一種重組腈水解酶、基因、載體、工程菌及應用的製作方法
2023-09-18 06:54:30
(一)技術領域
本發明涉及一種重組腈水解酶、載體及應用，以及利用表達該腈水解酶的重組大腸桿菌進行生物催化亞氨基二乙腈(iminodiacetonitrile，idan)製備亞氨基二乙酸(iminodiaceticacid，ida)的方法。
(二)
背景技術：
腈水解酶是一類功能多樣的生物催化劑，可在溫和的條件下，通過一步反應催化有機腈類化合物水解得到相應的羧酸和氨。腈水解酶是一類具有廣泛底物譜的生物催化劑，具有獨特的催化特性，在有機合成中表現出巨大的工業應用潛力。
亞氨基二乙酸，分子式為hn(ch2cooh)2，易溶於水，難溶於乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑，是一種重要的化工中間體，廣泛用於螯合劑、表面活性劑、農藥等的合成，特別是全球性的除草劑草甘膦的中間體的製備。目前，一般採用化學方法進行亞氨基二乙酸的製備，主要包括：氯乙酸法、氯乙酸-氨基乙酸法、氮川三乙酸法、氯乙酸-甘氨酸法、二乙醇胺法和氫氰酸法等。以上化學方法存在生產成本高、汙染嚴重、對設備要求高等不足。生物酶法催化亞氨基二乙腈生產亞氨基二乙酸，具有高效、高選擇、反應條件溫和、環境汙染少、成本低、產物光學純度高等的優點，符合原子經濟學和綠色化學的發展方向，具有化學法無可比擬的優勢。
有關以亞氨基二乙腈為底物通過生物酶法生產亞氨基二乙酸的方法已經得到研究，相關的技術得到開發已經有所報導，包括菌株篩選(cn101629192a)、生物酶法(cn101392276a、cn102286409a、cn102277320a、cn102277322a)和產物亞氨基二乙酸的檢測方法(cn101398413a)。生物催化亞氨基二乙腈生產亞氨基二乙酸的過程如下：
在菌株篩選專利cn101629192a中報導：取1g溼菌體，置於500ml三角瓶中，加入50ml2％(w/w)的反應底物亞氨基二乙腈水溶液，30℃搖床150r/min條件下反應60min，篩選到具有催化活性的15株菌，其中糞產鹼桿菌(alcaligenesfaecaliszjb09138)的轉化率達54.8％。在生物酶法合成亞氨基二乙酸的專利(cn101392276a、cn102286409a、cn102277320a、cn102277322a)中，分別介紹了四種菌株為糞產鹼桿菌(alcaligenesfaecaliszjutb10)、紫紅紅球菌(rhodococcusrhodochrouszjb09125)、藤黃微球菌(micrococcusluteuszjb09131)和節桿菌(arthrobacternitroguajacolicuszjutb0699)。alcaligenesfaecaliszjutb10溼細胞為30g/l，在100ml0.2m亞氨基二乙腈的水溶液中，30℃200rpm條件下反應24h後，可得亞氨基二乙酸105.5mm，即產率可達52.8％；rhodococcusrhodochrouszjb09125、micrococcusluteuszjb09131和arthrobacternitroguajacolicuszjutb0699溼細胞分別為50g/l，在100ml3％(w/w)亞氨基二乙腈的水溶液(ph7.0)中，30℃200rpm條件下反應10h後，轉化率分別可達26.2％、24.8％和26.5％。在產物亞氨基二乙酸的檢測方法(cn101398413a)專利報導了其色譜條件：elitec18色譜柱，流動相：甲醇：0.05mol/l乙酸-乙酸鈉溶液(甲醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55:45)，流速：1.2ml/min。
然而，目前報導的生物酶法生產亞氨基二乙酸技術尚存在產率不高、底物耐受性低等問題，不能達到規模化工業生產的要求。
(三)
技術實現要素：
本發明目的是提供一種重組腈水解酶及該酶在催化水解亞氨基二乙腈製備亞氨基二乙酸中的應用。本發明獲得的重組腈水解酶具有較高的底物耐受性和催化活力，催化過程對環境友好。
本發明採用的技術方案是：
本發明涉及一種重組腈水解酶，所述重組腈水解酶的胺基酸序列為seqidno.1所示。
由於胺基酸序列的特殊性，任何含有seqidno.1所示胺基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述胺基酸序列同源性在90％以上，均屬於本發明保護範圍之列。具體的所述改變可包括胺基酸序列中胺基酸的缺失、插入或替換；其中，對於變體的保守性改變，所替換的胺基酸具有與原胺基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
本發明還提供一種所述重組腈水解酶的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為seqidno.2所示。
由於核苷酸序列的特殊性，任何seqidno.2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90％以上同源性，均屬於本發明保護範圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的肽蛋白的功能。
本發明還提供一種由所述重組腈水解酶編碼基因構建的重組載體。
本發明提供一種由所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。
本發明所述重組腈水解酶編碼基因在構建能夠催化亞氨基二乙腈製備亞氨基二乙酸的重組腈水解酶中的應用，所述的應用為：構建含有重組腈水解酶編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化獲得含重組腈水解酶的菌體細胞。
