基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒的製作方法
2023-09-18 06:46:40
專利名稱：基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒，屬於生物 技術領域。
背景技術：
肝癌是我國第二位癌症死因，手術是目前主要的治療手段。然而術後高轉移復發率(5 年復發率達70%，小肝癌也達50%)己成為進一步提高遠期療效的瓶頸，也是攻克肝癌的 重要關鍵。若能對肝癌根治術後的特定人群進行早期轉移復發的預測，及時給予幹預治療， 做到早發現早治療，會進一步提高根治性術後復發患者的生存率，也會有很大的社會效益 和經濟效益。
近年來癌周微環境在腫瘤發生及進展中的作用成為腫瘤研究的熱點。許多研究也顯示 Thl/Th2免疫的失衡與多種腫瘤相關。我們前期的研究工作已證實癌周微環境的炎症免疫 反應狀態與原發性肝癌患者術後轉移復發密切相關，可較準確預測轉移復發。而目前臨床 尚無足夠敏感和特異的預測指標來預測肝癌術後患者的轉移復發以及生存情況，甲胎蛋 白、腫瘤大小，包膜有無等雖與轉移復發有關但總體來說其預測準確率還很低，尤其對早 期肝癌的術後復發更無法預測。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒。
為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發 多分子預測試劑盒，其特徵在於，由包被試劑、洗液、辣根過氧化物酶標記的抗體、底物 液、終止液和預測參考值組成；
其中包被試劑由pH9. 6碳酸鹽包被緩衝液以及白細胞介素2抗體、白細胞介素15抗 體或白細胞介素5抗體組成；
洗液是pH7.4磷酸鹽緩衝液；
辣根過氧化物酶標記的抗體由辣根過氧化物酶標記的白細胞介素2抗體、辣根過氧化 物酶標記的白細胞介素15抗體和辣根過氧化物酶標記的白細胞介素5抗體組成； 底物液是四甲基聯苯胺底物溶液或ABTS底物溶液； 終止液是1.8-2. 1M硫酸；
預測參考值以肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度為4ug/ul為準白細胞介素2是20 —30pg/ml、白細胞介素15是32 — 43pg/ml，白細胞介素5是18_28pg/ml，不同加樣濃度， 預測參考值成比例變化。
所述碳酸鹽包被緩衝液是將碳酸鈉1. 59g和碳酸氫鈉2. 93g溶解於1000ml蒸餾水中 製成。
所述的磷酸鹽緩衝液是將0. 2g 0. 15M的磷酸二氫鉀溶液，2. 9g十二水合磷酸氫二鈉， 8. 0g氯化鈉，0. 2g氯化鉀，0. 5ml吐溫-20加到1000ml蒸餾水中製成。 本發明具有以下優點
1. 癌周肝組織中白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5能較準確地預測肝癌患 者術後的轉移復發，在133例早期肝癌患者中準確率分別為69.2%、 61.7%、 61.7%,白細 胞介素2還可以預測肝癌患者術後的生存或死亡，準確率為72. 9%。
2. 白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5明顯優於目前用於預測肝癌患者術 後復發和生存的臨床指標，如甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等，尤其對早期肝癌術後轉 移復發的預測有明顯的價值和意義。而且測定這些白細胞介素簡單易行且對患者無創傷性
(使用的是肝癌患者術中切除下來的肝組織)。
圖l為聚苯乙烯板示意圖2為白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5對肝癌患者術後的轉移復發的預 測情況圖3為白細胞介素2的無瘤生存曲線；
圖4為白細胞介素2的總生存曲線；
圖5為白細胞介素15的無瘤生存曲線；
圖6為白細胞介素5的無瘤生存曲線。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來說明本發明。
實施例l
