或序列號12中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附 加的胺基酸序列組成，且具有ATP 檸檬酸裂解酶活性。(b)蛋白質，其由與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有70%以上同一 性的胺基酸序列組成，且具有ATP 檸檬酸裂解酶活性。(5)蛋白質，其由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列組成。(6)重組載體，其含有(1) (3)中任一項所述的核酸。(7)轉化體，其中導入了(1) (3)中任一項所述的核酸。(8)轉化體，其通過(6)中所述的重組載體轉化。(9)根據⑶中所述的轉化體，其中，通過導入(6)中所述的載體，提高了脂肪酸的 生產能力。(10)根據(7) (9)中任一項所述的轉化體，其特徵在於，轉化體為脂質生產菌。(11)根據(10)中所述的轉化體，其特徵在於，脂質生產菌為高山被孢黴 (Mortierella alpina)。(12)肪酸或脂質的製造方法，其特徵在於，從培養(7) (11)中任一項所述的轉 化體而得到的培養物中提取所述脂肪酸或脂質。(13)脂肪酸或脂質，其使用(12)中所述的製造方法獲得。(14)食品，其中含有(13)中所述的脂肪酸或脂質。本發明的ACL因可使脂肪酸、脂質的生產能力得到提高，所以可提高微生物、植物 中的多不飽和脂肪酸的生產率，故而優選。因由此可提供比以往廉價且有用的脂質，所以， 作為可適用於食品、化妝料、醫藥品、肥皂等的成分而有用。


圖。
圖1-1圖1表示本發明的MaACLl的cDNA序列和推定胺基酸序列。 圖1-2圖1表示本發明的MaACLl的cDNA序列和推定胺基酸序列。 圖2-1圖2表示本發明的MaACL2的cDNA序列和推定胺基酸序列。 圖2-2圖2表示本發明的MaACL2的cDNA序列和推定胺基酸序列。 圖3-1圖3表示MaACLl和MaACL2的CDS部分的DNA序列的比較圖。 圖3-2圖3表示MaACLl和MaACL2的CDS部分的DNA序列的比較圖。 圖4圖4表示MaACLl和MaACL2的推定胺基酸序列的比較圖。 圖5-1圖5表示MaACLlp及MaACL2p的推定胺基酸序列與已知胺基酸序列的比較
圖5-2圖5表示MaACLlp及MaACL2p的推定胺基酸序列與已知胺基酸序列的比較圖。圖6圖6表示MaACLl的Mg2+濃度依賴性的圖。圖7圖7表示培養過程中的MaACLl轉化體(MaACLl_l，-2)和未轉化體 (Ctrl-U-2)的菌體內油脂含有率的經時比較圖。
具體實施例方式本發明涉及來自被孢黴屬的新型ATP 檸檬酸裂解酶基因，其特徵在於，由ATP、檸 檬酸及CoA生成乙醯CoA、草醯乙酸、ADP及Pi。如真核生物，在細胞內由細胞器分隔開的情況下，本發明所涉及的乙醯CoA通過 丙酮酸脫氫酶、0 -氧化，主要在線粒體內生成。但是，乙醯CoA不能透過線粒體膜，而是作 為檸檬酸供給到細胞質內。由該檸檬酸通過ACL的作用供給細胞質的乙醯CoA，成為在細胞 質內新合成的脂肪酸和膽固醇等的原料。本發明的編碼ATP -Mmmmmmmm本發明的ATP 檸檬酸裂解酶(ACL)中含有MaACLl及MaACL2。編碼MaACLl及 MaACL2的核酸的cDNA、⑶S、0RF及胺基酸序列的對應關係在以下表1中整理記載。表 1 即作為與本發明的MaACLl相關的序列，例舉了作為MaACLl的胺基酸序列的序列 號11、作為表示MaACLl的0RF區的序列的序列號9、而且還有作為表示其⑶S區的序列的序 列號7、及作為其cDNA的鹼基序列的序列號5。其中，序列號7相當於序列號5的第178 3717位的鹼基序列，序列號9相當於序列號5的第178 3714位的鹼基序列及序列號7的 第1 3537位的鹼基序列。同樣，作為與MaACL2相關的序列，可例舉作為MaACL2的胺基酸序列的序列號12、 作為表示MaACL2的0RF區的序列的序列號10、而且還有作為表示其CDS區的序列的序列號 8、及作為其cDNA的鹼基序列的序列號6。在此，序列號8相當於序列號6的第21 3545位的鹼基序列，序列號10相當於序列號6的第21 3542位的鹼基序列及序列號8的第 1 3522位的鹼基序列。本發明的核酸是指除了單鏈及雙鏈的DNA以外，還含有其RNA互補體，可為來自天 然的核酸，也可為人工製備的核酸。DNA中，例如可例舉基因組DNA、與所述基因組DNA對應 的cDNA、化學合成的DNA、通過PCR擴增的DNA及這些的組合、DNA和RNA的雜交體，但不限 定於此。作為本發明的核酸的優選方式，可例舉(a)由序列號9或序列號10所示的鹼基序 列，(b)編碼由序列號11或12所示的胺基酸序列組成的蛋白質的鹼基序列，(c)由序列號 5或6所示的鹼基序列等。由序列號9或序列號10所示的鹼基序列及編碼由序列號11或12所示的胺基酸 序列組成的蛋白質的鹼基序列、及由序列號5或6所示的鹼基序列如表1中記載。為得到上述鹼基序列，從具有ATP 檸檬酸裂解酶活性(以下，有時也記為ACL活 性)的生物的EST、基因組DNA的鹼基序列數據中，也可搜索到編碼與已知的具有ACL活性 的蛋白質同一性高的蛋白質的鹼基序列。作為具有ACL活性的生物，優選脂質生產菌，作為 脂質生產菌可例舉高山被孢黴(M. alpina)，但不限於此。進行EST分析時，首先構建cDNA文庫。對於cDNA文庫的構建方法 可參照《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring HarborPress(2001))o另外，也可使用市售的cDNA文庫構建試劑盒。作為適用於本發明的 cDNA文庫的構建方法，例如可例舉如下方法。即將作為脂質生產菌高山被孢黴(M. alpina) 的適當的菌株接種於適當的培養基中，進行適當時間的預培養。作為適合該預培養的培養 條件，例如作為培養基組成可例舉1. 8%葡萄糖、酵母浸膏、pH6. 0、培養時間為3天、培 養溫度為28°C的條件。而後，將預培養物在適當的條件下供給主培養。作為適合主培養的培 養基組成，例如可例舉1. 8%葡萄糖、1 %大豆粉、0. 1 %橄欖油、0. 01% Adekanol (增稠劑)、 0. 3% KH2P04、0. 1% Na2S04、0. 05% CaCl2 2H20、0. 05% MgCl2 6H20、pH6. 0。作為適合主培 養的培養條件，例如可例舉300rpm、lVVm、26°C下8天通氣攪拌培養的條件。培養期間也可 添加適當量的葡萄糖。在主培養中適時取培養物，從中回收菌體，製備總RNA。在總RNA的 製備中，可使用鹽酸胍/CsCl法等公知的方法。從所得到的總RNA中，使用市售的試劑盒， 可純化poly (A)+RNA。而且，使用市售的試劑盒可構建cDNA文庫。其後，將所構建的cDNA 文庫的任意的克隆鹼基序列使用設計為可確定載體上插入部分的鹼基序列的引物來確定， 可得到 EST。例如，用 ZAP-cDNA Gigapacklll Gold Cloning Kit (STRATAGENE)構建 cDNA 文庫時，可進行定向克隆。本發明的MaACLl及MaACL2的CDS間的鹼基序列的同一性為79. 1 %。且MaACLl 和MaACL2之間的胺基酸序列同一性為87. 1 %。此外，將本發明的MaACLl的胺基酸序列 及MaACL2的胺基酸序列分別進行BLASTP分析的結果，與E-value最低的來自Ustilago maydis 521 的推定蛋白質(圖 5) (UM01005. 1，GB accession No. EAK82015, gi_46096782) 的同一性MaACLl 為 61. 6%,MaACL2 為 61. 9%。本發明還包含與包含如下鹼基序列的核酸具有同等功能的核酸，該鹼基序列為上 述序列號9及10所示的鹼基序列(有時也記為「本發明的鹼基序列」)、以及編碼由序列號 11及12所示的胺基酸序列(有時也記為「本發明的胺基酸序列」)組成的蛋白質的鹼基序列。「具有同等功能」是指本發明的鹼基序列編碼的蛋白質及本發明的胺基酸序列所組成 蛋白質具有ACL活性、或具有ACL活性且與本發明的鹼基序列編碼的蛋白質及本發明的氨 基酸序列所組成蛋白質有同等酶活性的特性。酶活性的特性中，根據酶反應條件中的溫度、 PH、鹽濃度或底物濃度等變化的活性的變化、Km值、底物特異性等所有的特性均包含於其 中。本發明的ACL是催化由ATP、檸檬酸及CoA生成乙醯CoA、草醯乙酸、ADP及Pi的 反應的酶，其「ACL活性」可使用公知的方法測定。例如，可參照以下文獻Plant Physiol.， 2002，130,740-56。例如，本發明的「ACL活性」也可如下測定。由使本發明的MaACLl或MaACL2表達 的酵母(不具有內源性的ACL基因)通過Plant Physiol.，2002，130，740-56中記載的方 法等製備細胞質組分。而後可通過在反應液10mM Tris-HCl(pH8. 4)、20mM MgCl2、lmM DTT、 lOmM ATP、10mM檸檬酸、0. 2mM CoA,6單位蘋果酸脫氫酶、0. ImM NADH中添加上述細胞質組 分，28°C下反應適當的時間，用吸光度計測定々34(1處的變化(NADH量的減少)來對「ACL活 性」進行定量。本說明書中，「具有ACL活性」是指只要在上述檢測中可確認NADH量的減少，無特 別限定，但優選具有1. Onmol mirT1 mg—1以上的活性。此外，還可確認出本發明的MaACLl (序列號11)的ACL活性具有Mg2+濃度依賴性。 具體地說，Mg2+濃度為5 10mM時活性極大，隨著Mg2+濃度上升，ACL活性減少(圖6)。而 且也可發現，MaACLl在ATP 檸檬酸Mg2+的比大約為1 1 1時顯示最大活性。作為與本發明的核酸具有同等功能的核酸，可例舉包含以下(a) (e)中任一項 所述的鹼基序列的核酸。而且，在以下所舉出的鹼基序列的記載中，「本發明的上述活性」是 指上述的「具有ACL活性及/或與本發明的鹼基序列編碼的蛋白質及本發明的胺基酸序列 所組成蛋白質有同等酶活性的特性」。(a)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列中1個或多個氨 基酸發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成，且具有本發明的活性的蛋白質本發明的核酸中所含有的鹼基序列包含如下鹼基序列，其編碼由序列號11或序 列號12所示的胺基酸序列中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成， 且具有本發明的上述活性的蛋白質。具體地說，為編碼由以下的胺基酸序列組成且具有本發明的上述活性的蛋白質的 鹼基序列(i)序列號11或12所示的胺基酸序列中的1個或多個(優選1個或多個(例如 1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、1 50個、1 30 個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1 5個))胺基酸發生缺失的
