一種快速檢測生物樣品中β的製作方法

2023-09-17 13:49:35 1

專利名稱：一種快速檢測生物樣品中β的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物樣品中β2-受體興奮劑的快速檢測方法，特別是克侖特羅的快速檢測方法。
背景技術：
β2-腎上腺素受體興奮劑(以下簡稱β2-受體興奮劑)是一類人工合成的藥物，可選擇性地作用於β2-腎上腺素受體，在治療劑量下有強而持久地鬆弛支氣管平滑肌的作用，臨床上用於防治支氣管哮喘型慢性支氣管炎、肺氣腫等呼吸系統疾病所致的支氣管痙攣。當作為飼料添加劑的一種成份大劑量用於家畜飼養時，可使家畜體內能量從脂肪組織向肌肉組織轉移，促進家畜肌肉組織蛋白質的合成，加速脂肪的轉化和分解，使家畜生長速度加快，瘦肉相對增加，但其在家畜內臟及肌肉組織中的殘留可嚴重危害人類健康，過量攝入人體可引起交感神經興奮，出現肌肉震顫，心慌，頭昏，頭痛，嘔吐等中毒症狀，對高血壓、心臟病等疾病患者甚至可導致死亡(Gas chromatography-mass spectrometry analysis of β2-agoinst in bovine retina，Anal.Chim.Acta.，2000，408285-290)。
克侖特羅(化學名為羥甲叔丁基腎上腺素)是最常使用的β2-受體興奮劑之一。一般來說，飼料中添加適量克倫特羅後，可使畜禽生長速率、飼料轉化率、胴體瘦肉率提高10％以上，所以又將其稱為″瘦肉精″。克侖特羅進入人體後分布快、代謝緩慢，易引起中毒。
1990年西班牙發生了第1例克侖特羅中毒的報導，患者是在食用含有克侖特羅的動物肝臟後出現肌肉震顫、心動過速、心悸、眩暈等症狀，持續時間平均為40小時。於是國際上頒布法規禁止將β2-受體興奮劑作為生長促進劑使用，世界衛生組織也規定了農畜產品中克侖特羅的最高殘留限量為1μg/l(maximum residual level，MRL)。1998年5月，香港居民因食用內地供應的豬內臟，造成17人中毒的「瘦肉精」中毒事件。我國農業部發文「嚴禁生產和使用β-興奮劑類產品和未經農業部批准的獸藥及飼料藥物添加劑」，並於1999年發布《中華人民共和國動物及動物源食品中殘留物質監控計劃》明令禁止在家畜飼養中使用β2-受體興奮劑。但由於缺乏快速、準確、靈敏的檢測畜產品中β2-受體興奮劑殘留量的方法和標準，在一定程度上給查禁工作帶來困難，中毒事件仍時有發生。最近，廣東、浙江發生的數起「毒豬肉」中毒事件就是因為食用了含「瘦肉精」的豬肉或豬內臟所致。因此如何快速、準確地測定克侖特羅在食品中殘留水平成為我國食品衛生部門、檢驗檢疫部門所關注的問題。
目前已有的檢測β2-受體興奮劑的方法包括酶聯免疫分析法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜/質譜法(GC/MS)。其中酶聯免疫分析法速度快、靈敏度高(檢出限可達0.1μg/l)，但由於存在較高的假陽性率，只能用作篩選方法[參見「酶聯免疫吸附分析法檢測克侖特羅時假陽性問題的探討」一文，載於《檢驗檢疫科學》，2000，10(1)41-43]；高效液相色譜法準確性較好，但靈敏度較低(檢出限僅為1mg/l)，限制了該法在實際檢測中的應用[參見「家畜及飼料中克侖特羅等β-興奮劑的檢測與確證技術的近況」一文，載於《現代商檢科技》，1998，8(5)52-56]；目前多採用GC/MS法作為確證方法，但該法採用固相萃取(SPE)對樣品進行前處理，操作過程繁瑣，需要大量有機溶劑[參見Determinationof clenbuterol in bovine urine using gas chromatography-mass spectrometry followingclean-up on an ion-eschange resin，1999，72867-73]。現有檢測方法的局限性和不足，在一定程度上限制了對包括克侖特羅在內的β2-受體興奮劑的有效監測。因此，尋找一種速度快、準確性好、靈敏度高、假陽性率低、操作簡單、有機溶劑消耗少的檢測β2-受體興奮劑的新方法，是該領域當前所共同面臨的課題。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法及其在鹽酸克侖特羅檢測中的應用，使其具有速度快、準確性好、靈敏度高、假陽性率低、操作簡單、有機溶劑消耗少等優點，以克服現有檢測方法的不足。
