一種轉基因大豆食用油螢光定量pcr檢測的方法

2023-09-18 04:44:00

一種轉基因大豆食用油螢光定量pcr檢測的方法
【專利摘要】本發明屬於生物檢測【技術領域】，具體為一種轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法。針對食用油脂中核酸含量低、破壞嚴重、DNA序列片段短的特點，本發明利用DNA提取試劑盒法加核酸富集處理步驟，有效地從大豆食用油中提取到可用於PCR擴增反應的DNA模板，設計並篩選了能有效擴增DNA模板的引物，通過實時螢光定量PCR技術定性檢測出了大豆的內源基因以及外源調控序列，為食用油原料是否轉基因的檢驗提供了一種穩定有效的方法。本發明的方法也適用經過高溫處理（烹飪）以後的食用油。
【專利說明】—種轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物檢測【技術領域】，具體涉及一種轉基因大豆植物油的螢光定量PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002]大豆是重要的食用油、食用蛋白和飼用蛋白原料，世界上對大豆的需求與日俱增，為此人們應用轉基因技術對大豆的遺傳特性進行定向改造，使之具有營養成分高，產量高，抗蟲等優良性狀。隨著基因工程技術的發展，轉基因大豆等農作物以其良好的抗逆性、高產量、相對較低的生產成本，很快佔據了世界市場，實現了其市場化和商品化。然而這些轉基因作物及其食品對生態環境及人類健康是否安全，始終是公眾關切的大問題。據此，國際和國內先後出臺了轉基因農產品標識管理政策，以保護消費的知情權和選擇權。按照2002年中國農業部出臺的相關規定，我國市場上的轉基因食用油必須進行明確標識。為此就需要有與之相配的轉基因食用油的檢測方法。而油脂因為已經經過壓榨或者萃取分離，其中DNA的成分很少，且結構不完整，難以適用通用的DNA檢測技術。目前，市場上大豆的轉基因技術是採用35S啟動子和目的基因同時轉入的策略，國際通用的方法也是以PCR技術為平臺，通過特異擴增轉基因調控原件花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、胭脂鹼合酶NOS終止子以及目的基因抗除草劑基因CP4-EPSPS來篩選檢測轉基因食品。但食用油經過高溫、高壓、萃取等步驟高度精煉以後，核酸嚴重破壞，含量極低，提取非常困難，因此如何高效提取精煉油中的DNA始終是轉基因檢測的瓶頸難點。儘管油脂中轉基因成分的檢測已有相關國家標準出臺，但周紅霞等通過多次實驗發現，標準中介紹的方法並不能完全有效地提取出油脂中的DNA。他們參照並改進前人介紹的方法，用CTAB法加核酸富集處理步驟，從15-20ml的油樣中提取到了能夠用於後續PCR檢測的DNA，提高了 DNA提取的有效性，但PCR擴增產物的電泳檢測效果不佳，可能是由於提取到的核酸量非常少而影響了 PCR的擴增效果。本發明在前人研究的基礎上，用改進的CTAB提取試劑盒法加核酸富集處理步驟，穩定高效地提取出了大豆食用油中適用於螢光定量PCR擴增的DNA，採用靈敏的SYBR Green I實時螢光定量PCR技術為轉基因大豆食用油DNA的提取和檢測提供一種穩定有效的方法。並採用實際的烹飪溫度處理食用油，驗證本方法對烹飪過的大豆油也同樣適用。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法，並確證對於高溫處理後的食用油檢測也同樣適用。
[0004]本發明提供的轉基因大豆食用油的分子檢測方法，用tRNA、18S、Lec、35S、NOS引物對油樣DNA進行SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測，只要tRNA、18S、Lectin基因中有一個基因片段被擴增出來，就可確認提取到了食用油DNA，這種方法極大提高了 DNA的檢出率，降低了假陰性結果，用35S和NOS引物擴增用來判斷所用油樣是否轉基因。具體步驟如下:(1)用CTAB植物基因組DNA提取試劑盒(選購自北京艾德萊生物科技有限公司)提取食用油中的微量DNA。即將食用油中的核酸富集到CTAB裂解液中，通過試劑盒操作純化裂解液中的DNA，並將DNA儲存在洗脫緩衝液EB中，存放在2_8°C ； 提取的具體操作步驟為:對於某種大豆食用油，取兩支50ml的試管，每管加入2ml試劑盒中的裂解液PL以及40ml食用油，顛倒混勻，45°C，250r/min震蕩lh，10000r/min離心5min,去油相，在水相中再加入油相40ml，重複上述操作4次，將兩支試管中第4次離心後保留的水相按每管600ul分裝到2ml EP管中，每管加入600ul氯仿/異戊醇(24:1)，顛倒充分混勻幾分鐘，13000rpm離心5min，然後按試劑盒後續操作說明進行。從DNA提取後，所有實驗均設陽性對照和空白對照；