胺基酸序列，(ii)序列號11或12所示的胺基酸序列中的1個或多個(優選1個或多個(例如 1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、1 50個、1 30 個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1 5個))胺基酸被其他氨基 酸取代的胺基酸序列，(iii)序列號11或12所示的胺基酸序列中附加1個或多個(優選1個或多個(例如1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、1 50個、1 30個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1 5個))其他胺基酸的氨
基酸序列，或(iv)組合了上述⑴ (iii)的胺基酸序列。上述中，取代優選為保守性取代。保守性取代是指將特定的胺基酸殘基用具有類 似的物理化學特徵的殘基取代，但只要不實質性改變與原有序列的結構有關的特徵，可為 任何取代，例如，只要取代胺基酸不破壞原有序列中存在的螺旋結構，或不破壞賦予原有序 列特徵的其他種類的二級結構，可為任何取代。保守性取代一般可用生物學體系合成、化學肽合成導入，但優選通過化學肽合成 來進行。此時，取代基中可含有非天然的胺基酸殘基，也可含有肽模仿物、胺基酸序列中未 被取代的區域發生倒位的倒位型或同區域發生反轉的反轉型。以下，將胺基酸殘基按可取代的殘基進行分類舉例，但可取代的胺基酸殘基不限 於以下記載的殘基A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨 酸、0-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及環己基丙氨酸B組天冬氨酸、穀氨酸、異天冬氨酸、異穀氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸C組天冬醯胺及穀氨醯胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4- 二氨基丁酸及2，3_ 二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸及4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸及高絲氨酸G組苯丙氨酸及酪氨酸為非保守性取代時，上述種類中的某一種成分可與其他種類的成分互換，此時， 為保持本發明的蛋白質的生物學功能，優選參考胺基酸的親水指數(親水性胺基酸指數) (Kyte 等，J. Mol.Biol.，157 105-131 (1982))。此外，為非保守性取代時，可根據親水性進行胺基酸的取代。本說明書及附圖中，鹼基、胺基酸及其縮寫以IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature、或例如 Immunology—A Synthesis (第 2 版，E. S. Golub 及 D. R. GrenHSjf ,Sinauer Associates, Sunderland,Massachusetts (1991)) 中i己i的*令頁 域慣用的縮寫為依據。此外，胺基酸有光學異構體時，在無特別說明的情況下，均表示L體。D-胺基酸等上述胺基酸的立體異構體、a，a - 二取代胺基酸等的非天然胺基酸、 N-烷基胺基酸、乳酸及其他非慣用胺基酸，也可作為構成本發明的蛋白質的要素。且本說明書中使用的蛋白質的標記法，根據標準用法及本領域中常用的標記法， 左方向為氨基末端方向，右方向為羧基末端方向。同樣，在一般情況下不特別提及時，單鏈多核苷酸序列的左端為5』端，雙鏈多核苷 酸序列的左方向為5』方向。只要是本領域技術人員，使用本領域中公知的技術，即可設計、製備本說明書中所 述的蛋白質的適當的突變體。例如，通過將對本發明蛋白質的生物學活性並不太重要的區 域作為靶區，可鑑定出不損壞本發明的蛋白質的生物學活性而使其結構改變的蛋白質分子 中適當的區域。且也可鑑定出在類似的蛋白質間保守的分子的殘基及區域。並且，在認為對本發明蛋白質的生物學活性或結構重要的區域中，在不損壞其生物學活性且不給予蛋白 質的多肽結構以不良影響的情況下，也可導入保守性胺基酸取代。例如，本發明的MaACLl及MaACL2與來自擔子菌玉蜀黍黑粉菌(U. maydis)
的類似ACL的推定蛋白質(gi_46096782)有約62 %的胺基酸序列同一性，與來
自小鼠(gi_29293809)、人(gi_38569421)、黑腹果蠅(gi28372804)、線蟲
(gi_17551266)等動物的ACL或類似ACL的推定蛋白質序列也有一定的同一性(圖5)。
作為可發生突變的胺基酸殘基的例子，可將圖5所示的7個序列的全部中除了保守殘基以 外的殘基判斷為可發生突變的胺基酸殘基，或可將該7個序列中至少為4、5或6的序列中 除了保守殘基以外的殘基判斷為可發生突變的胺基酸殘基。或在圖5中用下劃線、虛線的下劃線、及雙下劃線表示的3個下劃線部為ATP 檸 檬酸裂解酶/琥珀醯_CoA裂解酶中特別重要的位點(從N末端開始按順序為PR0SITE的 PS01216，PS00399，PS01217)。即本發明的突變體中，只要上述位點為保守，則可為任何突變 體。因此，作為可發生突變的胺基酸殘基的其他例子，可將除了圖5中所示的3個用下劃線 表示的胺基酸殘基以外的殘基判斷為發生突變的胺基酸殘基。且本發明的MaACLl及MaACL2的相互之間具有87. 1 %的胺基酸同一性(圖4)。作 為可發生突變的胺基酸殘基的其他例子，可將在MaACLl及MaACL2之間的非保守殘基判斷 為可發生突變的胺基酸殘基。只要是本領域技術人員，均可鑑定對本發明蛋白質的生物學活性或結構重要、與 該蛋白質的肽類似的肽的殘基，比較此2種肽的胺基酸殘基，既可預測出與本發明蛋白質 類似的蛋白質的哪個殘基是與對生物學活性或結構重要的胺基酸殘基對應的胺基酸殘基， 可進行所謂的結構_功能研究。並且，通過選擇與上述預測的胺基酸殘基的化學性質類似 的胺基酸取代，可選出保持了本發明蛋白質的生物學活性的突變體。此外，只要是本領域 技術人員，即可對本蛋白質突變體的三維結構及胺基酸序列進行分析。進而從所得到的分 析結果來看，也可預測與蛋白質的三維結構有關的胺基酸殘基的比對。預測為蛋白質表面 上存在的胺基酸殘基有參與和其它分子的重要的相互作用的可能性，只要是本領域技術人 員，即可基於上述分析結果，製備出不使預測為在此種蛋白質表面上存在的胺基酸殘基發 生改變的突變體。並且只要是本領域技術人員，即可製備構成本發明蛋白質的各個胺基酸 殘基中，只有一個胺基酸殘基發生取代的突變體。通過公知的檢測方法篩選此種突變體，即 可收集各個突變體的信息。由此，通過對某種特定的胺基酸殘基發生取代的突變體的生物 學活性與本發明蛋白質的生物學活性相比降低時、不表現此種生物學活性時、或產生抑制 本蛋白質生物學活性的不適當活性時進行比較，即可評價構成本發明蛋白質的種種胺基酸 殘基的有用性。此外，只要是本領域技術人員，可根據此種從日常實驗中收集的信息，單獨 或與其他突變組合，從而容易地分析作為本發明蛋白質的突變體的不期望的胺基酸取代。如上所述，由序列號11或12所示的胺基酸序列中1個或多個胺基酸發生缺 失、取代或附加的胺基酸序列組成的蛋白質，可通過《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001)) > ((CurrentProtocolsin Molecular Biology)) (John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988)Method. Enzymol. 85 2763-6 等中所述的定點誘變法製備。發生了 此種胺基酸的缺失、取代或附加等突變的突變體的製備，例如可通過Kunkel法、Gappedduplex法等公知手法，使用利用了定點誘變法的突變引入用試劑盒、例如QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司 制、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super ExpressKm 等TAKARA BIO 公司制)等進行。且作為在蛋白質的胺基酸序列中，既保持了其活性同時又引入1個或多個胺基酸 的缺失、取代或附加的方法，除上述定點誘變以外，可例舉為用誘變劑處理基因的方法；及 使基因選擇性斷裂，將所選擇的核苷酸除去、取代或附加後進行連接的方法。本發明的核酸中所包含的鹼基序列，優選為編碼由序列號11或12所示的胺基酸 序列中1 10個胺基酸發生缺失、取代或附加後的胺基酸序列組成，且具有ACL活性的蛋 白質的鹼基序列。本發明蛋白質中的胺基酸突變或修飾的數量、或突變或修飾的位點，只要保持ACL 活性、或與本發明的鹼基序列編碼的蛋白質及由本發明的胺基酸序列組成的蛋白質保持同 等的酶活性的特性，無限制。(b)鹼基序列，其與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列的互補鹼基序列組 成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質。本發明的核酸中所含有的鹼基序列，包含與由序列號9或序列號10所組成的鹼基 序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白 質的鹼基序列。