本發明涉及一種所述重組腈水解酶在製備亞氨基二乙酸中的應用，所述的應用為：將含有重組腈水解酶編碼基因的重組基因工程菌經發酵培養後的發酵液離心，以溼菌體或溼菌體破碎分離純化後的純酶作為催化劑，以亞氨基二乙腈為底物，以ph值為3.0～10.0(優選7.0～7.5)的50mm磷酸鹽緩衝液為反應介質構成反應體系，在25～70℃(優選30～35℃)轉化反應，反應結束後，將反應液分離純化，獲得亞氨基二乙酸。
所述底物初始濃度為0.02～0.63mol/l，優選0.315～0.63mol/l，所述溼菌體的用量為10～100g/l，優選50～100g/l，所述酶的用量為0.3～1g/l(即50～200u/l，優選127～200u/l)。
本發明所述催化劑的製備方法為：(1)斜面培養：將含有重組腈水解酶編碼基因的重組基因工程菌接種至斜面培養基，在28～37℃培養12～24小時，獲得斜面菌體；所述斜面培養基終濃度組成為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，20g/l瓊脂，溶劑為水，ph值為7.0；
(2)種子培養：從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至含終濃度50mg/l卡那黴素(kan)的lysogeny-broth(lb)液體培養基中，37℃培養10-12小時，獲得種子液；lb液體培養基終濃度組成：10g/l蛋白腖，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，溶劑為水，ph值為7.0；
(3)發酵培養：以體積濃度2％的接種量將種子液接種至含有終濃度50mg/l的kan的lb液體培養基進行發酵培養，37℃培養至培養液的od600為0.6-0.8之間，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mm，28℃誘導培養10小時，4℃、5000rpm離心10min，棄去上清液，收集溼菌體；
(4)分離純化：將收集的溼菌體在超純水(100g/l(w/v))中重懸，進行超聲波破碎(400w，15min)，取破碎後的上清液經nickel-nta柱純化，上柱之前先用緩衝液(終濃度300mmnacl，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)進行平衡；接著用洗脫緩衝液(終濃度300mmnacl、終濃度50mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))洗脫不具有吸附性的蛋白；最後，用蛋白洗脫液(終濃度300mmnacl和終濃度500mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產生的流出液，獲得重組腈水解酶純酶。
能夠提供本發明所述重組腈水解酶及其編碼基因的原始菌株為敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)zjb09122，該菌種保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno.m209044，已在先前申請的專利cn101629192b中披露，同時編碼基因的克隆內容已在專利cn104212784a中披露。
本發明的要點在於提供了seqidno.1所示的胺基酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列，在已知該胺基酸序列和核苷酸序列的情況下，該胺基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關載體、宿主細胞的獲得，對於本領域技術人員來說均是顯而易見的。
以專利cn104212784a披露的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1為基礎進行點飽和突變，以6％(w/v)亞氨基二乙腈為底物，應用突變後的菌株為催化劑生產亞氨基二乙酸，最終，將此菌株應用於工業化生產。
與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：本發明提供一種水解亞氨基二乙酸的重組腈水解酶，在催化上述反應時，可以耐受630mm亞氨基二乙腈，比酶活可達159.90u/g，具有良好的底物耐受性和催化活力，生產過程對環境友好；可有效解決傳統的化學法水解亞氨基二乙腈製備亞氨基二乙酸工藝中，存在的反應條件苛刻，需要消耗大量的有機溶劑，成本較高，收率較低，環境汙染較為嚴重等問題。
(四)附圖說明
圖1腈水解酶sds-page圖，maker(kda):130、95、72、55、43、34、26和17；條帶1：純化後的acnmut6；
圖2acnmut6腈水解酶的最適溫度分析；
圖3acnmut6腈水解酶的最適ph分析；
圖4acnmut6腈水解酶的動力學分析；
圖5acnmut6細胞催化的反應進程曲線。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：
實施例1
含有表達載體pet-28b(+)-acn1的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn1的構建已經在專利cn104212784a中披露，以此為基礎，為提高底物亞氨基二乙腈的耐受性和產物亞氨基二乙酸的產率，對其進行點飽和突變，設計突變引物如下：
tyr(y)54：
上遊引物1：5』-gttttcatccctggtnnnccgtattg-3』,
下遊引物2：5』-caatacggnnnaccagggatgaaaac-3』
thr(t)134:
