抗o型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗及製備方法
2023-09-17 21:18:25
抗o型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗及製備方法
【專利摘要】抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗及製備方法，涉及口蹄疫疫苗。提供一種抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗、疫苗的胺基酸序列和DNA序列、疫苗的製備方法和應用。所述疫苗具有SEQ?ID?NO.1所示的胺基酸序列。製備方法：將MS2的成熟酶蛋白和插入O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141～160位胺基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達載體中構成如SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列；設計引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ?ID?NO.3所示的序列的反義鏈擴增出來，連接到pCDF-Duet-1表達載體的MCS1處；然後將兩個共表達載體轉化到BL21(DE3)中。
【專利說明】抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗及製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及口蹄疫疫苗，特別是涉及一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗及其製備方法。
【背景技術】
[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害70多種偶蹄目動物的一種急性、高度接觸性、熱性傳染病，以傳播迅速、感染性高而著稱。世界動物衛生組織(OIE)和許多國家都將其列為必須報告的傳染病。我國規定口蹄疫為一類動物傳染病。一旦一個地區爆發口蹄疫，如果應急不當，就會大規模地流行至許多地區或國家，這給地區或國家的畜牧業造成嚴重的危害，帶來巨大的經濟損失。
[0003]口蹄疫病毒的基因型和表型具有高變異性，主要有O型、A型、C型、Asia I型、SATI型(南非I型)、SAT II型(南非II型)、SAT III型(南非III型)等7個血清型，此外還有80多種亞型。血清型間交叉免疫現象，即使同一血清型的不同亞型的免疫情況也不相同，這給口蹄疫的防治帶來了極大的困難。
[0004]在許多國家和地區，疫苗接種是預防和控制此病的主要措施。目前廣泛使用的依然是傳統的滅活苗，它在一定程度上對口蹄疫的控制和預防起到了積極作用，極大地降低了該病帶來的經濟損失。滅活疫苗雖具有較好的免疫原性，但是也存在著不少缺點，存在很大的安全隱患，譬如生產各個環節操作要求嚴格，防止被致病物質汙染並杜絕病毒洩漏；滅活苗免疫的動物與感染FMD的動物區分不開；同時生產需要FMDV的存在。綜上所述，口蹄疫的防治需要更加安全有效的新型疫苗的出現。
[0005]類病毒顆粒(VLPs)疫苗是利用病毒載體構建的一類可以在體內和(或)體外表達成一種可以自我組裝成類病毒外殼蛋白結構的一類新型疫苗。因為這種顆粒具有大小合適，可能被免疫系統識別，進而產生免疫反應；機體內半衰期較長；沒有病毒核酸的存在，安全性高等優點，使得該疫苗的研發受到廣大疫苗開發人員的青睞。多種在開發的類病毒顆粒疫苗經實驗證實具有很不錯的免疫效果。
[0006]不同亞型的口蹄疫病毒同源性很低，口蹄疫病毒的高變異型不僅讓研發者感到頭疼，還給例行的免疫接種帶來了很多困難。口蹄疫病毒的3D基因編碼的是口蹄疫病毒RNA複製所依賴的RNA聚合酶(RdRp)，該酶不僅對口蹄疫病毒的複製起到關鍵作用(Pengyan, W.，Yanj R.，Zhiruj G.&Chuangfu，C.1nhibition of foot-and-mouth diseasevirus replication in vitro and in vivo by small interfering RNA.VirologyJoumal5，86(2008))，此外，它還沒有亞型的差異。不少的實驗證實以3D基因為靶點，可以很好地抑制口蹄疫病毒的複製(Chen，W.et al.Adenovirus-mediated RNA interferenceagainst foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in viv0.Journal of virology2006，80，3559-3566)。 申請人:針對3D基因的不同位點設計的幾個miRNA經實驗證實也能很好的降低3D基因的表達抑制口蹄疫病毒的增殖。
[0007] 申請人:前期的研究發現:如果將O型口蹄疫病毒VPl蛋白的第141-160位胺基酸的編碼基因插入到MS2外殼蛋白基因的特定位點，所表達出的O型口蹄疫的關鍵的抗原決定簇展示在MS2類病毒顆粒表面的VLPs具有很好的免疫原性，在此基礎上 申請人:又引入了一個共表達系統，一個表達載體上連接有可以自我組裝成口蹄疫類病毒顆粒疫苗的基因，另一個共表達載體上連接有針對口蹄疫病毒的增殖具有很好感染效果的3D基因的反義核酸。此共表達系統可以表達出這類類病毒顆粒蛋白:表面既展示有抗原決定簇，內部還包裹著能有效幹擾病毒複製的反義RNA。經過體內體外的研究發現，該類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗不僅可以引起機體產生有效的免疫應答，還能很快地抑制病毒在體內的增殖，有效地保護機體免受病毒侵害。
[0008]這類疫苗的首次提出不僅為口蹄疫的防治提供了一個新的希望，再經過一些改進和大型動物的實驗將其真正開發成有效的疫苗。此外該疫苗的研究還為其他病毒疾病疫苗的研發提供了可借鑑的思路。
【發明內容】
[0009]本發明的第一個目的在於提供一種能夠對口蹄疫進行預防治療的一類安全有效的抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗。
[0010]本發明的第二個目的在於提供抗O型口蹄疫的類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗的胺基酸序列和DNA序列。