序列號9或序列號10及本發明的上述活性如上所述。上述鹼基序列，用本領域技術人員公知的方法製備適當的探針，使用此探針通過 菌落雜交法、噬菌斑雜交、Southern印跡法等公知的雜交法，可從cDNA文庫及基因組文庫 等中獲得。對於雜交法的詳細步驟,可參照《Molecular Cloning, A LaboratoryManual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001)，特別是 Section 6-7)、〈〈Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987-1997)，特別是 Section6. 3-6. 4)、 〈〈DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed. )) (Oxford University (1995)，雜交條件特別可參照 Section2. 10)。雜交條件的強度，主要由雜交條件、更優選由雜交條件及洗滌條件決定。在本說明 書中「嚴謹條件」包括中度或高度嚴謹條件。具體來說，作為中度嚴謹條件，例如雜交條件可例舉1XSSC 6XSSC、42°C 55°C的條件，更優選1 X SSC 3 X SSC、45°C 50°C的條件，最優選2 X SSC、50°C的條件。雜 交溶液中例如含有約50%甲醯胺時，採用比上述溫度低5至15°C的溫度。作為洗滌條件， 可例舉0. 5XSSC 6XSSC、40°C 60°C。在雜交及洗滌時，通常可加入0. 05% 0. 2%、 優選約0. 1% SDS0作為高度嚴謹(高嚴謹)的條件，包括在比中度嚴謹條件高的溫度及/或低的鹽 濃度下的雜交及/或洗滌。例如雜交條件可例舉0. 1XSSC 2XSSC、55°C 65°C的條件， 更優選0. 1XSSC 1父55(、601 651的條件，最優選0.2\55(、631的條件。作為洗滌 條件，可例舉 0. 2XSSC 2XSSC、50°C 68°C，更優選 0. 2XSSC、60 65°C。特別是作為用於本發明的雜交條件，例如可例舉在5XSSC、1 % SDS、50mMTris-HCl(pH 7. 5)及50%甲醯胺中42°C的條件下進行預雜交後，添加探針，在42°C保 溫過夜形成雜交體，然後在0. 2XSSC、0. SDS中65°C下進行3次20分鐘的洗滌的條件， 但並不限於此條件。此外，也可使用探針中未使用放射性物質的市售的雜交試劑盒。具體地說，可例舉 為使用 DIG核酸檢測試劑盒(Roche Diagnostics 公司)、ECL directlabeling & detection system (Amersham公司制)進行的雜交等。作為本發明中包含的鹼基序列，優選與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列 的互補鹼基序列組成的核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且編碼具有ACL活性的蛋白質 的鹼基序列。(c)鹼基序列，其由與序列號9或序列號10所組成的鹼基序列有70%以上同一性 的鹼基序列組成，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質。本發明的核酸中所含有的鹼基序列，包含由與序列號9或序列號10所組成的鹼基 序列有70%以上同一性的鹼基序列組成，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質的鹼基序 列。可優選與序列號9或10所示的核酸序列有至少75%以上、進一步優選80%、更進 一步優選85% (例如90%、95%、進一步為98%或99%)同一性的鹼基序列的核酸，且為編 碼具有本發明的上述活性的蛋白質的鹼基序列。如上所述，MaACLl(序列號9)及MaACL2(序 列號10)的同一性為79. 1%。本發明的核酸中包含與序列號9或10所示的核酸序列有至 少80%以上同一性、與兩者類似的核酸。2個核酸序列的同一性％可通過視覺檢查、數學計算來確定，但優選使用計算機 程序通過比較2組核酸的序列信息來確定。作為序列比較電腦程式，例如可例舉可以 在美國國立醫學圖書館的網站:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 上利用的 BLASTN 程序(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 403-10) :2. 2. 7 版或 WU-BLAST2. 0算法等。關於WU-BLAST2. 0的標準默認參數的設定，可使用以下網站http:// blast, wustl. edu中所記載的內容。(d)鹼基序列，其編碼與由序列號11或序列號12組成的胺基酸序列有70%以上 同一性的胺基酸序列，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質。本發明的核酸中所含有的鹼基序列中，包含編碼與由序列號11或序列號12組成 的胺基酸序列有70%以上同一性的胺基酸序列，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質的 鹼基序列。本發明的核酸編碼的蛋白質只要與具有本發明的上述活性的蛋白質有同等功 能，也可以是與MaACLl或MaACL2的胺基酸序列有同一性的蛋白質。具體地說，可例舉與序列號11或序列號12所示的胺基酸序列有75%以上、優選 85%以上、更優選88% (例如90%、95%、98%、進一步為99%)以上的同一性的胺基酸序 列等。如上所述，MaACLl (序列號11)和MaACL2(序列號12)之間的胺基酸序列的同一性 為87. 1%。本發明的核酸編碼的蛋白質包含與序列號11或12所示的胺基酸序列有至少 88%以上同一性，與兩者類似的蛋白質。本發明的核酸中所含有的鹼基序列，優選為編碼與由序列號11或序列號12組成 的胺基酸序列有90%以上同一性的胺基酸序列，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質的 鹼基序列。進一步優選為編碼與由序列號11或序列號12組成的胺基酸序列有95%以上同一性的胺基酸序列，且編碼具有本發明的上述活性的蛋白質的鹼基序列。2個胺基酸序列的同一性的百分率可通過視覺檢查、數學計算確定。此外，也可使 用電腦程式來確定同一性百分率。此種電腦程式例如可例舉為BLAST、FASTA(Altschul 等、J. Mol. Biol.，215 403-410 (1990))、及 ClustalW 等。特別是 BLAST 程序的同一性搜索 的各種條件(參數)已在 Altschul 等(Nucl. Acids. Res. ,25, p. 3389-3402，1997)中做了 記載，所以，可從美國生物技術信息中心(NCBI)、日本DNA資料庫(DDBJ)的網站上公開獲得 (BLAST 指南、Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda,MD20894 ；Altschul 等)。且可使用遺傳 信息處理軟體 GENETYX Ver. 7 (GENETYX) .DINASIS Pro (日立軟體)、Vector NTI (Infomax) 等的程序來確定。使多個胺基酸序列並列的特定的比對圖也可顯示序列中特定的短的區域的匹配， 所以，即使使用的序列的全長序列間無顯著相關時，也可在此種區域中檢測出特定的序列 同一性非常高的區域。且BLAST算法可使用BL0SUM62胺基酸打分矩陣，作為選擇參數可 使用如下所示的內容(A)包括用於將具有低組成複雜度的查詢序列的片段[由Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；也希望參照 Wootton 及 Federhen, 1996《序列資料庫中組成偏向性區域的分析》(Analysis ofcompositionally biased regions in sequence databases)MethodsEnzymol. 266 :544_71]、或由失iijH期j"生白勺 內部重複組成的片段[由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程 序確定)]屏蔽的過濾，及(B)根據用於報告對資料庫序列的一致性的統計學上的顯著性閾 值、或根據E-SCOre(Karlin及Altschul，1990)的統計學模型，僅偶然發現為一致的期望概 率；源於某種一致的統計學的顯著差異比E-score閾值大時，不報告此一致。(e)鹼基序列，其與由編碼序列號11或12所示的胺基酸序列所組成的蛋白質的鹼 基序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有本發明的上述活性的蛋 白質。本發明的核酸中所含有的鹼基序列，包含與由編碼序列號11或12所示的胺基酸 序列所組成的蛋白質的鹼基序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具 有本發明的上述活性的蛋白質的鹼基序列。由序列號11或12所示的胺基酸序列組成的蛋白質及雜交條件如上所述。且本發明的核酸中還包含如下核酸，其包含由序列號9或序列號10所組成的鹼基 序列中1個或多個鹼基發生缺失、取代或附加的鹼基序列組成，且編碼具有本發明的上述 活性的蛋白質的鹼基序列。具體地說，也可使用包含如下鹼基序列，且編碼具有本發明的上 述活性的蛋白質的鹼基序列的核酸(i)序列號9或10所示的鹼基序列中1個或多個(優選1個或多個(例如1 1050個、1 750個、1 700個、1 650個、1 600個、1 550個、1 500個、1 450 個、1 400個、1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、 1 50個、1 30個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1 5個))