上遊引物3：5』-aaaccannncacgttgaacgtacg-3』,
下遊引物4：5』-cgtacgttcaacgtgnnntggttt-3』,
trp(w)165：
上遊引物:5：5』-tctgaactgcnnngagcacgttc-3』
下遊引物6：5』-tgaacgtgctcnnngcagttcagacc-3』
phe(f)168：
上遊引物7：5』-gagcacnnncagccgctgtccaaattc-3』
下遊引物8：5』-cggctgnnngtgctcccagcagttc-3』
met(m)191：
上遊引物9：5』-ccggctnnntccccgctgcaac-3』
下遊引物10：5』-gttgcagcggggannnagccgg-3』
ser(s)192：
上遊引物11：5』-ttcttggccggctatgnnnccgctgc-3』
下遊引物12：5』-cagcggnnncatagccggccaagaag-3』
leu(l)201：
上遊引物13：5』-tgtttcaannntccatcgaggctaatgcg-3』
下遊引物14：5』-cgcattagcctcgatggannnttgaaac-3』
以acn1的基因序列為模板進行pcr擴增(pcr反應參數為：94℃4min；98℃10s，55℃15s，72℃6min，重複30個循環；72℃繼續延伸10min)。將擴增後回收的pcr產物用dpni酶切3h，應用純化試劑盒將酶切產物純化後轉化至e.colijm109受體菌，塗布於含終濃度50mg/lkan的lb固體平板上，37℃培養過夜後，平板上長出許多白色菌落。隨機挑取白色克隆提取質粒進行測序。測序後對突變後的陽性菌落進行純培養，提取質粒後轉入e.colibl21(de3)中表達，獲得含有重組腈水解酶基因(該核苷酸序列如seqidno：2所示)的e.colibl21(de3)。
實施例2
依據在實施例1的方法，經過六輪突變，最終得到最優突變體acnmut6(y54f/t134s/f168v/l201n/m191t/f192s)，對其進行培養：
(1)誘導培養：將含有表達載體pet28b(+)-acnmut6的e.colibl21(de3)，接種至含終濃度50mg/lkan的lysogeny-broth(lb)液體培養基中，37℃培養10-12小時，隨即以體積濃度2％的接種量接種至含有終濃度50mg/lkan的lb液體培養基進行擴大培養，37℃培養至培養液的od600為0.6-0.8之間，加入終濃度為0.1mm的iptg，28℃誘導培養10小時，4℃、5000rpm離心10min，收集經過誘導後的溼菌體(即催化劑)，進行sds-page檢測。
(2)分離純化：同時，進行ni柱分離純化，純化步驟如下：將收集的溼菌體1g進行超聲波破碎(400w，15min)，4℃、8000rpm離心10min，取10ml的上清液作為粗酶液，進行nickel-nta柱純化，上柱之前先用緩衝液(終濃度300mmnacl，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))進行平衡；接著用洗脫緩衝液(終濃度300mmnacl、終濃度50mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))洗脫不具有吸附性的蛋白；最後，用蛋白洗脫液(終濃度300mmnacl和終濃度500mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產生的流出液，獲得重組腈水解酶acnmut6純酶液，濃度為1.0mg/ml，將純酶液稀釋10倍後，用sds-page凝膠電泳對重組腈水解酶的表達進行驗證(見圖1)。
實施例3
將實施例2經iptg誘導後所得到的含重組腈水解酶突變體的大腸桿菌工程菌全細胞進行催化反應，以e.colibl21(de3)、未誘導的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acnmut6和經誘導的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1作為對照組，催化反應體系為10ml：以終濃度630mm亞氨基二乙腈為底物，以實施例2步驟(1)製備的溼菌體為催化劑，以ph值為7.0的50mm的磷酸鹽為反應介質。轉化體系中溼菌體的加入量為10g/l，在35℃進行轉化反應6h，反應結束後，取1ml樣品，用100μl2m鹽酸終止反應，4℃、12,000rpm離心3min取上清進行高效液相色譜分析。酶活(u)定義為：在35℃，ph7.0條件下，每小時催化產生1μmol亞氨基二乙酸所需的溼菌體量(酶量)為一個活力單位，比酶活(u/g或u/mgprotein)定義為：1g溼菌體或1mg純酶含有的酶活單位。
亞氨基二乙酸的液相色譜shimadzulc-20ad的分析檢測方法：色譜柱類型：anionexchangecolumnhypersilsax；色譜條件：柱溫30℃，檢測波長：210nm，流動相：20mm(nh4)2hpo4(用磷酸調至ph4.0)，流速：1.0ml/min。
從表1可以看出，未經iptg誘導的野生型菌株和突變菌株的酶活均為零，經iptg誘導後，發現e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acnmut6已成功構建，並能夠表達具有催化活性的腈水解酶，比酶活為159.90u/g，是原始菌株e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1的2.46倍。
表1腈水解酶溼菌體的酶活比較
實施例4