(2)針對大豆的內源基因tRNA、18S、Lectin設計一系列擴增不同長度片段的引物，篩選出一套擴增效果最好的引物，得到tRNA、18S、Lectin三對擴增大豆食用油DNA效果最好的引物；
引物為:
tRNA: F:5』 - CGAAATCGGTAGACGCTACG-3』 (SEQ.1D.N01)
R:5』 -TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3』 (SEQ.1D.N02)
18S: F:5』 -ATGATAACTCGACGGATCGC-3， (SEQ.1D.N03)
R:5』 -CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3』 (SEQ.1D.N04)
Lec: F 5』 - ATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTC-3』 (SEQ.1D.N05)
R 5』 -CAATGGAATCCGAGGAGTCCCTTCGATCTGTCACATTT-3』 (SEQ.1D.N06)；
(3)設計大豆外源基因35S啟動子引物、NOS終止子引物，分別為:
35S: F:5' -CTAACAGAACTCGCCGTAAAGA -3』 (SEQ.1D.N07)
R:5' -AGATAGCTGGGCAATGGAAT -3』(SEQ.1D.N08)
NOS: F 5』 -GTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCGTTCAAACATTTGG-3』 (SEQ.1D.N09)
R 5』 -ACTCTTGTGGTGTTTGTGGCGATCTAGTAACATAGATGA-3』 (SEQ.1D.NOlO)；
(4)按照常規方法提取非轉基因大豆的基因組DNA進行梯度稀釋，然後向各稀釋液中加入tRNA、18S、Lec引物進行擴增(擴增的參數如下:擴增反應體積為25 μ 1，2 XPremixEx Taq 12.5 μ I,濃度為10 μ mol/L的正向引物0.5 μ 1，濃度為10 μ mol/L的反向引物
0.5μ l,ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，擴增反應條件:96°C IOmin 預變性；96°C 15s，引物的退火溫度30s，72°C 15s，循環數36);
(5)擴增後，測定各稀釋液中相關螢光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關係，據此繪製tRNA、18S、Lectin基因的SYBR Green I實時螢光定量PCR標準曲線；
(6)對含有帶35S啟動子和NOS終止子序列質粒的細菌進行梯度稀釋，然後向各稀釋液中加入35S啟動子和NOS終止子引物進行PCR擴增(擴增的參數如下:擴增反應體積為 25 μ 1，2XPremix Ex Taq 12.5 μ I,濃度為 10 μ mol/L 的正向引物 0.5 μ 1，濃度為10 μ mol/L的反向引物0.5 μ 1，ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，擴增反應條件:96°CIOmin預變性；96°C 15s，引物的退火溫度30s, 72°C 15s,循環數36);測定各稀釋液中相關螢光標記物的Ct值，並繪製35S啟動子和NOS終止子引物的SYBR Green I實時螢光定量PCR標準曲線；
(7)用CTAB植物基因組DNA提取試劑盒(選購自北京艾德萊生物科技有限公司)提取待檢測大豆食用油中的微量DNA，然後向DNA提取液中分別加入tRNA、18S、Lec、35S和NOS引物，進行擴增，每個引物重複3次；擴增後，測定DNA提取液中相關螢光標記物的Ct值，然後根據上述繪製的各基因的定量PCR標準曲線，估計提取液中DNA的含量，從而判斷是否從食用油中提取出了可供PCR檢測的DNA，各內源基因的損失情況以及樣品是否為轉基因大豆食用油。
[0005]本發明還模擬實際的烹飪操作，用上述的提取方法和實時螢光定量PCR檢測方法探索加熱處理對食用油中DNA含量的影響。即加熱處理後的大豆食用油同樣適用本發明方法。例如:
