一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法

2023-09-18 09:44:20

專利名稱：一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法，屬於仿生臟器製作
技術領域。
背景技術：
現在每年由於機械創傷、衰老以及各種疾病，大量患者需要進行組織和器官移植。 僅以我國為例，每年大約有150萬人因末期器官功能衰竭需要器官移植，但每年能夠使用
的器官數量不到i萬，供求比例達到i : 150。因此，目前採用不同的途徑和方法去解決移
植用臟器數量嚴重短缺的問題顯得十分迫切。 目前臨床常用的器官移植供體及缺點①異種組織器官移植，主要問題在於移植 物與受體相容性差。②同種異體組織器官移植，主要問題在於免疫排斥和供體有限。③自 體組織器官移植，主要問題在於供體有限和功能紊亂。④人工合成組織代用品移植，主要問 題在於異物反應和感染。⑤組織工程器官，具有良好的組織相容性，可以大量製備，不需要 免疫抑制治療；主要問題在於構建組織工程臟器的技術尚不成熟，離大規模臨床運用還有 一定距離。 20世紀80年代以來，組織工程學得到了長足的進步。在組織工程產生地美國，對 人體的皮膚、軟骨、骨、韌帶、肌肉、心臟瓣膜、肝、血管都進行了體外培養分化工作，並取得 一定成果。根據組織工程構建組織的結構和功能不同，組織臟器構建分為兩個領域①結構 性組織和臟器的構建此類組織臟器結構較為簡單，如骨、軟骨、肌腱等。目前國內外都已 有臨床應用報告，並取得了良好社會效益和經濟效益。②相對於結構性組織臟器的構建，具 有代謝功能的組織和臟器的構建(如心、肝、腎等的構建)是組織工程的終極目標，但是目 前需要攻克的難點較多。組織工程臟器的構建有四個主要問題需要解決(l)生物支架材 料的選擇和支架微觀宏觀結構的構建；(2)臟器血管網絡的構建；(3)種子細胞的選擇和培 養；(4)細胞生長微環境。 構建能夠運送氧氣、營養和代謝產物的血管網絡系統是構建大尺寸三維組織工程 臟器需要攻克的主要難點之一。為了能夠構建出滿足大尺寸三維組織工程臟器的血管網 絡，有研究者通過體外構建支架系統然後將支架系統移植入動物體內，藉助於動物的血管 生成形成毛細血管網絡。但是這種血管網絡的構建方法存在諸多缺點(l)需要手術實現 體內植入；(2)周期長；(3)支架系統厚度不能過大；(4)血管網絡內血流量小，不能滿足組 織工程心臟、腎臟、肝臟要求。近年來，已有國外研究者利用立體印表機技術構建空間組織 工程支架，並在其中預設微血管的生長空間，但是這種技術的精度仍不能在微米級別達到 構建血管網絡的要求，同時也不能使微血管完全按其預設通道進行生長。隨著納米技術的 發展，現在已有研究者能夠通過在薄膜上利用雷射預設通道精確導引細胞生長方向，另有 研究者利用可降解納米纖維上引導細胞生長。此外，以上構建的血管網絡是規則的血管走 行而非仿生血管網絡，規則的血管走行較之仿生血管網絡血細胞在其管腔內流動時會產生 較多的微型湍流，從而引起血栓形成機率增高。因此，仿生血管網絡的構建將是今後組織工
3程臟器構建的發展方向。

發明內容
本發明的目的是提供一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法。 為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種構建人體實質臟器仿生三維血
管網絡的方法，其特徵在於，具體步驟為 第一步利用CT採集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網絡圖像，對血管網絡進行三
維重建，將三維血管模型縮小，利用計算機將三維血管模型轉換成二維血管斷層圖，並引入
平面坐標，對各個血管斷面進行二維平面坐標精確定位和血管直徑小測定； 第二步將可降解材料P(CL-EC)製備的膜片浸於纖維蛋白膠溶液中後陰乾，製成
可降解膜片，並精確切割成與二維血管斷層圖相同面積，將膜片從上向下編號，膜片個數與
二維血管斷層圖的個數相同，膜片的總厚度與三維血管模型的厚度相同； 第三步根據不同層面的二維血管斷層的平面坐標圖，利用計算機雷射高精度打
孔機對可降解膜片進行打孔得到血管預製孔； 第四步分離、培養轉EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞和野生型C57BL/6J 小鼠的骨髓間充質幹細胞，利用脂質體將SDF-1基因和VEGF基因轉染部分野生型C57BL/6J 小鼠的骨髓間充質幹細胞； 第五步將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹細胞共培養，其中
中間編號的部分可降解膜片與轉染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間
充質幹細胞共培養，待細胞基本覆蓋膜片後，將材料按編號進行堆壘，放入細胞培養器，1天
