一種肌酸激酶mb同工酶活性測定試劑及其製備方法
2023-09-18 04:39:30
專利名稱：一種肌酸激酶mb同工酶活性測定試劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗領域中的一種分析試劑，具體涉及用於測定血液中肌酸激酶 MB同工酶活性的試劑。
背景技術：
肌酸激酶(CK)有三種主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB, CK-BB0肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)，主要存在於心肌中，是心肌酶譜中最有特異性的酶，從八十年代起公認為心肌酶學診斷的「金標準」，應用於急性心肌梗塞(AMI)的早期診斷，是診斷及監測AMI病人病情敏感而特異的指標。臨床上最普遍採用免疫抑制法，其原理免疫抑制法試劑中的抗CK-M抗體抑制 CK-M亞基，即抑制CK-MM活性和CK-MB的CK-M亞單位的活性，通過測定樣品中未被抑制的 CK-B單體的活力(相當於一半CK-MB活力)，所以將結果乘以2，計算出CK-MB的活力，CK-MB 試劑的檢測靈敏度相應也比CK低一半左右，由於CK-MB參考值<25 U/L,其上限25 U/L 的每分鐘吸光度變化值只有0. 003左右，檢測儀器的溫飄及脂濁標本的幹擾，都會產生較大的測量誤差，使得測定結果不可靠。申請號200610114997.9的專利通過反應生成過氧化氫+魯米諾+過氧化物酶化學發光法測定肌酸激酶MB同工酶活性，雖然有較高的檢測靈敏度，但由於肌酸激酶在血清中很容易失活，通常要加入巰基試劑保持其活力，巰基試劑會嚴重抑制過氧化氫+過氧化物酶反應，使其測定結果不可靠性。
發明內容
為了解決上述技術問題，本發明提供一種肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，含有硫代氧化型輔酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)、巰基試劑、鎂鹽、葡萄糖激酶(GLUK) (或己糖激酶)、抗CK-M抗體、磷酸肌酸(CP)，二磷酸腺苷(ADP)、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)。優選地，上述硫代氧化型輔酶為硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD) 或其鹽，或者硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Thio-NADP)或其鹽；所述巰基試劑為N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)或硫代甘油(TG)。進一步地，上述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，還可以含有一磷酸腺苷 (AMP)、二腺苷五磷酸(P1，P5-DiAP)、穩定劑和防腐劑。上述穩定劑為蛋白穩定劑、二糖、多糖、多元醇、胺基酸、螯合劑或非離子表面活性劑的一種或兩種以上任意混合物；所述防腐劑為PR0CLIN系列防腐劑、疊氮鈉、慶大黴素、 氯黴素、對羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽或陽離子表面活性劑中的一種或其兩種以上任意混合物。優選地，所述肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑為含有如下濃度成分的溶液 磷酸肌酸5-200 mmol/L
二磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L葡萄糖1-200 mmol/L
葡萄糖激酶(或己糖激酶)0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 0. 1-100 KU/L 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型輔酶0. 1-50 mmol/L
巰基試劑1-100 mmol/L
抗CK-M抗體 CK-M抑制>500 U/L 鎂鹽1-100 mmol/L
上述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，還可含有如下濃度的成分
一磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L
二腺苷五磷酸 0. 001-0. 1 mmol/L
穩定劑0. 1-20 mmol/L
防腐劑0. 1-20 g/L
上述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑的製備方法為將各成分溶於PH為5. (Γ9. 5 的緩衝液中。上述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑可為雙試劑，包括試劑1和試劑2，所述試劑1包括以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶(或己糖激酶，優選葡萄糖激酶)、 G6PDH、6P⑶H、硫代氧化型輔酶、巰基試劑、抗CK-M抗體、鎂鹽，所述試劑2包括以下成分
磷酸肌酸。上述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑(雙試劑)的製備方法，步驟為1)將第一劑的各成分溶於PH為5. (Γ9. 5的緩衝液中，備用；2)將第二劑的成分溶於pH為5. (Γ9. 5的緩衝液中，備用。上述製備方法中，所述緩衝液為濃度為20-500 mmol/L的咪唑緩衝液、Bis-Tris 緩衝液或生物緩衝液。本發明提供的肌酸肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑能夠達到以下效果
1)本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，檢測靈敏度與現有技術相比能放大數倍，使測定結果具有高精密度、準確度；
2)本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑在405nm生成黃色指示，可以應用到乾式試劑、快速檢測試劑。
圖1是實施例2製得的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑和對比例的肌酸激酶MB 同工酶活性測定試劑的反應靈敏度曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑含有硫代氧化型輔酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、巰基試劑、鎂鹽、葡萄糖激酶(或己糖激酶，優選葡萄糖激酶)、抗CK-M抗體、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其測定活性時的反應原理為 反應1、CK-M被抗CK-M抗體抑制
