一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法
2023-09-18 01:30:35
專利名稱：一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法
技術領域：
本發明屬於植物病原線蟲生物學領域，涉及腐爛莖線蟲種群高質量純化培養的方法。
背景技術：
甘薯腐爛莖線蟲病是我國農業上的重要病害，在國內主要分布於河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省區。其病原物甘薯腐爛莖線蟲OViJ^y7cAm D然tructor)最早在馬鈴薯上發現，導致馬鈴薯腐爛(Thorne G，1945年提出)。甘薯莖線蟲病是我國甘薯產區的重要病害之一，其病原腐爛莖線蟲是我國重要的檢疫性對象。近年來由於甘薯生產上引種不當，造成甘薯莖線蟲病的大面積蔓延。危害越來越嚴重，已經危及了甘薯的生產。該病害是由線蟲危害引起的，病原經南京農業大學丁再福，林茂松等鑑定是馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)，這是植物寄生線蟲中惟一引起植物幹腐症狀的病原物，甘薯受到馬鈴薯腐爛莖線蟲的侵染，輕者減產10% -30%，重者達50% -80%，甚至絕收。該線蟲除了危害馬鈴薯、甘薯，還危害胡蘿蔔、花生、薄荷等。
獲得群體純度高、生命力良好的線蟲是系統研究該線蟲生物學特性、致病機理、種群群體及個體遺傳變異等工作的基礎和前提。目前系統進行純化培養該線蟲的方法，一般通過下述幾種渠道獲得，如在P D A平板中接入茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani )、灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers)和毛殼菌 (Chaetomiumsp)，25°C溫箱中暗培養腐爛莖線蟲，另外劉斌等人報導採用玉米培養基培養的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)對腐爛莖線蟲進行的單異活體培養，在室內可以快速和大量繁殖腐爛莖線蟲(劉斌，鄭經武，2006，浙江農業學報)；阮龍等人報導採用甘薯髮根單寄主培養體系繁殖馬鈴薯腐爛莖線蟲的方法(阮龍，吳飛，姜疆等，生物技術通報， 2006第六期)，上述純化培養方法都是通過接種大量線蟲獲得成功，且純化成功的基礎是在大量線蟲接種前進行腐生線蟲等其他蟲體的去除，如漆永紅等人報導在接種線蟲前先吸出 400至500條腐爛莖線蟲，然後在顯微鏡下去除腐生線蟲(漆永紅，李秀花，馬娟.華北農學報.2008)。上述方法在實際應用中如果線蟲群體純度不高，且攜帶其他土壤線蟲的話， 去除這些雜蟲所需工作量必然加大，難免攜帶雜蟲，降低了培養的純度，這對於快速接種、 高質量純化線蟲帶來不便，同時上述純化培養繁殖方法雖然給快速大量繁殖線蟲帶來了便利，但若腐爛莖線蟲在真菌上長時期繁殖培養(寄主發生改變的情況下)，可能在致病力等生物學特性方面發生轉變。阮龍等人報導採用甘薯髮根單寄主培養體系繁殖馬鈴薯腐爛莖線蟲的方法不僅存在著上述缺陷，而且方法非常繁雜。因此，高質量純化培養線蟲顯得非常重要。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，該方法不僅簡單、容易操作，而且獲得的線蟲群體純度高、生命力好。
本發明通過以下技術方案實現
一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼蟲、雄蟲放到器皿中備用；
(2)純化培養
將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內，再將切下的薯塊做為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後平放在培養箱裡，於25°C培養30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。本發明進一步改進方案是，一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然後放到器皿中備用；
(2)純化培養
