原位生物晶片的製作方法

2023-09-18 05:52:05 4

專利名稱：原位生物晶片的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於化學與生物分析儀器技術領域。
目前已有報導的生物晶片主要是採用原位合成法、化學噴射法或接觸式點塗法製備的、把寡核苷酸作為探針的基因晶片。如《生物工程進展》1999,Vol.19(No.4):33-37、和45-51發表的「生物晶片研究進展」和「基因晶片技術及應用研究進展」兩篇文章，綜述了國內外對生物晶片技術在加工製備、功能和應用方面的主要研究成果。基因晶片目前主要用於高通量基因表達平行分析、大規模基因發現及序列分析、基因多態性分析和基因組研究等。另外，《Analytical Biochemistry》1994,Vol.270:103-111發表的「用於基因表達和抗體篩選的蛋白質微陣列」一文，首次把蛋白質作為探針高密度地固定在聚雙氟乙烯膜上，對cDNA(反錄脫氧核糖核酸)克隆片段表達的產物進行檢測。另一方面，目前基因晶片檢測主要是利用螢光素等標記目的基因，即所謂螢光標記法。用計算機控制的高分辨螢光掃描儀獲得結合於晶片上目的基因的螢光信號進行分析測試。螢光掃描儀主要有靈敏度和解析度較高、但掃描時間長的雷射共聚焦顯微鏡，和掃描時間短、但靈敏度和解析度較低的電荷藕合器件(CCD)攝像機兩大類。在基因晶片的雜交檢測中，為比較不同來源樣品的基因表達差異，或者為了提高基因晶片檢測的準確性和測量範圍，通常需要使用多色螢光技術，如《Nature Genetics》1999,21(Supplement):42-47發表的「採用寡核苷酸微陣列測序和突變分析」文章，把不同來源的靶基因用不同激發波長的螢光探針來修飾，並同時使它們與基因晶片雜交，通過比較晶片上不同波長的分布圖，獲得不同樣品中基因表達的差異。但螢光標記法也存在一些嚴重的不足，如檢測需在雜交反應完成並洗脫未結合標記物後進行，不能對晶片上的反應進行動態監測，因而也不能獲取有關反應動力學的信息，同時檢測設備複雜且成本高，對檢測條件有極其嚴格的要求，操作冗繁，難以實現自動化、小型化等等。目前還未可進行原位檢測的生物晶片技術的報導。
鑑於此，本實用新型的目的是針對已有生物晶片技術存在的上述問題，提供一種無須標記、能進行原位檢測實時獲取微陳列各探針的反應信息，並具有自動、高速、高效，使用簡便，相關設備易於微型化、成本低廉的原位生物晶片及其製備方法。
本實用新型採用在半導體基片上製作結構相同的微型傳感器陣列，在每一個傳感器上固化一種探針形成在傳感器陣列上有有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種探針，形成檢測位點陣列，構成在使用時能通過檢測預定的檢測位點對外加電信號的響應，原位獲取該檢測位點探針與靶物質的反應信息的原位生物晶片來實現其目的；本實用新型採用大規模集成電路技術在基片上製作微型傳感器陣列、並在微型傳感器陣列上固化探針製成由檢測位點陣列構成的本原位生物晶片來實現其目的。
本實用新型的原位生物晶片(參見附圖)，包含有SiO2膜層(5)的基片(1)，在SiO2膜層上有沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線相交錯，有在X地址線和Y地址線的交錯部的MN個能盛裝樣品溶液(6)的檢測池(12)，M、N為正整數，X地址線和Y地址線的一端分別與各檢測池的兩個電極(8、9)相連，另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構成MN個傳感器，組成傳感器陣列，在一個傳感器上固化一種探針(16)形成有至少一種探針的探針陣列，構成MN個檢測位點(7)，組成檢測位點陣列。