的鹼基發生缺失的鹼基序列，(ii)序列號9或10所示的鹼基序列中1個或多個(優選1個或多個(例如1 1050個、1 750個、1 700個、1 650個、1 600個、1 550個、1 500個、1 450 個、1 400個、1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、1 50個、1 30個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1 5個))
的鹼基被其他鹼基取代的鹼基序列，(iii)序列號9或10所示的鹼基序列中附加1個或多個(優選1個或多個(例 如1 1050個、1 750個、1 700個、1 650個、1 600個、1 550個、1 500個、 1 450個、1 400個、1 350個、1 300個、1 250個、1 200個、1 150個、1 100個、1 50個、1 30個、1 25個、1 20個、1 15個、1 10個，進一步優選1
5個))其他鹼基的鹼基序列，或(iv)組合了上述⑴ (iii)的鹼基序列。作為本發明的核酸的優選方式，也包括含有以下(a) (c)中任一項所述的鹼基 序列的片段的核酸(a)序列號9或序列號10所示的鹼基序列，(b)編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列組成的蛋白質的鹼基序列，(c)序列號5或序列號6所示的鹼基序列。對於(a)序列號9或序列號10所示的鹼基序列、(b)編碼由序列號11或12所示 的胺基酸序列組成的蛋白質的鹼基序列、(c)序列號5或6所示的鹼基序列，如表1中所記 載。上述序列的片段包含上述鹼基序列中含有的0RF、CDS、具有生物學活性的區域、作為如 下記載的引物使用的區域、可作為探針的區域，可來自天然，也可由人工製作。本發明的ATP 檸檬酸裂解酶蛋白質本發明的蛋白質，包含由序列號11或12所示的胺基酸序列組成的蛋白質及與所 述蛋白質具有同等功能的蛋白質，可來自天然，也可人工製備。對於由序列號11或12所示 的胺基酸序列組成的蛋白質，如上所述。「具有同等功能的蛋白質」，指如上述「編碼本發明 的ATP 檸檬酸裂解酶的核酸」的項目中說明的具有「本發明的上述活性」的蛋白質。在本發明中，作為與由序列號11或12表示的胺基酸序列組成的蛋白質具有同等 功能的蛋白質，可例舉以下(a)或(b)中任一項所述的蛋白質(a)蛋白質，其由序列號11或12中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附加後的 胺基酸序列組成，且具有本發明的上述活性，(b)蛋白質，其是由與序列號11或12組成的胺基酸序列有70%以上同一性的氨 基酸序列組成的蛋白質，且具有本發明的上述活性。上述內容中，對於序列號11或12中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附加的氨 基酸序列、或與由序列號11或12組成的胺基酸序列有70%以上同一性的胺基酸序列，如上 述「編碼本發明的ATP 檸檬酸裂解酶的核酸」的項目中的說明。且上述「具有本發明的上 述活性的蛋白質」，還包括由包含序列號9或10的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質的突變體、 或序列號11或12所示的胺基酸序列中通過1個或多個胺基酸發生取代、缺失或附加等的 多種修飾而產生突變的蛋白質、或胺基酸側鏈等被修飾的修飾蛋白質、與其他蛋白質融合 的蛋白質，且是具有ACL活性的蛋白質。另外，本發明的蛋白質也可人工製備，此時可通過Fmoc法(9_芴甲氧羰基法)、 tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化學合成法製造。也可利用Advanced ChemTech公司制、珀 金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia 公司制、ProteinTechnology Instruments 公 司制、Synthecell-Vega公司制、PerS印tive公司制、島津製作所制等的肽合成儀進行化學合成。ACL的核酸的克降本發明的ACL的核酸，例如可通過使用適合的探針從cDNA文庫中篩選來進行克 隆。且可使用適合的引物通過PCR反應擴增，通過與適合的載體連接來進行克隆。並且也 可亞克隆到其他載體中。例如也可使用 pBlue_Script SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp (TM Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2. 1-T0P0 (Invitrogene)等市售的質粒載體。且用 PCR反應擴增時，引物也可使用上述序列號5或6等所示的鹼基序列的任何部分。且使上 述引物及鹼基序列聚合酶等與由高山被孢黴(Malpina)菌體製備的cDNA作用而進行PCR 反應。上述方法根據《Molecular Cloning,A Laboratory Manual 3rd ed.》(Cold Spring HarborPress(2001))等，只要是本領域技術人員均可容易地進行，作為本發明的PCR反應 條件，例如可例舉為以下條件變性溫度90 95 °C退火溫度40 60°C延伸溫度60 75 °C循環數10次以上所得到的PCR產物的純化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、 QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP_IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等 試劑盒的方法、使用DEAE-纖維素濾紙的方法、使用透析管的方法等。使用瓊脂糖凝膠時， 可進行瓊脂糖凝膠電泳，將鹼基序列片段從瓊脂糖凝膠切出，通過GENECLEAMFimakoshi)、 QIAquick Gel extraction Kits (QIAGEN)、Freeze&Squeeze 法等純化。克隆後的核酸的鹼基序列可使用鹼基序列測序儀來確定。ACL表達用載體構建及轉化體的製備本發明還提供含有編碼本發明的MaACLl及MaACL2的核酸的重組載體。本發明還 進一步提供由上述重組載體轉化的轉化體。此種重組載體及轉化體可如下獲得。即將具有編碼本發明的ACL的核酸的質粒用 限制性內切酶酶切。且也可通過T4聚合酶處理將末端平滑化。將酶切後的DNA片段通過 瓊脂糖凝膠電泳純化。通過將此DNA片段使用公知的方法整合進表達用載體，可得到ACL 表達用載體。將此表達載體導入宿主製備轉化體，用於目的蛋白質的表達。此時，表達載體及宿主只要可表達目的蛋白質，無特別限定，例如宿主可例舉 真菌、細菌、植物、動物或它們的細胞等。作為真菌，可例舉為脂質生產菌高山被孢黴 (M. alpina)等的絲狀菌、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。且作為細菌， 可例舉大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。且作為植 物可例舉菜籽、大豆、棉花、紅花、亞麻等的油料作物。作為脂質生產菌，例如可使用MYC0TAX0N, VolXLIV, No. 2，pp. 257-265(1992)中 記載的菌株，具體地說，可例舉為屬於被孢黴屬(Mortierella)的微生物，例如長孢被 孢黴(Mortierella elongata) IF08570、微小被孢黴(Mortierella exigua) IF08571、 Mortierella hygrophila IF0594U 冑 Lij ■ ffi # (Mortierella alpina) IF08568> ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219. 35、CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、CBS608. 70、CBS754. 68 等屬於被孢黴亞屬(subgenus Mortierella)的微生物，或深黃被孢黴(Mortierella isabellina)CBS194. 28、IF06336、 IF07824、IF07873、IF07874、IF08286、IF08308、IF07884、Mortierella nanaIF08190、拉曼 被孢黴(Mortierella ramanniana) IF05426、IF08186、CBS112. 08、CBS212. 72、IF07825、 IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢黴(Mortierella vinacea)CBS236. 82 等的屬於 Micromucor亞屬(subgenusMicromucor)的微生物等。尤其優選高山被孢黴(Mortierella alpina)。以真菌類為宿主使用時，本發明的核酸優選在宿主中可自主複製、或者是可插入 該菌染色體上的結構。與此同時，優選是含有啟動子、終止子的構成。使用高山被孢黴 (M. alpina)為宿主時，作為表達載體，例如可例舉pD4、pDuraSC、pDura5等。作為啟動子，只 要可在宿主中表達，可使用任何啟動子，例如可使用histonM. 1基因啟動子、GAPDH(3-磷 酸甘油醛脫氫酶)基因啟動子、TEF翻譯延伸因子(Translation elongation factor)基 因啟動子等的來自高山被孢黴(M. alpina)的啟動子。作為向高山被孢黴(M. alpina)等絲狀菌內導入重組載體的方法，例如可例舉為 電穿孔法、原生質球法、基因槍轟擊法及向核內的DNA直接顯微注射法等。使用營養缺陷型 的宿主株時，通過選擇在缺少其營養素的選擇培養基上生長繁殖的菌株，可獲得轉化株。此 外，使用抗藥性標記基因進行轉化時，在包含其藥劑的選擇培養基上培養，可得到具有抗藥 性的細胞菌落。以酵母為宿主使用時，作為表達載體，例如可例舉pYE22m等。且也可使用 pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表達用載體。另外，作為適用於本發 明的宿主，可例舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeEH13_15 株)(trpl, MAT a )等，但 不限於此。作為啟動子，例如可使用GAPDH啟動子、gall啟動子、gallO啟動子等來自酵母 等的啟動子。向酵母內導入重組載體的方法，例如可例舉醋酸鋰法、電穿孔法、原生質球法、葡 聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、脂質體中的多核苷酸 (單數或多數)的包裹、及向核內直接顯微注射DNA等。以大腸桿菌等的細菌為宿主使用時，作為表達載體，例如可例舉Pharmacia公司 的pGEX、pUC18等。作為啟動子，例如可使用trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子、冊啟動子 等來自大腸桿菌、噬菌體等的啟動子。作為向細菌內導入重組載體的方法，例如可使用電穿 孔法、氯化鈣法。本發明的脂肪酸或脂質的製造方法本發明提供由上述轉化體製造脂肪酸或脂質的方法。即由培養上述轉化體而獲 得的培養物製造脂肪酸或脂質的方法。具體可用以下方法製造。但是，對於本製造方法來 說，並不限於該方法，也可採用通常公知的其他方法進行。用於培養使ACL表達的生物的培養基只要是具有適當的pH及滲透壓，含有各宿主 增殖所必需的營養素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培養液(培養基)，可使用任何 培養液。例如，轉化高山被孢黴(M. alpina)以使ACL表達時，可使用以下所記的組成的培 養基等，但不限定於此。
