還原甲硫氨酸亞碸殘基的方法
2023-09-17 15:01:55 4
專利名稱：還原甲硫氨酸亞碸殘基的方法
甲硫氨酸的亞碸氧化產物是自然界及合成肽化學中常見的衍生物。由於所述產物較易形成，使它成為通常存在於大多數由天然源分離出的含有甲硫氨酸的肽中的雜質。
最為可取的是，採用經過提純的肽，以避免易形成亞碸的貯藏條件〔Toennies，G.，和Callan，T.P.(1939)J.Biol.Chem.129，481〕。一經氧化，降低了的母體硫醚的親核性使胺基酸變得對其他的改性不敏感。這是其應用於肽合成〔Iselin，B.(1961)Helv.Chim.Acta44，61〕和蛋白質改性研究〔Tashjian，A.Ontjes，D.，和Munson，P.L.(1964)Biochem.3，1175〕的基礎。除了在合成時需要進行可逆保護外，一經提純，甲硫氨酸的氧化傾向，使眾多研究人員選用其他胺基酸代替之〔Kempe，T.Chow，F.，Peterson，S.M.，Baker，P.Hays，W.，Opperman，G.L′Italein，J.J.，Long，G.和Paulson，B.(1986)Biotechnology4，565;Krstenansky，J.L.，Trivedi，D.，Johnson，D.，和Hruby，V.(1986)J.Am.Chem.Soc.108，1696;Schalch，D.，Reisman，D.，Emler，C.，Humbel，R.Li，C.H.Peters，M.，和Lau，E.(1984)Endocrinology115，2490〕。
對含有甲硫氨酸亞碸的肽進行選擇性和非破壞性還原是肽化學中經常遇到的難題〔Kessler，W.，和Iselin，B(1966)Helv.Chim.Acta49，1330〕。最常用的方法是於高溫下，採用高濃度的還原劑，例如二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇來完成還原作用〔Houghten，R.A.，和Li，C.H.(1979)Anal.Biochem.98，36〕。該反應的速度緩慢，整個過程通常產生不完全的還原。另一種可供選擇的還原方法是分別在下述溶液中，用甲硫醚或苯硫基甲烷，促進氧交換。所述溶液是HCl水溶液〔Savige，W.E.，和Fontana，A.(1977)AdvinEnzymology47，453;Shechter，Y(1986)J.Boil.Chem.261，66〕，無水HF〔Tam.J.P.，Heath，W.F.，和Merrifield.R.B.(1983)J.Am.Chem.Soc.105，6442〕，1M的三氟甲磺酸-TFA〔Fujii，N.，Kuno，S.，Otaka，A.，Funakoshi，S.，Takagi，K.，和Yajami，H.(1985)Chem.Pharm.Bull.，Jpn.33，4587〕。在這些情況下，還原反應較易進行，並能保持不同程度的二硫化物的完整性。然而，值得注意的是，暴露在具有上述性質的一類強酸下可能產生的副作用。
在相當一段時間裡已認識到，滷酸可用來催化，將氧從亞碸上轉移而成硫醚〔Scorrano.G.(1973)Acc.Chem.Res.6，132〕。Savige和Fontana(見上文)首先明確地描述了採用12NHCl和甲硫醚來還原游離的(即不是蛋白質部分)甲硫氨酸亞碸的方法;還介紹了該方法應用於氧化的溶菌酶衍生物的成功實例，其中所產生的副反應最小。他們得出結論「該反應的條件相當嚴格，需要採用高濃度的HCl。」最近，Shechter(見上文)報導，採用甲硫醚和不定濃度的HCl，對蛋白質中的甲硫氨酸亞碸進行類似的還原。他推斷「當HCl的濃度為4.4-10.7M時，反應繼續進行，直至完成;而當HCl的濃度較低(即1.0M)時，還原反應極大地減慢。」在上述兩項研究中，均未對次要的改性進行高性能分析。
一般認為，甲硫氨酸亞碸在無水HF或1M的三氟甲磺酸-TFA中發生還原的機理不同於其在HCl水溶液中進行還原的機理。據信，在這些無水強酸中，還原程度隨著混合物的酸度而變化，並不依賴於酸性陰離子的親核性。已報導的有效還原反應，使不希望有的改性降到了最低水平。然而，由於溶劑的苛性，要求特別處理的預防措施，這樣，其用途就受到了嚴格的限制。