在上述的SiO2膜層(6)下的基片(1)上，有分別與沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標軸的N條RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構成的與傳感器陣列相對應的電阻陣列，M、N為正整數，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)和Y電阻邏輯電路(4)相連。
上述的檢測位點(7)有至少一個圓孔形的檢測池(12)，檢測池的孔壁上有金屬化層(18)，所說的兩個電極(8、9)分別在孔壁的金屬化層上，檢測池的底面和/或電極的表面呈波紋狀。
上述的檢測位點(7)有至少一個相互平行的槽形的檢測池(12)，上述的電極呈指狀，有至少一根位於檢測池上層的電極(8)和至少一根位於檢測池下層的電極(9)，在上層的電極與SiO2膜層(6)之間依次有粘接層(10)和Si3O4掩膜層(11)，在下層的電極與SiO2膜層之間有粘接層(10)，檢測池的底面(17)和/或電極的表面呈波紋狀。
上述的探針(16)是有機化合物探針、或生物分子探針、或細胞探針、或微生物探針，探針固化在檢測池(13)內的電極(8、9)表面上、或固化在檢測池內的固體支撐物上。
上述的X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)可以集成在基片(1)上。上述的X電阻邏輯電路(3)、Y電阻邏輯電路(4)也可以集成在基片(1)上。
本實用新型的探針與靶物質的反應可通過在加入靶樣品溶液後給檢測池內電極施加電壓來吸引樣品溶液中的靶物質以加快反應速度。沒有外加電壓時，樣品溶液中靶分子只有通過擴散到達探針，這種自由擴散過程效率極低；外加一電壓可將帶電靶分子直接吸引到聯結在電極上的探針，從而加快探針-靶的反應速度。相反，外加-反向電壓，則有助於洗脫未反應和錯配的靶分子，該技術適用於所有檢測位點內置有電極的晶片。另外，可用外加電壓產生一衝擊電流，用於電極表面的清洗或鈍化。
適用於本實用新型的生物晶片的檢測對象即靶物質，可以是無機或有機化合物、生物分子如DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)，抗體或抗-抗體，細胞或微生物。對於不同的靶物質，需選用相對應的探針進行檢測，對RNA或DNA靶物質，探針可以是合成的寡核苷酸。由於一個檢測位點上對應有一種探針，而由多個檢測位點構成的陣列晶片上對應有由多種探針構成的探針組，因此可對包括相應多種靶物質的靶物質組同時進行檢測。當將含有靶物質的樣品溶液與本原位生物晶片接觸時，被置於在檢測位點上構制出的檢測池中，靶物質被相應的探針捕獲。通過X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路對每一檢測位點進行自動尋址，並通過經X地址線、Y地址線與檢測位點相連的檢測電路測量該檢測位點的電參數，探針-靶的相互作用將導致檢測位點電參數的變化，由此，通過電尋址和電參數測量可對原位生物晶片內每一檢測位點上特定的靶物質-探針結合進行動態實時監測，從而實現對靶物質組成的測定。
本實用新型的生物晶片，通過採用微電子、微機械、化學處理、生物操縱等製備工藝和過程，得到多個作為探針的有機分子、或生物分子、或細胞、或微生物的微陣列，能使成千上萬個與生命或藥物相關的信息集成在一塊釐米見方的晶片上。
本實用新型與已有生物晶片及其製備方法相比較，具有如下的明顯優點和顯著效果。
一、本實用新型採用微型傳感器，可以通過測量探針-靶結合所致的一種電信號或頻率變化(頻移)，原位、實時直接檢測探針-靶的相互作用，並可揭示相互作用的動態機制。探針或靶無須偶聯螢光素等標記物，只有當結合反應的電信號或頻移極小或不存在時，可用帶電分子標記靶。
二、本實用新型可在1cm2晶片上作出上百萬個密度均勻、性能統一的微型化檢測位點陣列，其成本廉價，可與標準電子器件相當，而且這種微型傳感器陣列具有比其它方法更高的靈敏度和準確性。