0179](1)1.8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄欖油、0.01%4(^1 11101(增稠劑)、0.3%KH2P04、0. 1% Na2S04、0. 05% CaCl2 2H20、0. 05% MgCl2 6H20、pH6. 0)(2)GY培養基(2.0%葡萄糖、1.0%酵母浸膏)培養條件只要是適合宿主增殖、且適於生成的酶保持穩定的條件，可以為任意的 條件，具體可調節厭氧度、培養時間、溫度、溼度、靜置培養或振蕩培養等各種條件。培養方 法可以為同一條件下的培養(一級培養)，也可以為使用2個以上不同的培養條件即二級培 養或三級培養，進行大量培養時，優選培養效率良好的二級培養等。以下，作為本發明的脂肪酸的具體製造方法，以使用高山被孢黴(M. alpina)作為 宿主進行培養為例進行說明。即將導入了本發明的MaACLl或MaACL2的轉化株接種於GY 培養基上，28°C下開始振蕩培養。而且，在培養過程中的第3天，將20%葡萄糖溶液以培養 液的20分之1的量添加，進行共計8天以上的振蕩培養。本發明的脂肪酸或脂質可用以下方法提取。但是，關於本製造方法並不限於該方 法，也可使用通常的公知的其他方法。具體地說，可根據本發明從轉化的菌體中如下提取。 有關生物(例如脂質生產菌或酵母)的轉化株，培養終止後，根據離心分離法、過濾等的通 常方法得到培養菌體。充分水洗菌體，優選乾燥。乾燥可通過冷凍乾燥、風乾等進行。將幹 燥菌體根據需要通過珠磨機、超聲波等破碎後，優選在氮氣流下通過有機溶劑提取処理。作 為有機溶劑可使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或也可使用甲醇及石油 醚的交替提取或氯仿_甲醇-水的單相系溶劑的提取，均可獲得良好的結果。通過在減壓 下從提取物中蒸餾除去有機溶劑，可得到含有脂肪酸的脂質。而且，從含有上述脂肪酸的脂質中分離脂肪酸，可在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯 的狀態下，通過進行通常方法(例如、尿素附加法、冷卻分離法、柱色譜法等)的濃縮分離來 進行。根據本發明的脂質或脂肪酸的製造方法，通過使菌體的脂肪酸含有率增加，從而 可高效地生產脂肪酸。作為本發明的脂肪酸的製造方法的一例，實際作為宿主使用高山被孢黴 (M. alpina)，製備導入了本發明的MaACLl或MaACL2的轉化株，實際提取脂肪酸時，與未轉 化ACL的對照株相比，菌體的脂肪酸含有率提高了約1. 1倍。本發明的脂肪酸或脂質本發明還提供在本發明的MaACLl或MaACL2表達的細胞中的脂肪酸及脂質。脂肪 酸可為游離脂肪酸，也可為甘油三酯、磷脂等。本說明書中，「脂肪酸」是指用通式R00H(R為烷基)表示的長鏈烴的鏈狀或分 支狀的單羧酸。例如可例舉肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14 0)、肉豆蔻烯 酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14 1)、棕櫚酸(十六烷酸)(16 0)、棕櫚油酸 (9-十六碳烯酸)(16 1)、硬脂酸(十八烷酸)(18 0)、油酸(順式-9-十八碳烯酸) (18 1(9))、異油酸(11-十八碳烯酸)(18 1(11))、亞油酸(順式，順式_9，12十八碳二 烯酸)(18 2(9，12))、a-亞麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18 3 (9，12，15))、Y -亞 麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18 3(6，9，12))、亞麻油酸(516&1^(1011化 acid) (6，9，12， 15-十八碳四烯酸)(18 4 (6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20 0)、8，11_ 二十碳二 烯酸(20 2(8，11))、Mead 酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20 3 (5，8，11))、二高 Y -亞 麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20 3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14_ 二十碳四烯酸)(20 4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20 4(5，11， 14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20 5 (5，8，11，14，17))、山嵛酸 (二十二烷酸)(22 0)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22 4 (7，10，13，16))、4，7，13，16， 19-二十二碳五烯酸(22 5 (4，7，13，16，19))、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22 5(4， 7，10，13，16))、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22 6(4,7,10，13，16，19))、木質素酸 (二十四烷酸)(24 0)、神經酸(順式-15-二十四碳單烯酸)(24 1)、蠟酸(二十六烷 酸)(26 0)等，但並不限於這些。此外，上述物質名稱是採用IUPAC生物化學命名法定義 的通用名稱，括號內記載了系統名稱以及表示碳原子數量和雙鍵位置的數值。本說明書中，「脂質」是指含有脂肪酸和醇形成酯鍵的化合物(例如甘油酯)或其 類似物(例如膽固醇酯)等的單純脂質、單純脂質的一部分進一步與磷酸、胺基酸、糖等結 合形成的複合脂質、及上述脂質的水解物中不溶於水的衍生脂質。本發明的脂肪酸組合物只要是上述脂肪酸中的1種或1種以上的脂肪酸的組合， 可以是由任意數量、任意種類的脂肪酸形成的組合物。含有本發明的脂肪酸或脂質的食品等此外，本發明提供含有上述脂肪酸或脂質的食品。本發明的脂肪酸或脂質，根據通 常方法，例如可用於含有油脂的食品、工業原料(化妝料、醫藥(例如皮膚外用藥)、肥皂等 的原料)的製造等用途中。作為化妝料(組合物)或醫藥(組合物)的劑型，可例舉溶液 狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意的劑型，但並不限於這些。此外，作為食品的形態， 可例舉膠囊等醫藥製劑的形態，或在蛋白質、糖類、脂肪、微量元素、維生素類、乳化劑、香料 等中配合了本發明的脂肪酸或脂質的自然流食、半消化狀態營養食品以及成分營養食品、 保健飲料、經腸營養劑等加工形態。進而，作為本發明的食品例，可例舉營養補充食品、保健食品、功能性食品、幼兒用 食品、嬰兒用配方乳、早產兒用配方乳、老人用食品等，但不限於這些。在本說明書中，食品 是固體、流體及液體以及這些的混合物且可攝取食用的食物的總稱。營養補充食品是指強化了特定營養成分的食品。保健食品是指用於保健的或對健 康有益的食品，包括營養補充食品、天然食品、減肥食品等。功能性食品是指用來補充可發 揮機體調節功能的營養成分的食品，與特定保健用途的食品含義相同。幼兒用食品是指供 給約6歲以下兒童的食品。老人用食品是指與未加處理的食品相比，處理成易消化及吸收 的食品。嬰兒用配方乳是指供給約1歲以下兒童的配方乳。早產兒用配方乳是指供給早產 兒出生後到約6個月為止所用的配方乳。作為這些食品，可例舉肉、魚、果仁等天然食品(用油脂處理過的食品)衝華料 理、拉麵、湯等製作時加入油脂的食品；天麩羅、油炸食品、油炸豆腐、炒飯、炸面圈、油炸糖 點心等用油脂作熱介質的食品；黃油、人造黃油、沙拉醬、調味汁、巧克力、方便麵、奶糖、餅 幹、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工時加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬餅乾、豆 沙麵包等加工完成時用油脂噴霧或塗布的食品等。但是，本發明的食品並不限於含油脂的 食品，例如可例舉麵包、麵條類、米飯、點心類(糖果、口香糖、橡皮糖、壓片糖、日式點心)、 豆腐及其加工品等農產食品；清酒、藥用酒、甜料酒、食用醋、醬油、黃醬等發酵食品；酸奶、 火腿、培根、香腸等畜產食品；魚糕、炸魚糕、魚肉山芋餅等水產食品；果汁飲料、清涼飲料、 運動飲料、酒精飲料、茶等。