本發明提供的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法依次包括以下步驟a.將待檢測的生物樣品經葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含結合狀態的β2-受體興奮劑變為游離態；b.以固相微萃取方法對樣品中的β2-受體興奮劑進行萃取；c.將萃取後的固相微萃取纖維立即進行衍生化反應；d.將吸附了待測物後經衍生化反應的固相微萃取纖維插入氣相色譜/質譜(GC/MS)進樣器中解析，質譜採用電子轟擊(Electron Impact Ion Source，EI)電離方式；採用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標準曲線計算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
本發明快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑方法的具體實施方法是1.酶解，即步驟a
生物樣品需要經葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶的酶解，因攝入生物體內的β2-受體興奮劑部分會與葡萄糖醛酸或硫酸根結合以結合物的形式存在，親水性強，不能被SPME纖維有效地萃取，酶解使這部分結合狀態的β2-受體興奮劑變為游離態，更易於被SPME纖維所吸附。尿樣需用乙酸調節pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶於37℃水浴中孵育1小時；組織樣(肝臟、肺、肌肉組織等)經絞碎、勻漿後，用乙酸調節pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶於37℃水浴中孵育1小時，然後過濾。
2.萃取，即步驟b取8ml待測樣品(尿樣或組織樣濾液)於潔淨10ml萃取小瓶中(預先放入磁力攪拌子)，在攪拌(磁力攪拌子)狀態下直接用SPME裝置進行萃取。通過試驗(如正交試驗)確定溶液最佳pH值、最佳鹽濃度、最佳萃取溫度及最佳萃取時間，以獲得最大萃取量。萃取時間選擇萃取達到平衡的時間(即待測物在固相塗層/液相之間分配達到平衡狀態的時間)，如果平衡時間過長也可以選擇非平衡點萃取，但此時要獲得較好的重現性需控制萃取時間嚴格一致。pH值的選擇應使待測物在溶液中呈中性分子形式，而非帶電荷的離子形式，這樣易於被SPME纖維吸附，β2-受體興奮劑多為鹼性物質，因而在鹼性條件下多以中性分子形式存在，有較大萃取量。在溶液中加鹽(NaCl或Na2SO4)可提高溶液的離子強度，從而提高β2-受體興奮劑的固相塗層/液相分配係數，可增加萃取量。
3.衍生，即步驟cβ2-受體興奮劑的衍生多用矽烷化試劑，矽烷化試劑遇水會發生反應，採用頂空氣相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式可避免衍生劑與水溶液直接接觸，同時也避免了纖維與衍生劑液體的直接接觸，防止衍生劑對纖維塗層造成損害。萃取後的SPME纖維立即插入預先封有5μl衍生劑的小瓶(體積為2ml)中，將纖維暴露於衍生劑氣相頂空中，於60℃衍生反應10min。衍生反應時間和溫度需經優化，以使衍生反應進行完全。
4.解析測定，即步驟d將吸附了待測物的纖維插入GC/MS的進樣器中，於270℃解析3min。解析溫度和解析時間需經優化，以使解析完全；離子化採用電子轟擊(Electron Impact Ion Source，EI)電離或化學離子化；採用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標準曲線計算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，其固相微萃取方法是使用帶有聚丙烯酸酯(PA)塗層纖維萃取頭的固相微萃取裝置，以直接法，即將纖維萃取頭直接插入樣品中進行萃取；所說的衍生化反應是以N，O-雙三甲基矽烷基三氟乙醯胺(BSTFA)為衍生劑，採用頂空衍生法進行衍生化反應；所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