一種可預測原發性肝癌病人手術後肝癌轉移復發的試劑盒，由包被試劑、洗液、辣 根過氧化物酶標記的抗體、底物液、終止液和預測參考值組成；
其中包被試劑由pH9. 6碳酸鹽包被緩衝液以及白細胞介素2抗體、白細胞介素15抗 體或白細胞介素5抗體組成；
洗液是pH7. 4磷酸鹽緩衝液；辣根過氧化物酶標記的抗體由辣根過氧化物酶標記的白細胞介素2抗體、辣根過氧化 物酶標記的白細胞介素15抗體和辣根過氧化物酶標記的白細胞介素5抗體組成； 底物液是四甲基聯苯胺底物溶液； 終止液是1.8M硫酸;
預測參考值以肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度為4ug/ul為準白細胞介素2是20— 30pg/ml、白細胞介素15是32 — 43pg/ml，白細胞介素5是18—28pg/ml，不同加樣濃度， 預測參考值成比例變化。
所述碳酸鹽包被緩衝液是將碳酸鈉1. 59g和碳酸氫鈉2. 93g溶解於1000ml蒸餾水中 製成。
所述的磷酸鹽緩衝液是將0. 2g 0. 15M的磷酸二氫鉀溶液，2. 9g十二水合磷酸氫二鈉， 8. 0g氯化鈉，0. 2g氯化鉀，0. 5ml吐溫_20加到1000ml蒸餾水中製成。
使用本試劑盒來預測原發性肝癌病人手術後肝癌轉移復發的具體步驟為
第一步包被用碳酸鹽包被緩衝液分別將白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介
素5抗體稀釋至蛋白質含量為5ug/ml，如圖l所示在聚苯乙烯板中的第l、 2、 3列反應 孔中分別加入白細胞介素2、白細胞介素15抗體、白細胞介素5抗體稀釋液，在第4、 5、 6列加入白細胞介素2抗體稀釋液，在第7、 8、 9列加入白細胞介素15抗體稀釋液，在第 10、 11、 12列加入白細胞介素5抗體稀釋液，每個反應孔中加0. lml， 4'C過夜。次日， 棄去孔內溶液，用磷酸鹽緩衝液洗3次，每次3分鐘。
第二步加樣加4ug/ul的待檢癌周肝組織抽提物0.1ml於上述已包被之反應孔中， 置37"C孵育1小時。然後用磷酸鹽緩衝液洗2次。同時將第l、 2、 3列反應孔分別做白細 胞介素2、白細胞介素15、白細胞介素5的系列稀釋標準品孔。
第三步加辣根過氧化物酶標記的抗體於各反應孔中，加入對應的新鮮稀釋的辣根
過氧化物酶標記抗體(經滴定後的稀釋度)O. lml。 37E孵育l小時，同上法洗滌。
第四步加底物液顯色於各反應孔中加入四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液O. lml， 37 °C20分鐘。
第五步終止反應於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
第六步測各孔吸光度值在ELISA檢測儀上，於450nm (若以ABTS顯色，則410nm) 處，以空白對照孔調零後測各孔吸光度值，根據標準品檢測結果繪製標準曲線，計算出待 檢樣本白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5濃度。
第七步應用於預測試劑盒檢測出的白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5的濃度，用於預測肝癌患者術後的轉移復發和肝癌患者術後的生存或死亡，當白細胞介素 2濃度低於25. 76pg/ml (加樣濃度為4ug/ul時)，白細胞介素15濃度低於37. 16pg/ml (加樣濃度為4ug/ul時)，或白細胞介素5濃度低於23. 173 pg/ml (加樣濃度為4ug/ul 時)，判斷肝癌患者術後易轉移復發，當白細胞介素2濃度低於25.76pg/ml (加樣濃度為 4ug/ul時)，判斷肝癌患者術後易死亡。
實施例2
一種可預測原發性肝癌病人手術後肝癌轉移復發的試劑盒，由包被試劑、洗液、辣根 過氧化物酶標記的抗體、底物液、終止液和預測參考值組成；
其中包被試劑由pH9. 6碳酸鹽包被緩衝液以及白細胞介素2抗體、白細胞介素15抗 體或白細胞介素5抗體組成；
洗液是pH7.4磷酸鹽緩衝液；
辣根過氧化物酶標記的抗體由辣根過氧化物酶標記的白細胞介素2抗體、辣根過氧化 物酶標記的白細胞介素15抗體和辣根過氧化物酶標記的白細胞介素5抗體組成； 底物液是ABTS底物溶液； 終止液是2. 1M硫酸；