三、本實用新型的原位生物晶片，可以採用電子檢測方法，由於是測量電信號隨頻率的變化，不存在傳感器陣列幅值特性受靶樣品溶液腐蝕的影響，因此本實用新型晶片可重複使用多次而不影響精度而且晶片還可塗敷獲得更長的使用壽命。
四、本實用新型將執行檢測位點定位和檢測的電路集成在晶片上的結構，使開關、信號處理和電源也都可以集成在同一晶片上，實現檢測系統的集成化、微型化、自動化，而且使用簡便，。同時，可大批量生產，大大降低成本。
五、本實用新型的微型檢測位點陣列結構，使用時由於一是不存在對未結合標記物的清洗，二是無須標記而減少了樣本製備時間，三是只要有足夠的結合量使電信號或頻移有明顯變化而無須等待反應完成，四是採用微處理器控制本晶片可提供超高速陣列定位測量，因此可大大縮短檢測時間。
六、本實用新型採用有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種作為探針組成探針陣列，能同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質，不限於現有生物晶片採用寡核苷酸探針僅應用於DNA序列測定，還可應用於同時鑑測多種特定有機化合物或生物分子或識別它們的混合物，尋找篩選具有生物作用的有機化合物或生物分子或細胞或微生物或它們的混合物，尋找發現有機化合物或生物分子或細跑或微生物或這些物質混合物的生物功能。
本實用新型的生物晶片配用於化學與生物分析儀器。並藉助已有的檢測技術，應用於鑑測有機化合物或生物分子或它們的混合物，研究發現有機化合物或生物分子或細胞或微生物的生物功能，尋找、篩選、分離、鑑定具有生物功能的有機化合物或生物分子或細胞或微生物或這些物質的混合物。可以進行生命科學、醫學和藥學中所涉及的各種生物化學反應及其檢測，從而獲取有關目標(靶)組分的成分、結構、性狀、功能的一維或多維信息。以生物晶片為核心構建的生物化學和藥物分析儀具有以下一些主要優點，分析全過程自動化、生產成本低、晶片可一次性使用避免汙染、分析速度可獲得成千上萬倍的提高、所需樣品量可獲得成百上千倍的減少、極高的多樣品處理能力、儀器體積小、重量輕、便於攜帶等。生物晶片技術可廣泛應用於疾病診斷和治療、藥物篩選、農作物的優育優選、司法鑑定、食品衛生監督、環境檢測、國防、航天等許多領域，它將為人類認識生命的起源、遺傳、發育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開闢全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。
下面，再用實施例及其附圖對本實用新型作進一步地說明。
附圖的簡要說明。


圖1是本實用新型的一種原位生物晶片的結構示意圖。
圖2是圖1中一個檢測位點部的放大圖。
圖3是圖2中電極部分的放大圖。
圖4是圖3的A-A局部的剖視圖。圖中19為電場。
圖5是本實用新型的一種原位生物晶片的另一種檢測位點的結構示意圖。
實施例1本實用新型的一種原位生物晶片，如圖1-4所示。由基片及其上的檢測位點陣列構成。
上述的基片1，採用絕緣或半導體材料和通常的方法製成平片形。使用的材料可以是單晶矽、玻璃、石英、剛玉片等。
在基片1上，採用大規模集成電路技術製成微型傳感器陣列。如圖1所示，在基片1上蒸鍍或濺射電阻材料如鎳鉻合金、鎢或鉑金屬制出與沿X坐標軸的M條RX地址線即RX1、RX2、RX3…RXM地址線，和沿Y坐標軸的N條RY地址線即RY1、RY2、RY3…RYN地址線相連的X電阻和Y電阻2構成的電阻陣列，上述M、N為正整數，各RX地址線和各RY地址線的一端分別與X電阻和Y電阻2相連，另一端分別與通常的X電阻邏輯電路3和Y電阻邏輯電路4相連，用於探針的定位合成。