本發明將衍生化固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)技術與氣相色譜/質譜(GC/MS)聯用同時檢測一種或多種β2-受體興奮劑，其原理是利用待測物對活性固體表面(SPME纖維表面的塗層)有一定的吸附親和力，使其從樣品中分離，並富集於SPME纖維上；再將纖維置於衍生劑的氣相頂空中進行衍生化反應；最後於GC/MS系統中檢測。該方法克服原有方法假陽性率高、靈敏度低、前處理操作過程繁瑣，需要大量有機溶劑的缺點，可有效應用於家畜尿樣及組織(如肝臟、腎臟、肌肉、視網膜等)樣品中β2-受體興奮劑殘留量的檢測，具有操作簡單、分析快速、準確性好、靈敏度高、所需有機溶劑少、經濟、無毒害、無汙染等優點，可同時測定一種或多種β2-受體興奮劑。本方法還可用於法醫鑑定中人類尿樣、發樣中β2-受體興奮劑的分析及家畜尿樣及組織樣品中抗生素類藥物的分析。
本發明方法的樣品的萃取、衍生、進樣過程全部在纖維上完成，操作簡單；單個樣品的分析時間小於2小時，檢測快速，克服原有GC/MS法操作繁瑣，檢測時間長的缺點；採用質譜作檢測器，分析準確度高，克服了ELISA法假陽性率高的缺點；且該方法有較高的靈敏度，檢出限可達0.25μg/l，克服了HPLC法靈敏度低的問題。
下面通過對本發明方法在檢測β2-受體興奮劑克侖特羅中的應用，對本發明作進一步的說明。


圖1為尿液中克侖特羅標準曲線；圖2為實施例中1號樣品的SIM色譜圖及質譜圖；圖3為實施例中2號樣品的SIM色譜圖及質譜圖；圖4為實施例中3號樣品的SIM色譜圖及質譜圖。
具體實施例方式
本發明方法在檢測豬尿樣品中鹽酸克侖特羅(俗稱「瘦肉精」)殘留量中的應用。
取豬尿樣品三份，各10ml，用乙酸調節pH值到5.2，分別加入100μlβ-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震蕩，於37℃水浴中孵育1小時。
再用pH值為9濃度為0.1M的硼酸緩衝溶液稀釋尿樣(按1∶3的比例)，稀釋的目的是防止加鹽後樣品產生渾濁，或者用過濾的方法除去渾濁。加入10.0g氯化鈉，使其濃度為0.25g/ml，取8ml到萃取瓶中(預先放入磁力攪拌子)，蓋上瓶塞，插入SPME裝置，推出纖維，於40℃攪拌狀態下萃取30min。SPME纖維選擇的是商用聚丙烯酸酯(PA)塗層纖維，塗層厚度為85μm(購自美國Supelco公司)。
萃取後的SPME纖維立即插入預先封有5μl衍生劑(N，O-雙三甲基矽烷基三氟乙醯胺，BSTFA)的小瓶(體積為2ml)中，將纖維暴露於衍生劑氣相頂空中，於60℃衍生反應10min。
將吸附了待測物的纖維插入GC/MS的進樣器中，解析3min。GC/MS條件如下色譜柱DB-5MS，25m×0.25mm ID，0.25μm膜厚；載氣氦氣，恆定線速度40cm/s；進樣口溫度270℃，無分流進樣；柱溫程序初始溫度120℃，保持1min，然後以10℃/min的速度升溫，溫度升至280℃時保持1min；色譜-質譜接口溫度270℃；離子源溫度200℃；電子能量70eV；溶劑延遲5min；質譜採用電子轟擊(EI)電離方式；採用選擇離子檢測方式(SIM)，以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。見附圖2、3、4。
繪製標準曲線時，取一定量經檢測無克侖特羅的豬尿樣品，添加鹽酸克侖特羅標準，用乙酸調節pH值到5.2，按1ml尿樣加10μl酶溶液的比例分別加入適量β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震蕩，於37℃水浴中孵育1小時，用pH值為9濃度為0.1M的硼酸緩衝溶液按1∶3稀釋，稀釋後克侖特羅濃度分別為2μg/l、5μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l，加入適量氯化鈉，使其濃度為0.25g/ml。取8ml到萃取瓶中，按上述SPME方法進行萃取、衍生、解析進樣，按上述GC/MS條件進行檢測，以峰面積對鹽酸克侖特羅濃度繪製工作曲線，如附圖1所示。
實際樣品定量時，用SIM所得峰面積對照標準曲線可計算出樣品中鹽酸克侖特羅的濃度。表1為上述3份樣品的測定結果，每份樣品平行測定三次取平均值。因尿樣經過稀釋，其原始濃度為所測濃度的4倍。