(1)對食用油分別進行處理:160°Clmin,160°C 3min,160°C 5min，微波爐中火加熱3min,微波爐中高火加熱3min, 121度高壓滅菌；
(2)按照前述提取方法提取經過加熱處理的食用油的DNA，並對提取到的DNA進行檢測；將加熱處理後的油的DNA拷貝數與加熱未處理的油的DNA拷貝數進行對比，從而判斷各加熱處理對油中DNA含量的影響；
(3)根據加熱對油中DNA含量的影響，確證對高溫處理後的食用油的檢測本發明依然有效。
[0006]本發明具有的優點和效果如下: 本發明所設計的食用油DNA的提取方法成本低，操作簡單，從食用油中穩定高效地提取出了可供螢光定量PCR檢測的DNA。針對食用油中核酸含量極低、破壞嚴重、DNA序列片段短的特點，設計了適用於擴增大豆食用油DNA的一系列引物，得到了較好的擴增效果，極大提高了提取的食用油DNA的檢出率。採用SYBR Green I實時螢光定量PCR技術，使得檢測靈敏，準確，簡單，可靠。模擬實際的烹飪操作，驗證加熱處理對食用油中DNA含量的影響，驗證本發明的方法對於高溫處理後的油樣也適用。
【具體實施方式】
[0007]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0008]實施例1大豆食用油DNA的提取 材料:大豆食用油
東北大豆(做陰性對照)
試劑:CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒選購自北京艾德萊生物科技有限公司；步驟:對於每種食用油，取兩支50ml的試管，每管加入2ml試劑盒中的裂解液PL以及40ml食用油，顛倒混勻，45°C, 250r/min震蕩lh, 10000r/min離心5min,去油相,在水相中再加入油相40ml，重複上述操作4次，將兩支試管中第4次離心後保留的水相按每管600ul分裝到2ml EP管中，每管加入600ul氯仿/異戍醇(24:1),顛倒充分混勻幾分鐘，13000rpm離心5min，然後按試劑盒後續操作說明進行。即將320ml食用油中的核酸富集到4ml的CTAB裂解液中，通過試劑盒操作純化裂解液中的DNA，最後將DNA儲存在IOOul洗脫緩衝液EB中，存放在2-8 °C。
[0009]用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒按照操作說明提取東北大豆的基因組DNA，用作陰性對照。
[0010]實施例2 tRNA、18S、Lectin、35S、NOS 基因的 SYBR Green I 實時螢光定量 PCR檢測方法。
[0011]所用油樣:購自超市與網絡商城的大豆食用油30份。
[0012]將已經提取到的大豆基因組DNA稀釋10倍、100倍、1000倍，分別用tRNA、18S、Lec引物擴增上述濃度梯度，每個濃度設3個重複，得到每個基因擴增的標準曲線。
[0013]將含有帶35S啟動子序列質粒的細菌稀釋10倍、100倍、1000倍，分別用35S、N0S引物擴增上述濃度梯度，每個濃度設3個重複，得到35S、N0S啟動子擴增的標準曲線。
[0014]擴增反應體積為25μ1, 2 X Premix Ex Taq 12.5 μ 1，濃度為10 μ mol/L的正向引物0.5 μ 1，濃度為10 μ mol/L的反向引物0.5 μ l，ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，擴增反應條件:96°C IOmin預變性；96°C 15s，引物的退火溫度30s，72°C 15s，循環數36。
[0015]分別用tRNA、18S、Lectin、35S、N0S基因引物擴增提取的30個油樣DNA，以水作空白對照，根據標準曲線判斷是否從油樣DNA擴增出以上基因片段，從而確定是否提取出了油樣DNA以及鑑別油樣是否含轉基因成分。
[0016]結果:以在36個循環內是否讀取得到CT指為標準，判斷是否得到陽性擴增。對於tRNA,得到陽性擴增率為60% ;對於18S，得到陽性擴增率為100% ;對於Lectin，得到陽性擴增率為46.7%。綜上所述，可以判定所有油樣的DNA都被提取出來，所有樣本的DNA提取液中都含有18S基因片段。而其他基因有部分樣本沒有陽性擴增，可能是由於這種基因破壞比較嚴重，含量很低，引物的擴增效率不同，或者雖然有擴增但是低於實驗設定的CT閾值。但是綜合分析可以肯定所有樣本都提取到了 DNA。
[0017]對於35S啟動子與NOS終止子，獲得了同樣的結果。標識為轉基因的樣本的陽性擴增率為100%，標識為非轉基因的樣本的陽性擴增率為86.7%，未標識的樣本的陽性擴增率為100%，東北大豆陰性對照的陽性擴增率為0%。