採用化學汽相澱積法，在電阻陣列上制出制出厚度約5000的SiO2膜層5，在SiO2膜層上制出與電阻陣列相對應的由沿X坐標軸的M條X地址線即X1、X2、X3…XM地址線，和沿Y坐標軸的N條Y地址線即Y1、Y2、Y3…YN地址線相交錯，上述M、N為正整數。然後在SiO2膜層上制出Si3O4掩膜層。採用光刻法制出電極圖形，再採用反應離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕去除Si3O4掩膜層制出位於X地址線和Y地址線交錯部的由各相互平行的槽形的穴孔，採用酸性緩衝液溼法腐蝕SiO2膜層，將各穴孔制出凹入的底面，構成MN個能盛裝樣品溶液6的檢測位點7。採用電子束蒸發法，分別在各底面的SiO2膜層5表面、和各餘留Si3O4掩膜層的表面，制出通常材料的粘接層，然後在粘接層上制出金屬化層，從而分別製得由金屬化層形成的呈指狀的位於Si3O4掩膜層上的上層的電極8、和位於底面上的下層的電極9。如圖3、4所示，至少一根呈指狀條形的位於上層的電極8、和至少一根呈指狀條形的位於下層的電極9。在電極8與SiO2+膜5之間依次有粘接層10和Si3O4掩膜層11，在電極9與SiO2膜5之間有粘接層10。多根電極8和多根電極9平行相間構成叉指狀的電極組。在檢測位點中的相鄰的兩根上層的電極8與其間的下層的電極9之間構成檢測池12，從而在檢測位點中形成多個檢測池。上述X地址線和Y地址線的一端分別與電極8和電極9相連、另一端分別與通常的X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14相連。X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與通常的檢測電路15相連構成多個傳感器，組成與上述電阻陣列相對應的傳感器陣列。在一個傳感器中的檢測池內的電極上固化一種探針16，傳感器陣列中各傳感器中的探針構成探列陣列，在探針陣列中可以有有機化合物探針、生物分子探針、細胞探針、微生物探針中的至少一種。從而組成檢測位點陣列。上述X電阻邏輯電路3、Y電阻邏輯電路4、X尋址邏輯電路13、Y尋址邏輯電路14、檢測電路15均可以集成在基片1上。
檢測位點7的探針16根據欲測的靶物質確定，可採用不同的探針，包括寡核苷酸、單或雙鏈DNA或RNA抗體或抗原-抗體複合物、腫瘤細胞以及其它任何可與靶物質互相結合的物質。如對RNA或DNA靶物質，探針可以是合成的寡核苷酸。在一個檢測位點上對應有一種探針，由多個檢測位點構成的陣列晶片上對應有由多種探針構成的探針組。本實用新型採用有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種作為探針組合成微陳列，同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質。即可對包括相應的多種靶物質的靶物質組同時進行檢測。
如圖4所示，本實用新型的探針16直接固定在檢測位點7中的檢測池12內的電極8和電極9上。探針也可固定在固體支撐物(圖中未顯示)上，在使用時將固體支撐物連同探針放入檢測池12內。固體支撐物，可以是有機或無機物基體，如玻璃、聚苯乙烯、聚亞醯胺、二氧化矽以及氮化矽。固定探針的固體支撐物或電極需預先功能化以產生有利於與所選探針共價連接的表面化學。例如，當選用玻璃作固定支撐物時，可通過與環氧矽烷反應使其環氧基功能化，在玻璃上的環氧基與5＇-氨基-衍生寡核苷酸探針反應，形成一仲胺共價聯接，而將探針聯接到玻璃的表面。如5＇醛或羧酸、氨基和磷酸的衍生物可分別與醯肼、重氮化活化以及氮基修飾的聚苯乙烯結合。在固定探針的電極的表面也需預處理覆層上能與探針直接結合的材料，這些材料包括金、氧化鈮、氧化銥、鉑、鈦、鉭、鎢及其它金屬，這些金屬表面能通過與探針上的有機巰基連接形成穩定的偶合物。如-5＇或3＇端標記上巰基的合成DNA探針可與金等金屬形成穩定的偶合物。