後，在血管預製孔中注入轉EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞，培養得到人體實質臟器
仿生三維血管網絡。 本發明的優點如下 1.經文獻查新，本發明採用空間轉換定位技術來構建組織工程肝臟三維血管網 絡、具有良好的創新性。經過查詢專利資料庫，我們發現西安交通大學利用可降解膜巻曲折 疊進行構建的肝臟組織工程構架(專利號CN 100369590-C)並不能完全對肝臟血管網絡進 行仿生，且只能構建較小尺度的組織工程肝臟。本發明涉及的方法能夠仿生構建人體各實 質臟器血管網絡且不受尺寸限制。仿生血管網絡血細胞在其管腔內流動時不會產生明顯的 湍流，從而降低血栓形成機率，保證臟器的氧氣和營養供給。 2.本發明採用多排高速螺旋CT採集的高精度正常人實質臟器血管網絡圖形，並 進行二維轉換，平面血管坐標定位，這將保證臟器血管的精確仿生定位。雷射打孔技術的引 入，將保證膜片材料的精確打孔和三維血管網絡的復原。高精度的定位技術將為今後組織 工程臟器的構建提供了形態學上的保證。
具體實施例方式
下面結合實施例來具體說明本發明。
實施例 1.採集血管圖像，建立平面坐標圖復旦大學附屬中山醫院影像科已有64排CT 增強掃描採集的不同造影劑時相的人體肝臟血管CT斷層圖像。利用計算機對這些平面斷層圖像進行三維重建。按一定比例將肝血管模型縮小入50cmX 50cmX 50cm的區域內。利用 相應軟體對圖像中各血管進行空間定位，並轉換成50cmX50cm平面血管斷層圖。對平面血 管斷層圖引入平面坐標(X， Y)，對各個血管斷面進行二維平面坐標精確定位和血管管徑精 確測定。按12.5 : 1的比例縮小平面，形成4cmX4cm的平面血管斷層圖，此時高4cm的三 維模型，按層高O. 05cm/層，將有80層平面血管斷層圖，對其從上向下進行編號1，2，3…… 80。 2.可降解三維支架斷層膜片的製備將可降解材料P(CL-EC)(聚己內酯-碳酸亞 乙酯)和纖維蛋白膠壓製成厚0. 05cm可降解膜片，並精確切割成4. 0cmX4. OcmXO. 05cm 大小。將膜片從上向下編l-80號。 3.膜片精確雷射打孔將編好號碼的可降解膜片固定在特製的固定架上，置於計 算機雷射打孔機操作平臺，往計算機輸入不同層面的血管斷層的平面坐標圖及管徑，利用 計算機雷射打孔機對可降解膜片進行程序設定打孔。打孔完成後送掃描電鏡檢測，對孔徑、 位置不合要求編號的可降解膜片進行重新製備。
4.血管內皮祖細胞分離、體外擴增、純化 (1)5隻6-8周齡增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)轉基因C57BL/6J小鼠，處死取骨髓，用GIBCO公司生產的D-Hanks液20ml稀釋。將 稀釋之血液按l : 2的體積比置於淋巴細胞分離液的上方。水平離心機以2000rpm去閘離 心20分鐘。小心吸出單核細胞層，用5倍體積的M199培養液洗滌2次，培養液為80vo1 % GIBCO公司生產的M199培養液+20vol %胎牛血清(FBS)，再加入終濃度為20ng/mL的 VEGF(血管內皮細胞生長因子)以及終濃度為2ng/mL的bFGF(成纖維細胞生長因子)，並 分別離心，2000rpm和1500rpm各8分鐘，棄上清，重懸。 (2)細胞沉澱與培養液混懸後計數，調整細胞濃度為1X107L，移至 25cm2CELLBIND培養瓶，置於37°C 、5% C02培養箱中培養。培養第3天換液，用D-Hanks液 洗掉未貼壁的細胞，加入新培養液繼續培養。以後每3天換一次液。用倒置顯微鏡觀察細 胞形態。 (3) —周后當細胞數量達到107收集貼壁細胞予以0034+/^0133+磁珠篩選。調節 細胞濃度到10780ul，加入20ul單抗標記磁珠，6。C放置15min。 (pH7. 4)PBS洗滌，500rpm 離心10min，用PBS調整體積為500ul。過柱、洗滌、洗脫陰性細胞；將柱子脫離磁場，獲取陽 性細胞。 5.骨髓間充質幹細胞的分離培養 (1)取野生型C57BL/6J小鼠，與GIBCO公司生產的DMEM培養液(含16%胎牛血 清)混合後，鋪於6ml的淋巴細胞分離液(1.073g/l)之上。離心，取中層單個核細胞，置於 含DMEM液的細胞培養瓶中，於37t:，含5% C02飽和溼度的培養箱中培養。
(2) 24h後首次換液，以後每5天換液一次。經不斷增殖培養至細胞數達107/瓶，