[0018]說明市面上絕大部分大豆食用油，包括明確標識為非轉基因的，實際上均為轉基因大豆食用油或者混有轉基因大豆成分。
[0019]實施例3:加熱處理對食用油中DNA含量的影響
對大豆油分別進行以下處理:160°C lmin,160°C 3min,160°C 5min，微波爐中火加熱3min，微波爐中高火加熱3min，高壓滅菌，未處理對照。提取處理後的油樣DNA，分別用tRNA、18S、Lectin、35S、NOS基因引物擴增上述7個油樣，用SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測，並根據標準曲線對比處理後和未經處理的油樣DNA含量的變化，以及不同加熱程度對油中DNA含量的影響。
[0020]結果:對於每個基因，未處理對照所提取出的基因片段濃度都不是最高的，即處理後基因的濃度並不比不處理的低，樣品存在的差異可能只是由於提取效率不同導致，但也可以反映出來以上處理對基因穩定性及濃度的影響不大。同一溫度，處理時間不同對基因穩定性及濃度也無明顯影響；相同時間用不同溫度處理，對基因穩定性及濃度無明顯影響；短時間內高壓處理對基因片段的濃度的也無明顯影響。由此可見，在一般條件下，油中的基因序列可穩定存在，長期保存，使得轉基因植物油的基因鑑別方法更加可靠。而且在一般烹飪條件下(溫度一般不高於160度，時間不長於5min)，植物油中的基因片段仍可存在，可適用本發明的方法來檢測是否轉基因。
【權利要求】
1.一種轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法，其特徵在於具體步驟為: (1)用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒提取大豆食用油中的DNA； (2)設計並篩選得到擴增tRNA基因的一對引物，擴增18S基因的一對引物，擴增Lectin基因的一對引物，分別為:
tRNA: SEQ.1D.NOl
SEQ.1D.N02
18S: SEQ.1D.N03
SEQ.1D.N04
Lec: SEQ.1D.N05
SEQ.1D.N06 (3)設計大豆外源基因35S啟動子引物、NOS終止子引物，分別為:
35S: SEQ.1D.N07
SEQ.1D.N08
NOS:SEQ.1D.N09
SEQ.1D.NOlO (4)提取非轉基因東北大豆的基因組DNA，進行梯度稀釋，然後向各稀釋液中加入tRNA、18S、Lec引物進行擴增； (5)擴增後，測定各稀釋液中相關螢光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關係，據此繪製tRNA、18S、Lectin基因的SYBR Green I實時螢光定量PCR標準曲線； (6)對含有帶35S啟動子和NOS終止子序列質粒的細菌進行梯度稀釋，然後向各稀釋液中加入35S啟動子和NOS終止子引物進行擴增，測定各稀釋液中相關螢光標記物的Ct值，並繪製35S啟動子和NOS終止子引物的SYBR Green I實時螢光定量PCR標準曲線； (7)向DNA提取液中分別加入tRNA、18S、Lec、35S和NOS引物，進行擴增，每個引物重複3次；擴增後，測定DNA提取液中相關螢光標記物的Ct值，然後根據上述繪製的各基因的定量PCR標準曲線，估計提取液中DNA的含量，從而判斷是否從食用油中提取出了可供PCR檢測的DNA，各內源基因的損失情況以及樣品是否為轉基因食用油。
2.根據權利要求1所述的轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法，其特徵在於，所述大豆食用油經過加熱處理。
3.根據權利要求1所述的轉基因大豆食用油螢光定量PCR檢測的方法，其特徵在於，所述用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒提取大豆食用油中DNA的步驟為:將食用油中的核酸富集到CTAB裂解液中，通過試劑盒操作純化裂解液中的DNA，並將DNA儲存在洗脫緩衝液EB中，存放在2-8 °C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642934SQ201310743102
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】皮妍, 段昱竹, 蔣科技, 張丹, 盧大儒, 喬守怡 申請人:復旦大學