wmm^mnm acl的核酸或acl蛋白質的菌株的i平價 詵擇方法本發明還提供使用編碼本發明的ACL的核酸或ACL蛋白質來進行脂質生產菌的評 價、選擇的方法。具體如下所示(1)評價方法作為本發明的一個實施方式，可例舉使用編碼本發明的ACL的核酸或ACL蛋白質， 進行脂質生產菌評價的方法。作為本發明的上述評價方法，首先可例舉使用基於本發明的 鹼基序列設計的引物或探針，對作為被測菌株的脂質生產菌株的本發明的上述活性進行評 價的方法。此種評價方法的通常方法為公知，例如在國際專利申請指南W001/040514號、日 本特開平8-205900號公報等中均有記載。以下對該評價方法進行簡要說明。首先製備被測菌株的基因組。製備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等任何公知 的方法(例如參照 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring HarborLaboratory Press, pl30(1990))。基於本發明的鹼基序列、優選基於序列號9或10設計引物或探針。上述引物或探 針可使用本發明鹼基序列的任意部分，且其設計可使用公知方法進行。作為引物使用的多 核苷酸的鹼基數，通常為10個鹼基以上，優選為15 25個鹼基。此外，夾在兩引物間的鹼 基數通常以300 2000鹼基為宜。使用上述製備的引物或探針，檢測上述被測菌體的基因組中是否存在本發明鹼基 序列的特異性序列。本發明鹼基序列的特異性序列的檢測可採用公知方法進行。例如，將 含有本發明鹼基序列的特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述鹼基序列的 互補鹼基序列的多核苷酸作為一個引物使用，另一個引物使用含有該序列的上遊或下遊序 列的一部分或全部的多核苷酸、或含有上述鹼基序列的互補鹼基序列的多核苷酸，例如通 過PCR法等擴增被測菌株的核酸，可測定擴增產物的有無、擴增產物分子量的大小等。適合本發明方法的PCR法的反應條件無特別限定，例如可例舉以下條件，變性溫度90 95 °C退火溫度40 60°C延伸溫度60 75 °C循環數10次以上等條件。將得到的反應生成物DNA片段通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進行分 離，可測定擴增產物的分子量。因此通過確認擴增產物的分子量是否是含有相當於本發明 鹼基序列的特異性區域的核酸分子的大小，可預測或評價被測菌株的本發明的上述活性。 而且通過用上述方法等分析上述擴增產物的鹼基序列，還可進一步更正確地預測或評價本 發明的上述活性。另外，本發明的上述活性的評價方法如上所述。作為本發明的上述評價方法，通過培養被測菌株，測定序列號9或10等本發明的 鹼基序列編碼的ACL的表達量，可評價被測菌株的本發明的上述活性。且ACL的表達量， 可通過在適當條件下培養被測菌株，對ACL的mRNA或蛋白質定量來測定。mRNA或蛋白質 的定量，可使用公知的方法進行。mRNA的定量，例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR 進行，蛋白質的定量例如可通過Western印跡法進行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。此外，作為上述活性的評價方法，也可例舉測 定本發明ACL產生的脂肪酸組合物的組成的方法。脂肪酸組合物的組成的測定方法如上所述。⑵選擇方法作為本發明的其他實施方式，可例舉使用編碼本發明的ACL的核酸或ACL蛋白質 進行脂質生產菌選擇的方法。作為本發明的上述選擇方法，通過培養被測菌株，測定序列 號9或10等本發明的鹼基序列編碼的ACL的表達量，選擇目的表達量的菌株，可選擇出具 有期望活性的菌株。此外，設定作為標準的菌株，分別培養該標準菌株和被測菌株，測定各 菌株的上述表達量，比較標準菌株和被測菌株的表達量，也可選擇出所期望的菌株。具體地 說，例如可在適當的條件下培養標準菌株和被測菌株，測定各菌株的表達量，通過選擇與標 準菌株相比被測菌株為高表達或低表達的被測菌株，來選擇具有期望活性的菌株。對於所 期望的活性，如上所述，可例舉測定ACL的表達量及ACL產生的總脂肪酸量的方法。且作為本發明的上述選擇方法，通過培養被測菌株，選擇本發明的上述活性高或 低的菌株，也可選擇出具有期望活性的被測菌株。對於所期望的活性，如上所述，可例舉測 定ACL的表達量及ACL產生的總脂肪酸量的方法。作為被測菌株或標準菌株，例如可使用上述導入本發明的載體的菌株、上述本發 明的核酸表達受到抑制的菌株、進行了誘變處理的菌株、自發突變的菌株等，但並不限於 此。且本發明的ACL活性例如可通過本說明書中的「編碼本發明的ATP 檸檬酸裂解酶的核 酸」項目中記載的方法進行測定。誘變處理例如可例舉紫外線照射、放射線照射等的物理方 法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處理的化學方法等(如參照大嶋 泰治編著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法、P67-75、學會出版中心等)(大嶋泰 治編著、生物化學実験法39酵母分子遺伝學実験法、p67-75、學會出版力 >々一)。但不限 於此。此外，作為本發明的標準菌株、被測菌株使用的菌株，可例舉上述脂質生產菌或酵 母等，但並不限於此。具體地說，標準菌株、被測菌株可將屬於不同屬、種的任意菌株組合使 用，被測菌株也可同時使用1種或1種以上的菌株。實施例以下根據實施例更加具體地說明本發明，但本發明並不限於這些實施例。實施例1(1) EST 分析將高山被孢黴(M. alpina) 1S_4株接種到100ml的培養基(1. 8%葡萄糖、酵母 浸膏、PH6.0)衝，在28°C下預培養3天。在10L培養槽(Able Co.，東京)中加入5L培養 基(1. 8%葡萄糖、大豆粉、0. 橄欖油、0. 01% Adekanol (增稠劑)、0. 3%KH2P04,0. 1% Na2S04、0. 05 % CaCl2 2H20、0. 05 % MgCl2 6H20、pH6. 0)，接種全部預培養物，在 300rpm、 lvvm、26°C的條件下通氣攪拌培養8天。在培養的第1、2及3天分別添加相當於2%、2%及 1. 5%的葡萄糖。在培養的第1、2、3、6及8天的各階段回收菌體，用鹽酸胍/氯化銫法製備 總 RNA。使用 01igotex-dT30mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，從總 RNA 中純 化 poly(A)+RNA。使用 ZAP-cDNA Gigapacklll Gold Cloning Kit (STRATAGENE)構建各階 段的cDNA文庫，進行從cDNA的5，端開始的一步法測序分析(8000克隆X5步)。將得到 的序列進行聚類，其結果，得到約5000的序列。(2)ATP 檸檬酸裂解酶基因同源基因的搜索
將通過EST分析得到的鹼基序列相對於在GENEBANK註冊的胺基酸序列使用同源 性搜索程序BLASTX進行搜索，提取出ATP 檸檬酸裂解酶基因的同源基因。其結果，發現了 序列號1、序列號2、序列號3、序列號4的4個ACL同源基因序列。序列號1和3有同源性，與 來自粗糙鏈孢黴(Neurosporacrassa)的類似ATP 檸檬酸裂解酶亞基1的推定蛋白質的相 同區域匹配，且序列號2和4也具有同源性，與來自大孢糞殼黴菌(Sordaria macrospora) 的類似ATP 檸檬酸裂解酶亞基1的推定蛋白質的相同區域匹配。即可認為本菌株有至少2 個以上的ATP 檸檬酸裂解酶同源基因。將構成各序列的克隆數與得到該克隆數的文庫的 關係表示於表2。表2 實施例2(l)ACL同源基因的克降因序列號1 4的任一個中均不存在認為是編碼ACL的⑶S，所以，為克隆編碼這 些基因全長的cDNA，根據各個序列，如下製備引物。根據序列號2設計引物引物 422-1 :GATACCGTCGTCAACTTTGCCTC(序列號 18)引物 422-2 CATCTTGCAGTTGGGGTCCCGCT (序列號 19)根據序列號4設計引物引物 424-1 GTTGACACCGTGGTGAACTTTGCC (序列號 20)引物 424-2 :GCATCTTGCACCCGGATCCTTCTC (序列號 21)使用這些引物，以包含構成各個序列號2及4的EST的cDNA文庫為模板， 使用ExTaq (TaKaRa Bio)進行PCR反應。將所得到的DNA片段使用T0P0_TAcloning Kit(INVITR0GEN CORPORATION)進行TA-克隆，確定各個插入部分的鹼基序列。其結果，確認出包含序列號2的第3位 第443位、序列號4的第6位 第449位 的鹼基序列的DNA片段被分別克隆，這些質粒分別為pCR-422-P及pCR-424-P。
而後，以這些質粒為各自的模板，使用上述引物進行PCR反應。反應中雖然使用了 ExTaq (TaKaRa Bio)，但用PCR標記用混合物(Roche Diagnostics公司)代替附帶的dNTP 混合物，將擴增的DNA用地高辛(DIG)標記，製備用於篩選cDNA文庫的探針。使用該探針， 篩選EST分析中得到構成各個序列的EST的cDNA文庫。雜交條件如下。緩衝液5xSSC、l%SDS、50mM Tris-HCl (pH7. 5)、50% 甲醯胺；溫度42°C(—夜)；洗滌條件0.2x SSC、0. 1 % SDS 溶液中(65°C )、20 分鐘 X 3 次;檢測，使用DIG核酸檢測試劑盒(Roche Diagnostics公司)進行。從經過篩選得 到的噬菌體克隆中，通過體內切割切出質粒，確定插入部分的鹼基序列。將用各個探針的篩 選中得到的插入部分最長的質粒分別作為pB-ACLl及pB-ACL2。將pB-ACLl、pB_ACL2的插 入部分的鹼基序列分別用序列號5、序列號6及圖1、圖2表示。序列號5中包含由3540bp 組成的⑶S(序列號7)，此外，序列號6中還包含由3525bp組成的⑶S(序列號8)。即認為 得到了編碼ATP:檸檬酸裂解酶同源基因全長的各個cDNA。將這些基因分別命名為MaACLl、 MaACL2。將由這些基因編碼的蛋白質(MaACLlp及MaACL2p)的推定胺基酸序列分別表示於 序列號11及序列號12。(2)序列分析MaACLl基因和MaACL2基因具有同源性，用⑶S比較時，同一性為79. (圖3)。 此外，比較推定胺基酸序列時，同一性為87. (圖4)。另一方面，相對於NCBI的蛋白質 序列資料庫(nr)進行Blast搜索時，同一性最高的是來自擔子菌玉蜀黍黑粉菌(U. maydis) 的類似ACL的推定蛋白質(gi46096782)，胺基酸序列的同一性MaACLl為61. 6%、MaACL2