預測參考值以肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度為4ug/ul為準白細胞介素2是20 — 30pg/ml、白細胞介素15是32 — 43pg/ml為分類標準，白細胞介素5是18 — 28pg/ml，不 同加樣濃度，預測參考值成比例變化。
所述碳酸鹽包被緩衝液是將碳酸鈉1. 59g和碳酸氫鈉2. 93g溶解於1000ml蒸餾水中 製成。
所述的磷酸鹽緩衝液是將0. 2g 0. 15M的磷酸二氫鉀溶液，2. 9g十二水合磷酸氫二鈉， 8. 0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，0. 5ml 吐溫-20加到1000ml蒸餾水中製成。 使用本試劑盒來預測原發性肝癌病人手術後肝癌轉移復發的具體步驟為-
第一步包被用碳酸鹽包被緩衝液分別將白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介
素5抗體稀釋至蛋白質含量為5yg/ml，如圖l所示在聚苯乙烯板中的第l、 2、 3列反應 孔中分別加入白細胞介素2、白細胞介素15抗體、白細胞介素5抗體稀釋液，在第4、 5、 6列加入白細胞介素2抗體稀釋液，在第7、 8、 9列加入白細胞介素15抗體稀釋液，在第 10、 11、 12列加入白細胞介素5抗體稀釋液，每個反應孔中加0. lml， 4。C過夜。次日， 棄去孔內溶液，用磷酸鹽緩衝液洗3次，每次3分鐘。
第二步加樣加4ug/ul的待檢癌周肝組織抽提物0. lml於上述已包被之反應孔中，置37t:孵育l小時。然後用磷酸鹽緩衝液洗2次。同時將第l、 2、 3列反應孔分別做白細 胞介素2、白細胞介素15、白細胞介素5的系列稀釋標準品孔。第三步加辣根過氧化物
酶標記的抗體於各反應孔中，加入對應的新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標記抗體(經滴定
後的稀釋度)O. lml。 37。C孵育l小時，同上法洗滌。
第四步加底物液顯色於各反應孔中加入或ABTS底物溶液O. lml， 37。C20分鐘。 第五步終止反應於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
第六步測各孔吸光度值在ELISA檢測儀上，於450nm (若以ABTS顯色，則410nm) 處，以空白對照孔調零後測各孔吸光度值，根據標準品檢測結果繪製標準曲線，計算出待 檢樣本白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5濃度。
第七步應用於預測試劑盒檢測出的白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5 的濃度，用於預測肝癌患者術後的轉移復發和肝癌患者術後的生存或死亡，當白細胞介素 2濃度低於25. 76pg/ml (加樣濃度為4ug/ul時)，白細胞介素15濃度低於37. 16pg/ml (加樣濃度為4ug/ul時)，或白細胞介素5濃度低於23. 173 pg/ml (加樣濃度為4ug/ul 時)，判斷肝癌患者術後易轉移復發，當白細胞介素2濃度低於25.76pg/ml (加樣濃度為 4ug/ul時)，判斷肝癌患者術後易死亡。
用實施例1-2中試劑盒在133例早期原發性肝癌患者中的檢測結果顯示
1. 如圖2所示，其中a代表白細胞介素2， b代表白細胞介素15， c代表白細胞介素 5，受試者工作特徵曲線顯示白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5可以預測肝癌 患者術後的轉移復發。它們曲線下的面積分別是0.627、 0.633、 0.602， P值分別為0.013、 0.009、 0.046。