本發明旨在提供一種簡易且具有高度選擇性的方法，用以處理含有甲硫氨酸亞碸殘基的蛋白質和肽，以便有選擇地將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基。具體地說，本發明方法是採用比先有技術方法中採用的更為溫和的反應條件，進行還原反應。
因此，本發明的目的在於提供一種這樣的方法，即對含有一個或多個甲硫氨酸亞碸殘基的肽和蛋白質進行處理，以便將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基。該方法包括將所述肽或蛋白質置於基本上無水的三氟乙酸反應介質中，所述反應介質含有約0.01M至約3M的有機硫化物、約0.01M至約3M的滷酸，所述滷酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
如上所述，本發明涉及一種選擇性地將含有甲硫氨酸亞碸殘基的蛋白質和肽還原成其含甲硫氨酸殘基對應物的方法。該方法主要可用於從成熟的、具有生物活性的產物的氧化前體產生成熟的、具有生物活性的產物。所述氧化前體常常是由於合成產生蛋白質或肽時所採用的條件而形成的。在任一反應步驟的過程中，包括對希望得到的蛋白質或肽進行合成和提純的過程，使用甲硫氨酸殘基氧化成亞碸形式的條件是會出現的。如果沒有可行的方法，用於將甲硫氨酸殘基恢復成其還原態，就很難獲得大量具有適當尺寸的理想產物，至少在大規模生產成熟產物時是如此。
本發明的方法於溶劑三氟乙酸中實施。雖然不是絕對必需的，但最好在基本無水的條件下實施本發明方法，因此要採用基本上無水的三氟乙酸。採用「基本上無水的」三氟乙酸，並不意味著需要採取切實的措施，以排除存在的微量水份，而僅意味著應避免加水。
將待還原的蛋白質或肽與有機硫化物和滷酸一起加到三氟乙酸中。可按任何次序加入所述試劑。但較理想的是，先將蛋白質或肽溶解於三氟乙酸中，此後，加入有機硫化物，接著加入滷酸。
加到三氟乙酸中的蛋白質或肽的量一般應使濃度達到約0.01mg至約100mg/ml，較理想的是約0.1mg至約20mg/ml，更理想的是約1mg至約10mg/ml。
在三氟乙酸中，使蛋白質或肽同有機硫化物和某種滷酸反應。除了活性硫醚部分外，可採用眾多的有機硫化物，唯一的要求是這些有機硫化物在本發明方法的條件下應該是惰性的。典型的硫醚的實例包括甲硫醚、乙硫醚、乙基甲基硫醚、苯硫醚、二硫蘇糖醇、半胱氨酸等。優選的硫醚是二烷基硫醚，其中每個烷基基團含1至3個碳原子。本發明方法中採用的最優選硫醚是甲硫醚。
將有機硫化物加到反應混合物中，以產生約0.01M至約3M的濃度。較理想的濃度為約0.1M至約1M，更理想的濃度為約0.5M至約1M。
其餘的必需試劑是滷酸。滷酸選自鹽酸、氫溴酸、氫碘酸。較好的滷酸是鹽酸。反應混合物中滷酸的含量一般為約0.01M至約3M。較理想的是，滷酸含量為約0.1M至約1M。在上述含量範圍內，若被處理的蛋白質或肽含一個或多個二硫鍵，則最好在所述範圍的下限實施本發明的方法;若不存在二硫化物，則可在所述範圍的上限實施本發明的方法。
雖然，如上所述，最好在無水條件下實施所述方法，但由於加入了滷酸，通常會在反應混合物中摻入一定量的水份。因為所用滷酸的總量很少，並且它可通過以高濃度酸形式而摻入，所以，實際上僅有少量水被加到混合物中。按本發明的方法，這種加入量是完全可以允許的。
可在較寬的溫度範圍內，例如一般為約4℃至約45℃，實施本發明方法。最理想的是在室溫(約20℃至約25℃)下進行反應。
還原反應的發生通常相當迅速。雖然反應可持續很長時間，如6小時，但短至5分鐘也可完成反應。通常，反應進行時間為約30分鐘至約90分鐘。
一旦還原反應結束，可採用眾多公知的回收技術中的任何一種，收集所期望的產物。
以下實施例用於說明本發明的方法，並不是對發明範圍的限制。
實施例1對H-Phe-Met(O)-Gly-Pro-Glu-Thr-NH2(FM(O)GPET-NH2)的處理將肽FM(O)GPET-NH(2.15mg)溶解於1.72ml無水三氟乙酸(TFA)中。將肽溶液分成每份80μl的十七份等分液，取其中一份等分液作為對照物。該對照物不含甲硫醚(DMS)或鹽酸(HCl)。將不同量的DMS加到其餘的16份肽溶液中，使濃度達到0.01M至1M再加入濃鹽酸，使HCl濃度達到0.01N至1N。開始時劇烈地攪拌溶液，然後於室溫下使溶液保持靜止狀60分鐘。加入900μl0.1%的TFA水溶液，從而終止反應。