為61. 9 %。而且來自小鼠(gi_29293809)、人(gi_38569421)、黑腹果蠅
(gi28372804)、線蟲(gi_17551266)等動物的ACL或類似ACL的推定蛋白質序列也顯
示出更低但為一定的同一性(圖5)。實施例3(1)酵母表達載體的構建為使MaACLl及MaACL2在酵母中表達，如下構建酵母表達用載體。首先，以質粒 pB-ACLl 為模板，通過引物 ACL1F-EX、引物 ACL1R-HS，使用 ExTaq(TaKaRa Bio)來進行。引物 ACL 1F-EX :GAATTCTCTAGAATGTCTGCTAAAGCCGTTCGCG (序列號 22)引物 ACL 1R-HS :AAGCTTGTCGACTTAGGCCTTCTTGTTGATCG (序列號 23)將PCR產物用限制性內切酶EcoRI和Hindlll酶切。將所得到的DNA片段插入載 體PUC18的EcoRI-Hindlll位點，得到質粒pUC-ACLl。將其用限制性內切酶EcoRI和Sail 酶切，將酶切後得到的約3. 5kbp的DNA片段插入載體pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem.， 59，ppl221-1228，(1995))的 EcoRI-Sall 位點，得到質粒 pYEMaACLl。另一方面，將質粒 PB-ACL2用限制性內切酶NotI和Sal I酶切、或用限制性內切酶Sal I和Kpnl酶切，分別得到 約2. 7kbp和約lkbp的DNA片段。將pYE22m用限制性內切酶EcoRI酶切，用DNA Blunting Kit (TaKaRa Bio)進行末端平滑化後，插入NotI接頭(pd (GCGGCCGC))，得到載體pYE22mN。 將此載體pYE22mN用限制性內切酶NotI和Kpnl酶切，連接上述得到的ACL2的Notl-Sall 片段和Sall-Kpnl片段，得到質粒pYEMaACL2。
(2)酵母的轉化分別使用質粒p YE22m、pYEMaACLl或pYEMaACL2，通過醋酸鋰法，轉化釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)EH13-15 ^ (trpl, MAT a)(Appl. Microbiol. Biotechnol.， 30,515-520, (1989))。轉化株選擇在SC_Trp [每1升中，無胺基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFC0)為6. 7g、葡萄糖為20g、胺基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽 1. 25g、精氨酸0. 6g、天冬氨酸3g、穀氨酸3g、組氨酸0. 6g、亮氨酸1. 8g、賴氨酸0. 9g、蛋氨 酸0. 6g、苯丙氨酸1. 5g、絲氨酸11. 25g、酪氨酸0. 9g、纈氨酸4. 5g、蘇氨酸6g、尿嘧啶0. 6g 的混合物)為1.3g]瓊脂培養基(2%瓊脂)上生長繁殖的菌株。實施例4(1)酵母的培養選擇各個載體轉化的轉化株中的任意2株(c-1株、c-2株、MaACLl-1株、MaACLl_2 株及MaACL2-l株、MaACL2-2株)，用以下條件培養。即作為預培養，從平板上取1白金耳 酵母接種到SC-Trp培養基10ml中，在30°C下振蕩培養2天。主培養是在SC_Trp培養基 100ml中添加預培養液lml，30°C下振蕩培養1天。(2)酶液的製備將培養液通過離心分離進行集菌，用1/2量的滅菌水洗滌。用提取緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8. 0)、lmM EDTAUOmM DTTUmM PMSF) 5ml 懸浮，使用弗式壓碎器用 16kPa 破碎 菌體。20，000xg、4°C下離心分離10分鐘，回收上清。供與填充了 Shehadex G_25的PD-10 色譜柱(GE HEALTHCAREBIO-SCIENCES 公司)，用洗脫緩衝液(10mM 磷酸鈉(pH7.4)、lmM MgCl2、0. ImM EDTAUmM DTT)洗脫，作為酶液。(3) ACL活性測定ACL活性通過測定以下由ACL催化反應而產生的草醯乙酸量、由蘋果酸脫氫酶催 化反應而減少的NADH量在A34(1處的變化(6. 22mM"1cm"1)來求出。式2<ACL催化的反應〉檸檬酸+CoA+ATP—草醯乙酸+ADP+Pi+乙醯CoA草醯乙酸+NADH—蘋果酸 +NAD+反應液的組成為10mM Tris-HCl (pH8. 4)、10mM MgCl2、ImM DTT、lOmM ATP、lOmM 檸 檬酸、0. 2mM CoA、6單位蘋果酸脫氫酶、0. ImM NADH、50 yl酶液，總量為1ml。添加CoA使反 應開始。反應在28 °C下進行。結果如表3所示。表明與c-1株、c-2株相比，MaACLl-1株、MaACLl-2株及MaACL2_l 株、MaACL2-2株中ACL活性高，MaACLl基因及MaACL2基因的產物具有ACL活性。表3MaACL活性測定 而後，考察MaACLl的Mg2+濃度依賴性。即在上述ACL反應液中，使MgCl2濃度為 5mM、10mM、20mM、40mM，同樣進行測定。將MgCl2濃度為10mM時的活性作為1的相對活性表 示於圖6。如圖6所示，ATP 檸檬酸Mg2+的比大約為1 1 1時，ACL1顯示最大活性。實施例5(1)被孢黴的基因組文庫的構津將高山被孢黴(M. alpina) 1S_4株接種於100ml的液體培養基(1%葡萄糖、0. 5% 酵母浸膏、PH6.0)中，28°C下振蕩培養4天。通過過濾器過濾收集菌體，用CTAB法提取基 因組DNA。將約200g所得到的基因組DNA用限制性內切酶Sau3AI進行部分分解，使切割DNA 的分布中心在20kb附近。所得到的DNA片段進行10% -40%的蔗糖密度梯度離心(轉子 SW28 (Beckman)、25，OOOrpm、10°C、24 小時)，使用 AUTOMATIC LIQUID CHARGER(ADVANTEC 公 司)和MICRO TUBE PUMP (EYELA公司)，每次分離1ml。純化在20kbp附近有分布中心的組 分。將如此得到的基因組DNA片段使用入BlueSTAR/BamHI載體試劑盒(N0VAGEN公司)制 備基因組文庫。(2)URA5基因組DNA的克降作為標記基因，為使用來自被孢黴的URA5基因，將含有該基因的啟動子及終止 子區域的基因組DNA如下進行克隆。即以來自被孢黴的URA5基因的cDNA序列(Biosci Biotechnol Biochem.，68，pp277_285 (2004))為基礎製備探針，從被孢黴的基因組文庫中 進行篩選，以確定含有該基因的約2. lkbp的鹼基序列(序列號13)。(3)GAPDH同源基因基因組DNA的克降為使導入基因在被孢黴中進行組成型高表達，克隆已知在許多生物中組成型高表 達的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的同源基因。以實施例1的EST中發現的GAPDH 同源基因序列(序列號14)為基礎製備引物ATGACCATCAAGATCGGCATCA(序列號24)和引 物TTAAGCATGATCCTTCTTGGCC(序列號25)。使用這些引物，以被孢黴的cDNA為模板，用與 實施例2同樣的方法製備探針，從基因組文庫中進行篩選，以確定包含GAPDH同源基因的約 3kbp的鹼基序列(序列號15)。實施例6被孢黴表汰載體的構建高山被孢黴(M. alpina)的GAPDH的結構基因上遊0. 9kb的區域使用弓丨物 AAGCTTGATCACGTCGGGTGATGAGTTGCTGTTGAC (序列號 26)、弓丨物 GAATTCGATGTTGAATGTGTGGTGTG (序列號 27)，此外，下遊0. 5kb的區域使用弓丨物 TCTAGATAAGAAAAGGGAGTGAATCG (序列號 28)、弓丨物 GCGGCCGCGATCCATGCACGGGTCCTTC (序列號 29)，分別進行 PCR 擴增，進行GAPDH啟動子(序列號16)、GAPDH終止子(序列號17)的克隆。將這些用分別附加於引物 上的 Hindlll 和 EcoRI 及 Xbal 和 NotI 酶切，分別插入 pBluescriptllSK-(Stratagene)上 的Hindlll/EcoRI位點和Xbal/NotI位點。而且，將此質粒的Apal位點進行平滑化，將質粒 pD4(Appl EnvironMicrobiol.，66，pp4655_4661 (2000))用 Xbal 和 Hindlll 酶切後進行平 滑化而得到的18SrDNA(0. 9kb)進行整合，製備質粒pBGptR。將含有高山被孢黴(M. alpina) 的Ura5基因的啟動子 終止子的基因組DNA的Sail酶切片段(2. lkb)插入pBGptR的Xhol 位點，製備載體PH001。而且，為使PUFA有用基因容易導入，在GAPDH啟動子和終止子之間 插入多克隆位點，所以，在將pHOO 1的GAPDH啟動子的5』末端側的HindllI位點和GAPDH 終止子的3』末端側的NotI位點用各限制性內切酶酶切後進行平滑化，而後通過自我連接， 將Hindlll和NotI的位點分2階段破壞，以構建載體pH002。使多克隆位點製備用寡核苷 酸SC/MCS-F2 :5，-ctagcgcggccgcctcgagaagcttcccggggcatgcctgcagtctagag(序列 號30)和SC/MCS-R2 :5，-aattctctagactgcaggcatgccccgggaagcttctcgaggcggccgcg(序列 號31)互補退火而製成的EcoRI/Nhel突出片段插入pH002的EcoRI/Xbal位點，構建載 體PH003。在載體pH003中，作為多克隆位點，可使用EcoRI .Xbal .Pstl .Sphl .Smal Hindll I .Xbal .NotI。而後，在pUC19的EcoRI位點和HindllI位點的各個外側的2處，導入8鹼基 識別的限制性內切酶AscI位點，構建用AscI酶切使插入區域整體切出的載體pUCAA。將此 pUCAA用EcoRI/Hindlll酶切後進行平滑化時，插入將pH003進行BssHII部分酶切後得到 的插入片段(4. 4kb)進行平滑化後的產物，以製備載體PH004。將pH004用EcoRI部分酶切 後進行平滑化後的產物連接，破壞BssHII旁側的EcoRI位點，構建作為自我克隆用的基本 載體的pDuraSC。為使MaACLl及MaACL2在被孢黴中高表達，如下構建被孢黴表達載體。將質粒 PUC-ACL1用限制性內切酶Xbal和Hindlll酶切後得到的約3. 5kbp的DNA片段插入載體 pDuraSC的XbaI_SalI位點，構建質粒pDuraSC_ACLl。另一方面，將載體pDuraSC用限制性 內切酶EcoRI酶切並用Blunting Kit進行末端平滑化後用Xhol酶切後的產物、與將質粒 PB-ACL2用限制性內切酶NotI酶切用Blunting Kit進行末端平滑化後用Xhol部分分解而 得到的約3. 5kbp的片段連接，構建質粒pDuraSC-ACL2。實施例7被孢黴的轉化使用質粒pDuraSC-ACLl或質粒pDuraSC_ACL2，以從高山被孢黴(M. alpina)中 根據專利文獻(W02005019437 「脂質生產菌的育種方法」)方法誘導的尿嘧啶缺陷型株 Aura-3作為宿主，用基因槍法進行轉化。轉化株的選擇中，使用SC瓊脂培養基