[0011]本發明的第三個目的在於提供一種用於製備抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗的安全穩定的共表達系統，裡面有可以將口蹄疫抗原決定簇展示到MS2類病毒顆粒表面的原核表達載體28a-CP-VPl，和連接有可以跟MS2的外殼蛋白發生相互作用而被類病毒顆粒包裹其中的3D基因的反義核酸。
[0012]本發明的第四個目的在於提供抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗的應用。
[0013]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗具有SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列，該序列包含有MS2外殼蛋白及O型口蹄疫病毒的VPl上優勢抗原決定簇序列。所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫由SEQ ID N0.2所示的DNA序列編碼，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定族基因序列。
[0014]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗利用大腸桿菌表達，且在大腸桿菌細胞內自主包裝為類病毒顆粒結構，以類病毒顆粒形成存在。
[0015]所述抗O型口蹄 疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原決定簇外，內部還包裹著口蹄疫病毒的3D基因的反義RNA。該類病毒顆粒內包裹著各種亞型口蹄疫病毒共有的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRpWDpt51的3D基因的反義RNA。該疫苗中包裹的反義RNA序列是具有SEQ ID N0.3所示DNA序列的反義RNA序列或與之同源性較高的序列。
[0016]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗的DNA序列SEQ ID N0.2的第1254~1316位核苷酸為O型口蹄疫病毒的VPl的第141~160位抗原決定簇胺基酸對應的核苷酸；該胺基酸序列SEQ ID N0.1是將O型口蹄疫病毒VPl的第141~160位優勢抗原決定簇胺基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位胺基酸後面。[0017]用於製備抗O型口蹄疫的多肽-核酸類病毒顆粒雙效疫苗的兩種共表達載體，一種表達載體含有SEQ ID N0.2所示的DNA序列，或含有與SEQ ID N0.2所示的的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列的DNA序列，另一種表達載體含有SEQ ID N0.3所示的3D的DNA序列的反義RNA序列，或與之同源性較高的序列。
[0018]所述抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗的製備方法，包括:將MS2的成熟酶蛋白和插入了 O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141~160位胺基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達載體中構成如SEQ ID N0.2所示的DNA序列；設計引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID N0.3所示的序列的反義鏈擴增出來，連接到P⑶F-Duet-1表達載體的MCSl處；然後將兩個共表達載體轉化到BL21 (DE3)中；
[0019]I)在適宜的培養基、適宜的溫度、適宜的振蕩條件下培養重組工程菌，通過添加合適的誘導物誘導重組細胞表達並自主包裝成類病毒顆粒結構；
[0020]2)通過離心，收集經過誘導表達的重組工程菌，反覆凍融菌體3次，超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，上清即為含類病毒顆粒疫苗的產物；
[0021]3)所得表達產物的上清中加入NaCl至終濃度lmol/L，冰浴lh，離心所得的上清中再加入終濃度為10%的PEG8000，冰浴，離心得到類病毒顆粒沉澱，沉澱經氯仿洗滌後再經過蔗糖梯度超速離心得到類病毒顆粒的純化產物；
[0022]4)經蔗糖梯度純化後的類病毒顆粒即為抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗。
[0023]所述抗O型口 蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗的應用:該疫苗與相應佐劑混合後通過肌肉注射途徑對動物進行免疫。
[0024]本發明具有以下突出優點:
[0025]I)本發明提供的抗O型口蹄的類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗，免疫後可誘導動物同時產生抗O型口蹄疫的抗體，並且可以抑制體內口蹄疫病毒的增殖。
[0026]2)該疫苗製備安全，無滅活疫苗製備過程中存在的安全隱患。
[0027]3)該疫苗為類病毒顆粒結構，O型口蹄疫病毒的抗原表位被有效呈遞在類病毒顆粒的表面。因為其結構表面規則且有序，可以很好地刺激B、T細胞，引起免疫應答。
[0028]4)類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗的結構在體內血清中的半衰期長，穩定性好，有效期長，疫苗運輸儲存方便、有利於推廣使用。
[0029]5)展示口蹄疫抗原決定簇的類病毒顆粒大小合適，會很好地被淋巴系統識別，產生免疫抗體。
[0030]6)類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗內包裹的3D基因的反義核酸可以增強抗原決定簇的免疫應答，此外還能快速降低口蹄疫病毒的複製和增殖。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1為CP-VPl基因構建示意圖。其中PMS27模板中包括MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因。引物F-1-R98與F-2-F98中都含有部分O型MYA98FMDV的抗原決定簇，且相互間還有19個互補鹼基。以U-CP與F-1-R98為引物可以擴增出目的CP-VPl的上遊片段，以F-2-F98及D-CP為引物可以擴增出目的CP-VPl的下遊片段。以擴增得到的上下遊片段等量混合物為模板，以U-CP及D-CP為引物就可以搭橋獲得目的CP-VPl基因片段。[0032]圖2為28a-CP-VPl和CDF-3D (M)表達載體共轉化到BL21 (DE3)感受態細胞中，在抗性固體培養基中進行單克隆的挑選。