反應式 2、 磷酸肌酸 + 二磷酸腺苷 CK, >肌酸+三磷酸腺苷
反應式3、三磷酸腺苷+葡萄糖 GluK〉二磷酸腺苷+ G6P
反應式 4、G6P + Thio-NAD (P)+ GSPDH 6-PG + Thio-NAD (P)H + H+
反應式 5、6-PG + Thio-NAD (P)+ 6PGDH 、核糖 _5_ 磷酸 + Thio-NAD (P)H + H+
在405 nm測定吸光度增加的速率與肌酸激酶MB同工酶活性成正比。本發明採用硫代氧化型輔酶其在405nm具有較高的吸光度，而且反應式3產物葡萄糖-6-磷酸經過本發明二級放大，結合高靈敏的指示系統，使本發明的檢測靈敏度可以達到臨床上最普遍採用的免疫抑制法的4倍左右，從而測定結果精度提高得以保障。所述的硫代氧化型輔酶，可以是硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)、 硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Thio-NADP)，或上述輔酶的鹽類。所述用於激活肌酸激酶活性的巰基試劑，可以是N-乙醯-L-半胱氨酸、硫代甘油等巰基試劑。加入的鎂離子可以是醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂等，鎂離子的加入除可激活反應式2 的反應外，更作為酶的輔助因子，維持酶的構象。作為優化的技術方案，肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑中還含有一磷酸腺苷、 二腺苷五磷酸、穩定劑和防腐劑。
一磷酸腺苷和二腺苷五磷酸的加入可降低待測樣品中其他酶對測定結果的幹擾。所述的穩定劑可以為蛋白穩定劑、多元醇、胺基酸、螯合劑和非離子表面活性劑。 其中，所述的多元醇、二糖、多糖、蛋白類穩定劑、胺基酸、螯合劑、二價金屬離子，可以是單獨使用，也可以是組合使用。其中，多元醇可以是甘油、乙二醇、丙二醇、二甘醇等，多元醇可以和水相互間形成堅強的氫鍵，降低水分子的活力，保持酶活性的三維結構。二糖類可以是蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。蛋白類穩定劑可以是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等，蛋白類穩定劑可以和試劑中酶分子作用，減少離解為亞基或變性失活。胺基酸可以是賴氨酸、天門冬氨酸、穀氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸等及其鹽，胺基酸可以協助保護酶蛋白質胺基酸核心序列的構想完整性，提高穩定性。螯合劑有乙二胺四乙酸、亞氨基二乙酸、氮三乙酸和二乙基三胺五乙酸、2-環已二胺四乙酸、乙二醇雙(α -氨基乙酸)醚四乙酸、乙基乙二胺三乙酸等及其鹽類，螯合劑中微量重金屬，可防止抑制酶活性。非離子表面活性劑可以是吐溫系列、TritonX、聚乙二醇系列等非離子表面活性劑，起到主要增溶、澄清、防止水溶液游離氧等作用。防腐劑可以是PR0CLIN系列防腐劑(2-甲基_4_異噻唑啉_3_酮和5_氯_2_甲基-4-異噻唑啉-3-酮)、疊氮鈉、慶大黴素、氯黴素、對羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽、 陽離子表面活性劑等，可在保質期內抑制微生物的生長，防止試劑失效。
將上述各成分溶於pH為5. (Γ9. 5的緩衝液中即可製得本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑。緩衝液無特定要求，最好PH在5. 0-9. 5，可以使用是咪唑緩衝液，也可以是Bis-Tris緩衝液、Good』 s生物緩衝液等以維持試劑的pH值。本發明優選採用pH為 5. (Γ7. 5，濃度為20-500 mmol/L的咪唑醋酸緩衝劑作為緩衝液。為提高試劑保存時的穩定性，本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑可為雙試劑將以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶、G6PDH、6PGDH、硫代氧化型輔酶、巰基試劑、抗CK-M抗體和鎂鹽溶於pH 5. (Γ9. 5的緩衝液中製成試劑1 ；將磷酸肌酸溶於pH 5. (Γ9. 5的緩衝液中製成試劑2。緩衝液無特定要求，最好pH在5. 0-9.5，可以使用是咪唑緩衝液，也可以是Bis-Tris緩衝液、Good』 s生物緩衝液等以維持試劑的pH值。本發明優選採用PH為5. (Γ7. 5，濃度為20-500 mmol/L的咪唑醋酸緩衝劑作為緩衝液。上述各成分在緩衝液中的濃度優選為 磷酸肌酸5-200 mmol/L 二磷酸腺苷 0. 5-20 mmol/L 葡萄糖 1-200 mmol/L 葡萄糖激酶 0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶0. 1-100 KU/L
6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型輔酶0. 1-50 mmol/L
巰基試劑1-100 mmol/L
抗 CK-M 抗體(CK-M 抑制 >500 U/L) 鎂鹽1-100 mmol/L
一磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L
二腺苷五磷酸 0. 001-0. 1 mmol/L 穩定劑0. 1-20 mmol/L
防腐劑0. 1-20 g/L。以本發明製得的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑對肌酸激酶MB同工酶活性測定的具體步驟如下
在日立7180自動生化分析儀上測定精密度試驗將取待測血清標本加入本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑中，混勻，37°C孵育1 3分鐘後，連續監測2分鐘波長 405nm的吸光度變化速率，測得待測標本中肌酸激酶MB同工酶的活性數值。本發明製得的肌酸激酶MB同工酶的精密度計算，具體步驟如下
取高低兩個水平的血清樣本，在日立7180自動生化分析儀上平行測定同-計算測定值的平均值和標準差，按( 式計算批內變異係數。變異係數=S/V X 100%............ (2)
式中s為標準差，計算公式為
-樣本20次，
d + d i + · ■ + dl
Il - 1
dn為同水平各次所測值的偏差，計算公式為Cln=Xn-^為同水平各次所測值；
Γ為平均值，計算公式為f = (Xl+X2+……+ ) /η。
本發明的優選實施例具體如下 實施例1
本實施例的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其主要成分及濃度如下