將實施例2製備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在不同溫度25-70℃範圍內(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃)進行活力檢測。反應體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為630mm，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，緩衝體系為ph7.5、50mm磷酸鹽緩衝液，在上述九個溫度梯度150rpm條件下，各轉化反應6h，反應結束後，取1ml樣品，用100μl2mhcl以終止反應，4℃、12,000rpm離心3min取上清進行高效液相色譜分析，檢測方法見實施例3。以沒有加入純酶的反應體系作為空白對照。實驗結果(見圖2)表明：未加入純酶的反應中，沒有檢測到有產物亞氨基二乙酸的生成，含有純酶的催化反應中，優選溫度為40℃時，腈水解酶mut6的比酶活最高，為174.65u/mg，算法見實施例3。
實施例5
將實施例2製備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在不同ph3.0-10.0範圍內進行活力檢測，反應體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為630mm，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，以不同ph值的緩衝液為反應介質，在35℃轉化反應6h，4℃、12,000rpm離心3min取上清進行高效液相色譜分析，檢測方法在實施例3。
緩衝體系為：檸檬酸-檸檬酸鈉(ph3.0、4.0、5.0、6.0)，磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀(ph7.0)，tris-hcl(ph8.0、9.0)和甘氨酸-氫氧化鈉(ph10.0)。以沒有加入純酶的反應體系作為空白對照。實驗結果(見圖3)：未加入純酶的反應中，沒有檢測到有產物亞氨基二乙酸的生成，有純酶的催化反應中，腈水解酶mut6的最適ph為7.0，對應的比酶活為137.41u/mg。
實施例6
將實施例2製備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在35℃溫浴5min，獲得預處理的酶液。反應體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為21-315mm(21mm、52.5mm、84mm、105mm、126mm、157.5mm、189mm、210mm、262.5mm、315mm)，以ph7.050mm的磷酸鹽緩衝液為反應介質，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，在35℃、150rpm水浴轉化反應，每30min取樣1ml，同時向樣品中加入200μl2mhcl水溶液終止反應製成樣品混合液，20μl樣品混合液進行高效液相色譜分析，檢測方法在實施例3。以未加入純酶的反應體系作為空白對照。
起始速率用米氏方程vo＝vmax[s]/([s]+km)來擬合，其中，vo表示初速度，vmax表示最大反應速率，[s]表示底物濃度，km表示米氏常數，通過origin8.0軟體進行作圖，通過倒數曲線計算出動力學常數vmax和km。實驗結果(見圖4)表明：未加入純酶的反應中，沒有檢測到有產物亞氨基二乙酸的生成，有純酶的催化反應中，重組腈水解酶acnmut6的km和vmax分別為536.2mm和769.2μmol/mg/h。
實施例7
將實施例2製備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))的活力分別在終濃度5mm金屬離子、edta、表面活性劑中檢測，並以無金屬離子、edta和表面活性劑條件下的反應作為空白對照(其酶的活力作為100％)。反應體系為10ml：亞氨基二乙腈(630mm)，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，終濃度分別為5mm金屬離子、edta和表面活性劑(sorbitol、sds、tween20、tween80)的ph7.050mm磷酸鹽緩衝液作為反應介質。在35℃條件下，反應6h，反應結束後，將反應液4℃、12,000rpm離心3min取上清進行高效液相色譜分析，檢測方法見實施例3。acnmut6實驗結果(見表2、表3)表明：co2+和edta2+可以增強重組腈水解酶acnmut6純酶的活力，而cu2+、zn2+等會顯著抑制酶活acnmut6表面活性劑sorbitol、sds、tween20和tween80的加入對重組腈水解酶acnmut6的活力都存在不同程度的抑制作用。
表2acnmut6腈水解酶的金屬離子分析
表3表面活性劑
實施例8
將實施例2得到的溼菌體進行生物催化，反應體系200ml，包括溼菌體用量100g/l(以沒有加入溼菌體的反應體系作為空白對照)，亞氨基二乙腈終濃度630mm，反應介質為ph7.0、50mm磷酸鹽緩衝液，反應時間：0-6h(具體取樣點為0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)，反應溫度：35℃，反應結束後，取反應液進行高效液相分析檢測，實驗結果(見圖5)表明：未加入溼菌體的反應中，沒有檢測到有產物亞氨基二酸的生成，有溼菌體的催化在反應5h後，突變體acnmut6的轉化率達90％以上，產率達80％以上。
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浙江工業大學
一種重組腈水解酶、基因、載體、工程菌及應用
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