探針的固定可在合成各種探針後，採用微量移液管或微噴頭或針頭將各種探針逐點分布在基片表面各相應的檢測位點上。探針的固定方法可以採用通常的點樣固定探針法、原位合成探針法、探針定位合成法等。探針定位合成法通過圖4中的電阻2，在不影響相鄰檢測位點的情況下加熱晶片的設定檢測位點，進行探針的定位合成。
實施例2本實用新型的一種原位生物晶片，採用與實施例1相類似的方法製成。如圖1、5所示，本原位生物晶片由基片及其上的檢測位點陣列構成。本實施例可保留或去除圖1中的RX1、RX2、RX3…RXM地址線、RY1、RY2、RY3…RYN地址線、X電阻邏輯電路3、Y電阻邏輯電路4。
上述的基片1，與實施例1相同。在基片上制出厚度約5000的SiO2膜層5。在SiO2膜層上制出由沿X坐標軸的M條X地址線即X1、X2、X3…XM地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線即Y1、Y2、Y3…YN相交錯。再採用光刻法制出穴孔圖形，採用反應離子腐蝕法腐蝕SiO2膜層，在X地址線和Y地址線的MN交錯部制出制出凹入的圓孔形的穴孔，組成穴孔陣列。各穴孔的孔深約0.5μm、孔徑約2μm、孔間距2μm。採用化學汽相澱積法在SiO2膜層5上制出厚度約2000的多晶矽膜。採用反應離子腐蝕法，將各穴孔的底面17和上表面的多晶矽膜部分腐蝕去除，保留孔壁上的多晶矽膜。再用W或Ti或Pt材料，採用矽化反應將多晶矽膜金屬化，製成金屬化層18。採用化學鍍方法，在各孔壁的金屬化層18上，形成Ni或Au材料的電極8和電極9，構成多個能盛裝樣品溶液6的凹入呈圓孔形的檢測池12，組成檢測池陣列。也可以將各穴孔的底面和/或各電極表面，製成波紋狀表面。將各檢測池的電極8和電極9分別與各X地址線和Y地址線的一端相連，並將X地址線和Y地址線的另一端分別與用通常方法集成在基片1上的通常的X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與通常的檢測電路15相連，構成各傳感器，組成傳感器陣列。在各傳感器的電極上，採用與實施例1相同的方法固定探針16。組成檢測位點陣列。
使用本實用新型的原位生物晶片，如實施例1和實施例2的原位生物晶片對靶物質進行檢測的傳感檢測有兩大類型一類是基於檢測位點兩電極間的介質損耗、或是交流導納(阻抗)或是傳輸線射頻損耗的變化；另一類是基於用作檢測位點的微諧振器的諧振頻率或品質因子(Q)的變化。在檢測過程中本實用新型的原位生物晶片有機化合物探針、生物分子探針、細胞探針、微生物探針中的至少一種組合成探針微陳列，可同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質。
使用本實用新型的原位生物晶片的電學雜交檢測方法本實用新型的原位生物晶片可作為基因傳感器陣列用於檢測各檢測位點7是否存在靶基因。在DNA解碼檢測應用中，在每一檢測位點上固定大量的較短寡核苷酸鏈的探針16，探針鏈的一端與檢測位點表面相連。對一傳感器陣列，各檢測位點連有不同編碼序列的探針鏈，而每一檢測位點上所有探針鏈的編碼序列則是相同並且已知的。當在本實用新型的晶片的檢測位點的檢測池中注入含有未知(靶)DNA長鏈的樣品溶液6時，在理想情況下，靶DNA將只在含與其密碼序列部分互補序列的檢測位點上與寡核苷酸鏈的探針緊密結合，而不與其它任何檢測位點結合；實際上。往往會存在某些較弱的DNA錯配，但這些錯配可通過在適當的離子濃度和溫度下採用適當的樣品溶液清洗檢測池予以消除。因此，清洗後晶片上許多檢測池將含有結合成雜交的DNA，另外餘下的檢測池則仍只含有原寡核苷酸鏈探針。通過每個檢測位點的電極8和9依序電訊問各檢測池，可找到並記錄下含有雜交DNA的檢測位點。當檢測位點上有無雜交DNA時，其電性質將有明顯不同。如在DNA分子的諧振頻率下。前者樣品溶液介電常數約是後者的10-100倍。通常的交流電導檢測法、傳輸-損耗檢測法、線性調頻脈衝檢測法、微機械諧振器檢測法即是基於檢測各檢測位點變化而設計的。由此資料庫，通過「迭代」或「神經網絡」算法重構出靶DNA的完整編碼序列。