細胞總數io8。 (3)取生長狀態良好的細胞，自第3代至第6代，採用流式細胞儀對MSCs表面抗原 CD29、 CD44、 CD45、 HLA-DR的表達進行檢測篩選。 (4)取第三代細胞，轉染前一天將MSCs接種於六孔板中，其中一孔為空白對照，細 胞密度為40-60%。稀釋10iiL Lipofectin2000(脂質體，Invitrogen公司生產)試劑於100 P L無血清、無抗菌素的DMEM(GIBCO公司生產)培養基。混勻後室溫靜置5min洞時稀 釋1-2 ii g待轉染質粒DNA(pcDNA3. 1-VEGF/SFD-1 Invitrogen公司構建)於100 ii L無血 清、無抗菌素的DMEM(GIBCO公司)培養基。混勻後室溫靜置5min ;混合兩種溶液，室溫靜 置25-30min。然後再加入800 y L無血清，無抗菌素的DMEM培養基(GIBCO公司)，棄掉六 孔板中的舊培養基，用2mL無血清、無抗菌素的DMEM(GIBC0公司)培養基清洗細胞2次；將 Lipofectin試劑-DNA混合物lmL覆蓋細胞，撫育6h ;吸出轉染液，加入含10%血清(GIBCO 公司)正常生長培養基DMEM， (GIBCO公司)37"培養；G418 (Invitrogen公司)篩選陽性細 胞。Western Blot， RT-PCR檢測轉染前後VEGF， SDF-1蛋白和mRNA的表達。
5.三維血管網絡的構建將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹 細胞共培養，(GIBC0公司DMEM培養基)，其中21-60編號的可降解膜片與轉染SDF-1/VEGF 的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質幹細胞共培養(GIBC0公司DMEM培養基)，待細胞基 本覆蓋膜片後，將材料按編號進行堆壘，放入細胞培養器，1天後，在血管預製孔中注入轉 EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞，培養7天。 6.血管網絡的觀測採用上海同步輻射光源實驗平臺，在7d，14d，30d，45d，60d利 用同步輻射光衍射成像技術對新生的微血管網絡進行動態觀測；在觀測期結束後用常規切 片染色和免疫組化(CD31，VI11因子)對血管網絡的形成情況進行觀察。
權利要求
一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法，其特徵在於，具體步驟為第一步利用CT採集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網絡圖像，對血管網絡進行三維重建，將三維血管模型縮小，利用計算機將三維血管模型轉換成二維血管斷層圖，並引入平面坐標，對各個血管斷面進行二維平面坐標精確定位和血管直徑φ測定；第二步將可降解材料P(CL-EC)製備的膜片浸於纖維蛋白膠溶液中後陰乾，製成可降解膜片，並精確切割成與二維血管斷層圖相同面積，將膜片從上向下編號，膜片個數與二維血管斷層圖的個數相同，膜片的總厚度與三維血管模型的厚度相同；第三步根據不同層面的二維血管斷層的平面坐標圖，利用計算機雷射高精度打孔機對可降解膜片進行打孔得到血管預製孔；第四步分離、培養轉EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞和野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹細胞，利用脂質體將SDF-1基因和VEGF基因轉染部分野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹細胞；第五步將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹細胞共培養，其中中間編號的部分可降解膜片與轉染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質幹細胞共培養，待細胞基本覆蓋膜片後，將材料按編號進行堆壘，放入細胞培養器，1天後，在血管預製孔中注入轉EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞，培養得到人體實質臟器仿生三維血管網絡。
全文摘要
本發明涉及一種構建人體實質臟器仿生三維血管網絡的方法，其特徵在於，具體步驟為採集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網絡圖像，將三維血管模型轉換成二維血管斷層圖；將P(CL-EC)置於纖維蛋白膠中間，壓製成膜片；利用計算機雷射高精度打孔機對可降解膜片進行打孔；將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質幹細胞共培養，其中中間編號的可降解膜片與轉染SDF-1/VEGF的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質幹細胞共培養，待細胞基本覆蓋膜片後，將材料按編號進行堆壘，在血管預製孔中注入轉EGFP基因C57BL/6J小鼠的內皮祖細胞。本發明的優點是能夠仿生構建人體各實質臟器血管網絡且不受尺寸限制。
文檔編號A61F2/06GK101751696SQ200910201588
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者凌志青, 劉震傑, 史振宇, 張祥滿, 符偉國 申請人:復旦大學附屬中山醫院