咪唑緩衝液PH 6. 7 100 mmol/L
磷酸肌酸30 mmol/L
ADP 2 mmol/L
葡萄糖20 mmol/L
GluK 2 KU/L
G6PDH 1. 5 KU/L
6PGDH 10 KU/L
硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸2 mmol/L NAC 20 mmol/L
抗 CK-M 抗體(CK-M 抑制 >2000 U/L)
EDTA 2 mmol/L
乙酸鎂 10 mmol/L
AMP 5 mmol/L
P1, P5-DiAP 0. 01 mmol/L
將本實施例製得的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑在日立7180生化分析儀上測定精密度試驗將取待測標本12μ L加入本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑300μ L 中，混勻，37°C孵育1-3分鐘後，連續監測2分鐘吸光度變化速率，測定波長405nm，測得肌酸激酶MB同工酶活性數值。日立7180自動生化分析儀測定參數
TEST NAMECK-MB
ASSAYRATE-A
TIME10
POINT10-16
WAVELENGTH660/405
SAMPLE VOLUME(NORMAL) 12 REAGENT Rl300
REAGENT R2 REAGENT R3
UNITU/L
K4522
本實施例的精密度實驗計算結果如下 表一、精密度試驗
權利要求
1.一種肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，含有硫代氧化型輔酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、巰基試劑、鎂鹽、葡萄糖激酶或己糖激酶、抗CK-M抗體、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
2.根據權利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，所述硫代氧化型輔酶為硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸或其鹽，或者硫代氧化型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其鹽；所述巰基試劑為N-乙醯-L-半胱氨酸或硫代甘油。
3.根據權利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，還含有一磷酸腺苷、二腺苷五磷酸、穩定劑和防腐劑。
4.根據權利要求3所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，所述穩定劑為蛋白穩定劑、二糖、多糖、多元醇、胺基酸、螯合劑或非離子表面活性劑的一種或兩種以上任意混合物；所述防腐劑為PR0CLIN系列防腐劑、疊氮鈉、慶大黴素、氯黴素、對羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽或陽離子表面活性劑中的一種或其兩種以上任意混合物。
5.根據權利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，所述肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑為含有如下濃度成分的溶液磷酸肌酸5-200 mmol/L二磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L葡萄糖1-200 mmol/L葡萄糖激酶或己糖激酶 0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 0. 1-100 KU/L 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型輔酶0. 1-50 mmol/L巰基試劑1-100 mmol/L抗CK-M抗體CK-M抑制>500 U/L鎂鹽1-100 mmol/L。
6.根據權利要求5所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，還含有如下濃度的成分0.5-20 mmol/L 0.001-0. 1 mmol/L 0.1-20 mmol/L 0.1-20 g/L。
7.根據權利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，其特徵在於，所述肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑為雙試劑，包括試劑1和試劑2，所述試劑1包括以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶或己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、硫代氧化型輔酶、巰基試劑、抗CK-M抗體和鎂鹽，所述試劑2包括以下成分磷酸肌酸。
8.權利要求1飛任一項所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑的製備方法，其特徵在於，將各成分溶於PH為5. (Γ9. 5的緩衝液中。
9.權利要求7所述的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑的製備方法，其特徵在於，步驟為1)將第一劑的各成分溶於PH為5. (Γ9. 5的緩衝液中，備用；2)將第二劑的成分溶於pH 為5. (Γ9. 5的緩衝液中，備用。一磷酸腺苷二腺苷五磷酸穩定劑防腐劑
10.根據權利要求8或9所述的製備方法，其特徵在於，所述緩衝液為濃度為20-500 mmol/L的咪唑緩衝液、Bis-1Tris緩衝液或生物緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，含有硫代氧化型輔酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、巰基試劑、鎂鹽、葡萄糖激酶或己糖激酶、抗CK-M抗體、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。其製備方法為將各成分溶於pH為5.0~9.5的緩衝液中。本發明的肌酸激酶MB同工酶活性測定試劑，檢測靈敏度能放大數倍，測定結果具有高精密度、準確度。
文檔編號C12Q1/50GK102154443SQ201110073890
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月25日 優先權日2011年3月25日
發明者不公告發明人 申請人:浙江東甌診斷產品有限公司