表1 SPME-HSD-GC/MS檢測實際尿樣的結果樣品1 樣品2樣品31 2 3 1 2 3 1 2 3峰面積 101347 111138 116666 20163 22578 25113 86052 79183 96470C188.87 97 101.56 21.62 23.62 25.72 76.2 70.51 84.83C95.80 23.6577.18C2383.21 94.61308.72C1稀釋後尿樣中克侖特羅的濃度(μg/l)C稀釋後尿樣中克侖特羅的濃度均值(μg/l)C2原始尿樣中克侖特羅的濃度(μg/l)用傳統SPE-GC/MS方法測定此三份樣品，與SPME-HSD-GC/MS方法進行比較，結果見表2。經t檢驗，兩種檢測方法結果的差異無統計學意義。
表2 兩種方法檢測實際尿樣中克侖特羅濃度的結果比較(單位μg/l)樣品號SPE-GC/MSSPME-HSD-GC/MS1390.67 383.21285.68 94.613330.52 308.72該方法在2μg/l～200μg/l範圍內線性良好(r＝0.9982)，檢出限為0.25μg/l，方法的精密度良好RSD＜10％，加標回收率在95％～107％之間。
本發明方法(SPME-HSD-GC/MS法)檢測一批樣品的時間只需2小時，較傳統的SPE-GC/MS法(5小時)大大節約時間；SPME-HSD-GC/MS法所需衍生劑的量很少(5μl)，而傳統的SPE-GC/MS法需100μl；採用質譜作檢測器，保留了準確性好的優點，且檢出限可達0.25μg/l，靈敏度高。
權利要求
1.一種快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於依次包括以下步驟a.將待檢測的生物樣品經葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含結合狀態的β2-受體興奮劑變為游離態；b.以固相微萃取方法對樣品中的β2-受體興奮劑進行萃取；c.將萃取後的固相微萃取纖維立即進行衍生化反應；d.將吸附了待測物後經衍生化反應的固相微萃取纖維插入氣相色譜/質譜(GC/MS)進樣器中解析，離子化，採用選擇離子檢測方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面積定量，用SIM所得峰面積對照標準曲線計算出待測樣品中β2-受體興奮劑的濃度。
2.根據權利要求1所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的固相微萃取方法是使用帶有聚丙烯酸酯(PA)塗層纖維萃取頭的固相微萃取裝置，以直接法，即將纖維萃取頭直接插入樣品中進行萃取。
3.根據權利要求1、2所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的衍生化反應是以N，O-雙三甲基矽烷基三氟乙醯胺(BSTFA)為衍生劑，採用頂空氣相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式進行衍生化反應。
4.根據權利要求1、2所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的離子化是電子轟擊(Electron ImpactIon Source，EI)電離方式。
5.根據權利要求3所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的離子化採用的是電子轟擊(ElectronImpact Ion Source，EI)電離方式。
6.根據權利要求1、2或5所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
7.根據權利要求3所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
8.根據權利要求4所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法，其特徵在於，當所檢測的β2-受體興奮劑為克侖特羅時，所說的選擇離子檢測方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量離子。
9.權利要求1至8中任一項所述的快速檢測生物樣品中β2-受體興奮劑的方法在克侖特羅檢測中的應用。
全文摘要
本發明提供的快速檢測生物樣品中β
文檔編號G01N30/06GK1487294SQ02139138
公開日2004年4月7日 申請日期2002年9月30日 優先權日2002年9月30日
發明者梁亞莉, 胡小鍾, 殷斌志, 嚴志剛, 餘建新, 林雁飛, 劉紅衛 申請人:華中科技大學同濟醫學院