權利要求1.原位生物晶片，包含有SiO2膜層(5)的基片(1)，其特徵在於在SiO2膜層上有沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線相交錯，有在X地址線和Y地址線的交錯部的MN個能盛裝樣品溶液(6)的檢測池(12)，M、N為正整數，X地址線和Y地址線的一端分別與各檢測池的兩個電極(8、9)相連，另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構成MN個傳感器，組成傳感器陣列，在一個傳感器上固化一種探針(16)形成有至少一種探針的探針陣列，構成MN個檢測位點(7)，組成檢測位點陣列。
2.根據權利要求1所述的原位生物晶片，其特徵在於在SiO2膜層(5)下的基片(1)上，有分別與沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標軸的N條RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構成的與傳感器陣列相對應的電阻陣列，M、N為正整數，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)和Y電阻邏輯電路(4)相連。
3.根據權利要求1所述的原位生物晶片，其特徵在於所說的檢測位點(7)有至少一個圓孔形的檢測池(12)，檢測池的孔壁上有金屬化層(18)，所說的兩個電極(8、9)分別在孔壁的金屬化層上，檢測池的底面和/或電極的表面呈波紋狀。
4.根據權利要求2所述的原位生物晶片，其特徵在於所說的檢測位點(7)有至少一個相互平行的槽形的檢測池(12)，所說的電極呈指狀，有至少一根位於檢測池上層的電極(8)和至少一根位於檢測池下層的電極(9)，在上層的電極與SiO2膜層(5)之間依次有粘接層(10)和Si3O4掩膜層(11)，在下層的電極與SiO2膜層之間有粘接層(10)，檢測池的底面(17)和/或電極的表面呈波紋狀。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的原位生物晶片，其特徵在於所說的探針(16)是有機化合物探針、或生物分子探針、或細胞探針、或微生物探針，探針固化在檢測池(13)內的電極(8、9)表面上、或固化在檢測池內的固體支撐物上。
6.根據權利要求1、2、3或4所述的原位生物晶片，其特徵在於所說的X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)集成在基片(1)上。
7.根據權利要求2或4所述的原位生物晶片，其特徵在於所說的X電阻邏輯電路(3)、Y電阻邏輯電路(4)、X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)集成在基片(1)上。
專利摘要本實用新型涉及化學與生物分析儀器。旨在解決已有晶片不能進行原位和實時檢測的問題。本晶片包含基片及其上由相同微型傳感器構成的傳感器陣列，採用在一個傳感器上固定一種探針，而有有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少兩種探針構成的檢測位點陣列。用於生命科學、醫藥學、環境科學、生物技術等領域，鑑測有機化合物或生物分子或細胞或微生物或這些物質的混合物，研究發現其生物功能，尋找篩選具有生物功能的物質。
文檔編號G01N33/53GK2447791SQ0024468
公開日2001年9月12日 申請日期2000年10月16日 優先權日2000年10月16日
發明者莫志宏, 薛永新, 靳萍 申請人:莫志宏, 薛永新, 靳萍