。實施例8
轉化被孢黴的評價(1)使用質粒pDuraSC-ACLl的轉化株將所得到的轉化株接種到4ml GY培養基(葡萄糖2%、酵母浸膏1 % )中，28°C下 振蕩培養3天或4天。通過過濾回收菌體，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通 過 SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR(Invitrogen)合成 cDNA,而 後使用弓丨物 GCGTCATCCCCACCACTGTT (序列號 32)、引物 GCTGGCGGGAGGAGTGCCAGCACG (序列號 33)進行 RT-PCR。其結果，在各個轉化株中篩選ACL1表達量多的菌株。將這些菌株接種於2%葡萄 糖、酵母浸膏的液體培養基中，28°C下振蕩培養。培養過程中的第3天，添加培養液的 20分之1量的20%葡萄糖溶液。培養過程中的第4、6、7、8天，回收菌體的一部分，冷凍幹 燥。使菌體的脂肪酸衍生為甲酯後，用己烷提取，蒸餾除去己烷，通過氣相色譜法進行分析， 對菌體中的脂肪酸量進行定量。其結果如圖7所示。如上所述，使MaACLl基因高表達的被孢黴菌株與野生株相比，可提高培養後期的 菌體內油脂含量。(2)使用質粒DDuraSC_ACL2的轉化株將所得到的轉化株在SC瓊脂培養基上進行繼代培養，篩選9株生長繁殖良好的菌 株。進一步將上述篩選出的菌株接種於GY培養基(2%葡萄糖、酵母浸膏)4ml中，28°C 下振蕩培養4天。通過過濾回收菌體，進行冷凍乾燥。取乾燥菌體的一部分(約10-20mg 左右)，通過鹽酸甲醇法使菌體的脂肪酸衍生為甲酯後，用己烷提取，蒸餾除去己烷，通過氣 相色譜法進行分析。其結果，篩選菌體內脂肪酸含有率、總脂肪酸中的花生四烯酸比率高的 菌株，作為 MaACL2#l 和 MaACL2#2。將這些菌株接種於4ml GY培養基中，28°C下振蕩培養4天。過濾回收菌體，使用 RNeasy plant kit(QIAGEN) RNA。ilil SuperScript First-StrandSynthesis System for RT-PCR (Invitrogen)合成cDNA。為確認出導入的構建物中各基因的表達，以上述cDNA 為模板，用以下引物弓丨物 MaGAPDHpfw CACACCACACATTCAACATC (序列號 34)；及引物 ACL2-R5 CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTCG (序列號 35)；的組合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，進行 94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 1 分鐘為 1 個循環的25個循環的PCR反應。其結果，在這些菌株中，可確認出導入的構建物中的MaACL2 基因的表達。而且，將此2株與1S-4株接種於4ml GY培養基中(n = 3)，28°C、125rpm的條件 下振蕩培養。培養第3天，添加20%葡萄糖200 iU，進一步培養到第6天。第6天過濾回 收菌體的總量，進行冷凍乾燥。取乾燥菌體的一部分(約10-20mg左右)，通過鹽酸甲醇法 使菌體的脂肪酸衍生為甲酯後，用己烷提取，蒸餾除去己烷，通過氣相色譜法進行分析。將 菌體內的脂肪酸含有率、和每單位培養基中的花生四烯酸生產量分別歸納為以下表4及表 5。表 4菌體內脂肪酸含有率(％ )
如上所述，在使MaACL2基因高表達的被孢黴菌株中，與野生型相比，可提高菌體 內脂肪酸含有率及每單位培養基中的花生四烯酸生產量。因本發明的ACL基因可用於提高脂肪酸、脂質的生產能力，可提高在微生物、植物 中的多不飽和脂肪酸的生產率，所以優選。由此，因可提供比以往廉價且有效的脂肪酸或脂 質，所以，作為可適用於食品、化妝料、醫藥品、肥皂等中的成分而有用。序列表的自由內容
序列號18引物
序列號19引物
序列號20引物
序列號21引物
序列號22引物
序列號23引物
序列號24引物
序列號25引物
序列號26引物
序列號27引物
序列號28引物
序列號29引物
序列號30引物
序列號31引物
序列號32引物
序列號33引物
序列號34引物
序列號35引物
權利要求
核酸，其特徵在於，其包含以下(a)～(e)中任一項所述的鹼基序列(a)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成，且具有ATP檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(b)鹼基序列，其與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有ATP檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(c)鹼基序列，其由與序列號9或序列號10所組成的鹼基序列有70％以上同一性的鹼基序列組成，且編碼具有ATP檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(d)鹼基序列，其編碼與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有70％以上同一性的胺基酸序列，且編碼具有ATP檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(e)鹼基序列，其與由編碼序列號11或12所示的胺基酸序列所組成的蛋白質的鹼基序列的互補鹼基序列組成的核酸在嚴謹條件下雜交，且編碼具有ATP檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。
2.根據權利要求1中所述的核酸，其包含以下(a) (c)中任一項的鹼基序列(a)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列中1 10個胺基酸 發生缺失、取代或附加的胺基酸序列組成，且具有ATP:檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(b)鹼基序列，其與由序列號9或序列號10所組成的鹼基序列的互補鹼基序列組成的 核酸在2XSSC、50°C的條件下雜交，且編碼具有ATP 檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。(c)鹼基序列，其編碼與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有90%以上同一 性的胺基酸序列，且編碼具有ATP 檸檬酸裂解酶活性的蛋白質。
3.核酸，其特徵在於，其包含以下(a) (c)中任一項所述的鹼基序列或其片段(a)鹼基序列，其如序列號9或序列號10所示。(b)鹼基序列，其編碼由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列組成的蛋白質。(c)鹼基序列，其如序列號5或序列號6所示。
4.蛋白質，其特徵在於，其如以下(a)或(b)中任一項所述(a)蛋白質，其由序列號11或序列號12中1個或多個胺基酸發生缺失、取代或附加的 胺基酸序列組成，且具有ATP 檸檬酸裂解酶活性。(b)蛋白質，其由與序列號11或序列號12所組成的胺基酸序列有70%以上同一性的 胺基酸序列組成，且具有ATP 檸檬酸裂解酶活性。
5.蛋白質，其特徵在於，其由序列號11或序列號12所示的胺基酸序列組成。
6.重組載體，其特徵在於，其含有權利要求1 3中任一項所述的核酸。
7.轉化體，其特徵在於，其中導入了權利要求1 3中任一項所述的核酸。
8.轉化體，其特徵在於，其通過權利要求6中所述的重組載體轉化。
9.根據權利要求8中所述的轉化體，其中，通過導入權利要求6中所述的載體，提高了 脂肪酸的生產能力。
10.根據權利要求7 9中任一項所述的轉化體，其特徵在於，轉化體為脂質生產菌。
11.根據權利要求10中所述的轉化體，其特徵在於，脂質生產菌為高山被孢黴。
12.脂肪酸或脂質的製造方法，其特徵在於，從培養權利要求7 11中任一項所述的轉 化體而得到的培養物中提取所述脂肪酸或脂質。
13.脂肪酸或脂質，其特徵在於，其使用權利要求12中所述的製造方法獲得。
14.食品，其特徵在於，其中含有權利要求13中所述的脂肪酸或脂質。
全文摘要
本發明提供新型ATP檸檬酸裂解酶基因。具體為，其為含有序列號5、6、9或10所示的鹼基序列或其片段的核酸。
文檔編號C12N1/15GK101855347SQ200880113428
公開日2010年10月6日 申請日期2008年10月24日 優先權日2007年10月26日
發明者落合美佐 申請人:三得利控股株式會社