[0033]圖3為單克隆的PCR鑑定。單克隆既能擴增出CP-VPl (約1850bp)，也能擴增出3D的反義基因(約1400bp)。
[0034]圖4為目的基因的蛋白表達SDS-PAGE圖。可以看到CP-VPl-RNA大約16ku。
[0035]圖5為CP-VPl-RNA類病毒顆粒中RNA的穩定性分析。可以看到包裹在VLPs內部的3D基因的反義RNA在DNase和RNase都存在的情況下依然可以穩定存在。
[0036]圖6為電鏡下CP-VPl-RNA的類病毒顆粒圖片。用JEM2100透射電子顯微鏡觀察，可以發現視野中是均勻分布的白色的直徑大約為65nm類病毒顆粒顆粒。
[0037]圖7 為 28a-CP_VPl 及 CP-VP1-RNA Western blot 結果。結果顯示 CP-VP1 和CP-VPl-RNA都能與豚鼠抗O型FMD陽性血清有特異反應。
【具體實施方式】
[0038]以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0039]表1為實驗過程中所用的的引物及其序列。
[0040]表1
【權利要求】
1.一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於具有SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列，該序列包含有MS2外殼蛋白及O型口蹄疫病毒的VPl上優勢抗原決定簇序列。
2.如權利要求1所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述疫苗由SEQ ID N0.2所示的DNA序列編碼，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列。
3.如權利要求1所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述疫苗利用大腸桿菌表達，且在大腸桿菌細胞內自主包裝為類病毒顆粒結構，以類病毒顆粒形成存在。
4.如權利要求3所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於類病毒顆粒除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原決定簇外，內部還包裹著口蹄疫病毒的3D基因的反義RNA。
5.如權利要求4所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於該類病毒顆粒內包裹著各種亞型口蹄疫病毒共有的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp) 3Dpo1的3D基因的反義RNA。
6.如權利要求4所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於該疫苗中包裹的反義RNA序列是具有SEQ ID N0.3所示DNA序列的反義RNA序列或與之同源性較高的序列。
7.如權利要求2所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗，其特徵在於該DNA序列的第1254~1316位核苷酸為O型口蹄疫病毒的VPl的第141~160位抗原決定簇胺基酸對應的核苷酸；該胺基酸序列是將O型口蹄疫病毒VPl的第141~160位優勢抗原決定簇胺基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位胺基酸後面。
8.用於製備抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗的兩種共表達載體，其特徵在於，一種表達載體含有SEQ ID N0.2所示的DNA序列，或含有與SEQ ID N0.2所示的的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列的DNA序列，另一種表達載體含有SEQ ID N0.3所示的3D的DNA序列的反義RNA序列，或與之同源性較高的序列。
9.如權利要求1~7中任一所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗的製備方法，其特徵在於，該方法包括:將MS2的成熟酶蛋白和插入了 O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141~160位胺基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達載體中構成如SEQ ID N0.2所示的DNA序列；設計引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID N0.3所示的序列的反義鏈擴增出來，連接到P⑶F-Duet-1表達載體的MCSl處，然後將兩個共表達載體轉化到BL21(DE3)中； a)在適宜的培養基、適宜的溫度、適宜的振蕩條件下培養重組工程菌，通過添加合適的誘導物誘導重組細胞表達並自主包裝成類病毒顆粒結構； b)通過離心，收集經過誘導表達的重組工程菌，反覆凍融菌體3次，超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，上清即為含類病毒顆粒疫苗的產物； c)所得表達產物的上清中加入NaCl至終濃度lmol/L，冰浴lh，離心所得的上清中再加入終濃度為10%的PEG8000，冰浴，離心得到類病毒顆粒沉澱，沉澱經氯仿洗滌後再經過蔗糖梯度超速離心得到類病毒顆粒的純化產物；d)經蔗糖梯度純化後的類病毒顆粒即為所述抗O型口蹄疫的類病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗。
10.如權利要求1~7中任一所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類病毒顆粒疫苗的應用，其特徵在於該疫苗 與相應佐劑混合後通過肌肉注射途徑對動物進行免疫。
【文檔編號】A61K48/00GK103656682SQ201310673567
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】陳亮, 董豔美, 郭小玲, 黃小君, 張國廣, 郭遲鳴 申請人:廈門大學