2. Kaplan-Meier生存和復發分析顯示當加樣濃度(即肝癌癌周組織抽提物蛋白濃 度)為4ug/ul時，IL-2以25.76pg/ml為分類標準，IL-15以37. 16pg/ml為分類標準，IL-5 以23. 173 pg/ml為分類標準，如圖3所示，其中，a代表白細胞介素2低組，b代表白細胞介 素2高組，低水平IL-2比高水平IL-2病人復發率明顯升高(/7 = 3.48E-8)、如圖4所示，其 中，a代表白細胞介素2低組，b代表白細胞介素2高組，生存期明顯更短(p = 0.02);如圖 5所示，其中，a代表白細胞介素15低組，b代表白細胞介素15高組，低水平IL-15比高水平 IL-15病人明顯復發率升高(^0.004);如圖6所示，其中，a代表白細胞介素5低組，b代 表白細胞介素5高組，低水平IL-5比高水平IL-5病人明顯復發率升高(；H).02)。
3. 當加樣濃度(即肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度)為4ug/ul時，IL-2以25.76pg/ml 為參考值,低於25. 76pg/ml預測為轉移復發，高於25. 76pg/ml預測為不轉移復發，IL-2預測轉移復發準確率69. 2%.以同樣參考值IL-2預測生存準確率72. 9%. IL-15以37. 16pg/ml為參 考值，低於37. 16pg/ml預測為轉移復發，高於37. 16pg/ml預測為不轉移復發，IL-15預測轉 移復發準確率61. 7%. IL-5以23. 173 pg/ml為為參考值,低於23. 173 pg/ml預測為轉移復發， 高於23. 173 pg/ml預測為不轉移復發，比-5預測轉移復發準確率也為61.7%。
權利要求
1. 一種基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒，其特徵在於，由包被試劑、洗液、第一抗體、辣根過氧化物酶標記的抗體、底物液、終止液和預測參考值組成；其中包被試劑由pH9.6碳酸鹽包被緩衝液以及白細胞介素2抗體、白細胞介素15抗體或白細胞介素5抗體組成；洗液是pH7. 4磷酸鹽緩衝液；辣根過氧化物酶標記的抗體由辣根過氧化物酶標記的白細胞介素2抗體、辣根過氧化物酶標記的白細胞介素15抗體和辣根過氧化物酶標記的白細胞介素5抗體組成；底物液是四甲基聯苯胺底物溶液或ABTS底物溶液；終止液是1. 8-2.1M硫酸；預測參考值以肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度為4ug/ul為準白細胞介素2是20—30pg/ml、白細胞介素15是32—43pg/ml，白細胞介素5是18—28pg/ml，不同加樣濃度，預測參考值成比例變化。
2. 如權利要求1所述的一種基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒， 其特徵在於，所述的碳酸鹽包被緩衝液是將碳酸鈉1. 59g和碳酸氫鈉2. 93g溶解於1000ml 蒸餾水中製成。
3. 如權利要求1所述的一種基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑 盒，其特徵在於，所述的磷酸鹽緩衝液是將0. 2g 0. 15M的磷酸二氫鉀溶液，2. 9g十二水 合磷酸氫二鈉，8.0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，0.5ml吐溫-20加到1000ml蒸餾水中製成。
全文摘要
本發明提供了基於炎症因子的肝癌患者術後轉移復發多分子預測試劑盒，其特徵在於，由包被試劑、洗液、辣根過氧化物酶標記的抗體、底物液、終止液和預測參考值組成；其中包被試劑由pH9.6碳酸鹽包被緩衝液以及白細胞介素2抗體、白細胞介素15抗體或白細胞介素5抗體組成；預測參考值以肝癌癌周組織抽提物蛋白濃度為4ug/ul為準白細胞介素2是20-30pg/ml、白細胞介素15是32-43pg/ml，白細胞介素5是18-28pg/ml，不同加樣濃度，預測參考值成比例變化。本發明採用的癌周肝組織中白細胞介素2、白細胞介素15和白細胞介素5能較準確地預測肝癌患者術後的轉移復發。
文檔編號G01N33/543GK101441213SQ200810208150
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者周海軍, 欽倫秀, 華 黃 申請人:復旦大學附屬中山醫院