採用Altex Ultrasphere ODS逆相柱(46×25cm)，經高效液體色譜法(HPLC)測定化學改性的程度。在0.1% TFA水溶液中，於45℃下，通過以線性梯度增加的乙腈達到洗脫，進行色譜法分離。根據214nm處的峰面積測定法進行定量。經過TFA/DMS/HCl處理的FM(O)GPET-NH2產生了肽，這種肽顯示出與合成的標準FMGPET-NH2相同的色譜滯留時間。研究結果顯示於以下表1中。
表1FM(O)GPET-NH2的還原作用HCl濃度，N DMS濃度，M1形成的剩餘的FMGPET-NH2，% FM(O)GPET-NH2，%0001000.0109800.109501.0389.010495.01.011086.010.11184.011.012850.104960.1.0157410.10.154410.11.068331.004851.0.019401.00.19301.01.0950在無水的三氟乙酸中實施例2對GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH的處理將GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH(1.68mg)溶解於1.5ml無水三氟乙酸(TFA)中。先後將100μl甲硫醚(DMS)、10μl濃鹽酸加到900μl的肽溶液中。劇烈地混合溶液，於室溫下使之保持靜止狀。於加入鹽酸後的5、15、30、60分鐘時，各取出60μl反應混合物溶液等分液。用氮氣對每一試樣進行乾燥;加0.1%TFA水溶液，將其稀釋至1.2ml。在60分鐘結束時，再次將濃HCl(7.6μl)加到其餘的肽溶液(760μl)中，並再次劇烈地混合該溶液，然後於室溫下使之保持靜止狀。在開始加入HCl後的第65、75、90、120和180分鐘時，各取出60μl的等分液，如上所述，用氮氣乾燥，用0.1%TFA水溶液稀釋。
採用多孔層實心球C逆相柱(.46×10cm)，經高效液體色譜法(HPLC)測定化學改性程度。在0.1%的TFA水溶液中，於45℃下，利用以線性梯度增加的乙腈達到洗脫，進行色譜法分離。根據214nm時的峰高測定法進行定量。經TFA/DMS/HCl處理的GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH產生出一種肽，這種肽具有與合成的標準GRF(1-45)Met27，Lys45-OH相同的液體滯留時間。研究結果顯示於以下表2中。
表2GRF(1-45)Met(O)27，Lys45-OH的還原作用時間(分鐘) 產生的GRF(1-45)Met27，Lys45-OH，%5641592309860936596759790951209318088
實施例3對胰高血糖素Met(O)27的處理將胰高血糖素Met(O)27(1.32mg)溶解於660μl 1M的DMS與無水三氟乙酸(TFA)的溶液中。取30μl的等分液，用氮氣將其乾燥，並在1.2ml 0.1%的TFA水溶液中加溶之，得到未處理的對照物。將肽/TFA/DMS的溶液分成六份。將不同量的濃HCl和色氨酸加到各份溶液中，劇烈地混合各溶液，然後於室溫下使溶液保持靜止狀60分鐘。加入色氨酸的目的在於使胰高血糖素的25位內色氨酸的破壞程度減至最低。從各溶液取出各60μl的等分液，迅速用氮氣乾燥，用1.2ml 0.1%的TFA水溶液稀釋，進而使反應中止。在60分鐘結束時，再次將濃HCl加到其餘的肽溶液中。劇烈地攪拌混合物，然後於室溫下使之保持靜止狀。在第二次加入HCl的六十分鐘後，取每一溶液的等分液各60μl，按上所述用氮氣乾燥，用12ml 0.1%的TFA水溶液稀釋。採用杜邦C8逆相柱(.46×25cm)，經高效液體色譜法(HPLC)，測定化學改性的程度。在0.1M、pH為7的磷酸銨中，於45℃，利用增加線性梯度的乙腈達到洗脫，進行色譜法分離。根據在214nm處的峰面積測定法進行定量。經過TFA/DMS/HCl處理的胰高血糖素Met(O)27產生了一種肽，這種肽顯示出與合成的標準胰高血糖素相同的色譜滯留時間。該研究結果如以下表3所示。
表3胰高血糖素Met(O)27的還原色氨酸還原時間HCl，濃胰高血糖其餘的胰高血濃度，M1，2(分) 度，N 素收率% 糖素Met(O)，%060.13810060.14080120.22820120.22511060.16871060.166710120.258110120.259110060.1751710060.17615100120.2831100120.28111以相當於胰高血糖素的摩爾濃度表示2DMS的濃度為1M實施例4對IGF-I，Met(O)59的處理將IGF-I，Met(O)59(0.90mg)溶解於0.90ml的無水三氟乙酸(TFA)中。將該肽溶液分成8份每份100μl的等分液。用氮氣將樣品1、2、7和8乾燥，然後進行處理。除了將編號為偶數的試樣轉化成半胱氨醯磺酸鹽外，還使每對試樣(即1和2，3和4，5和6，7和8)都經相同的處理，然後測定。將不同量的無水TFA、甲硫醚(DMS)和濃鹽酸加到試樣中。劇烈地混合該溶液，然後於室溫下使之保持靜止狀。在第一次加入鹽酸的30分鐘後，再次將濃鹽酸加到其中一些試樣中。在30分鐘或60分鐘結束時，通過用0.1%的TFA水溶液稀釋，或對中性溶液進行亞硫酸根絡分解(sulfitolysis)，使所有試樣的反應中止。
採用杜邦C8Reliance逆相柱(.6×4cm)，經高效液體色譜法(HPLC)測定化學改性程度。在0.1M、pH為7的磷酸銨中，於45℃下，通過增加線性梯度的乙腈達到洗脫，進行色譜法分析。根據214nm處的峰面積測定法進行定量。經過TFA/DMS/HCl處理的IGF-I，Met(O)59產生一種肽，這種肽顯示出與合成的標準IGF-I相同的色譜滯留時間。下面的表4顯示了研究結果。
表4IGF-I Met(O)59的還原樣品TFAHCl濃DMS濃時間還原作IGF-I編號μl度，M度，M(分鐘)用，%收率，%110 0 0 0 0 -210 0 0 0 0 -3 100 .1 1 30 80 6724 100 .1 1 30 80 6935 100 .2 1 60 93 5626 100 .2 1 60 97 8637 0 4.4 .5 30 6.9 ＜128 0 4.4 .5 30 10 4.531對照物2鑑定為二硫化物3鑑定為S-磺酸鹽(在亞硫酸根絡分解後)
權利要求
1.一種處理含有一種或多種甲硫氨酸亞碸殘基的肽和蛋白質以便將所述殘基還原成甲硫氨酸殘基的方法，該方法包括使所述的肽或蛋白質置於基本上無水的三氟乙酸反應介質中，所述介質含有約0.01M至約3M的有機硫化物、約0.01M至約3M的滷酸，所述滷酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
2.根據權利要求1的方法，其中蛋白質或肽的濃度為約0.01mg/ml至約100mg/ml。
3.根據權利要求2的方法，其中蛋白質或肽的濃度為0.1mg/ml至20mg/ml。
4.根據權利要求1至3的任一項方法，其中有機硫化物是二烷基硫醚，其中每一烷基基團含1至3個碳原子。
5.根據權利要求4的方法，其中有機硫化物為甲硫醚。
6.根據權利要求1至5的任一項的方法，其中在反應混合物中的有機硫化物的濃度為0.1M至1M。
7.根據權利要求6的方法，其中在反應混合物中的有機硫化物的濃度為0.5M至1M。
8.根據權利要求1至7的任一項的方法，其中的滷酸為鹽酸。
9.根據權利要求1至8的任一項的方法，其中在反應混合物中的滷酸的濃度為約0.1M至約1M。
全文摘要
本發明公開了一種將肽和蛋白質中的甲硫氨酸亞碸殘基還原成甲硫氨酸殘基的方法。該方法的特徵在於將所述的肽或蛋白質置於基本上無水的三氟乙酸反應介質中，該介質含有約0.1M至約3M的有機硫化物、約0.01M至約3M的滷酸，所述的滷酸選自鹽酸、氫溴酸和氫碘酸。
文檔編號C07K1/06GK1031538SQ8810623
公開日1989年3月8日 申請日期1988年8月22日 優先權日1987年8月24日
發明者理察·丹尼斯·迪馬奇, 哈倫·比爾·朗 申請人:伊萊利利公司