將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內，再將切下的薯塊做為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後放置在培養箱裡，於25°C培養30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。上述兩種方法，甘薯斷面上孔的直徑均為2-6毫米(直徑太大容易漂移，且浪費薯塊)，深度為10-30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4釐米(只要便於培養後的線蟲取出分離，孔間距應儘量小一些，節約薯塊)。在培養箱內預先噴施少量無菌水，以保持薯塊溼潤的生長環境。在每個孔裡注入少許無菌水，其目的在於接種線蟲時，便於線蟲由挑針游離到無菌水裡，而不至於被挑針與薯塊擠壓致死。上述兩種方法，分別重複20次。將每次得到的腐爛莖線蟲均放入計數皿中分離觀察，對原始數據進行標準化處理，應用DPS統計軟體處理數據，計算平均數並進行差異性比較。結果顯示，腐爛莖線蟲群體採用已受孕單條雌蟲及線蟲自交兩種方法進行種群的純化培養試驗是可行的。單雌純化培養與該線蟲親本自交相比，純化繁殖成功的概率顯著增高，達65%，培養30天後分離觀察後代平均數量為84. 15，比親本自交平均繁殖後代數 137.4在Patl5水平上顯著降低，分析認為可能在單條雌蟲接種之前部分卵塊已經排出體外所致。研究也發現兩種方法所分離到的線蟲群體整齊度相對均一，但採用單雌純化繁殖所需工作量相對較少，約為2小時；而採用線蟲親本自交的工作量相對較大，約為4小時 』另研究發現腐爛莖線蟲不存在孤雌生殖現象，其繁殖後代只能通過有性生殖進行。表1為單雌純化培養與親本自交純化培養結果統計注表中平均後代數a、b分別代表在Patl5水平上存在顯著性。即親本自交平均後代數 137. 4條與單雌繁殖平均後代數84. 15條在數量差異顯著性表現上有95%置信度。本發明與現有技術相比，具有以下明顯優點
本發明用兩種方法純化培養腐爛莖線蟲，分別都獲得較好的效果，方法簡單、容易操作、工作量小，更為重要的是獲得的群體純度高、生命力好，為系統研究該線蟲的生物學特性、致病機理、種群群體及個體的遺傳變異等工作的提供了保證。
圖1為薯塊切片打孔示意圖。
具體實施例方式實施例1
本實施例中供試腐爛莖線蟲群體由南京農業大學植物保護學院線蟲實驗室提供。所用薯塊品種為蘇渝303 (對腐爛莖線蟲無抗性)，由江蘇省農科院提供。一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然後放到凹面皿中備用；
(2)純化培養
將整薯縱向切去三分之一(得到三分之一的薯塊1，三分之二的薯塊2)，在三分之二薯塊的斷面上打孔(如圖1所示，甘薯斷面上孔3的直徑為3毫米，深度為20毫米，孔與孔的間距為3釐米)，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內，再將三分之一的薯塊1作為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的三分之二的薯塊2上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後放置在培養箱裡(放置前，預先在培養箱內噴施少量無菌水，以保持薯塊溼潤的生長環境)，於25°C培養 30天得到若干純腐爛莖線蟲。在本實施例中，分離線蟲時選用孔徑為13mm的打孔器將孔3取出分離。圖中所示，共有二十個孔3。分離結果見表1中單雌繁殖。實施例2
一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼雌蟲、雄蟲放到器皿中備用；
(2)純化培養
將整薯縱向切去三分之一(得到三分之一的薯塊1，三分之二的薯塊2)，在三分之二薯塊的斷面上打孔(如圖1所示，甘薯斷面上孔3的直徑為3毫米，深度為20毫米，孔與孔的間距為3釐米)，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼雌蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內，再將三分之一的薯塊1作為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的三分之二的薯塊2上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後平放在培養箱裡(放置前，預先在培養箱內噴施少量無菌水，以保持薯塊溼潤的生長環境)，於25°C培養30天得到若干純腐爛莖線蟲。 在本實施例中，分離線蟲時選用孔徑為13mm的打孔器將孔3取出分離。圖中所示，共有二十個孔3。分離結果見表1中親本自交。
權利要求
1.一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於包括下列步驟(1)線蟲的準備在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然後放到器皿中備用；(2)純化培養將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內，再將切下的薯塊做為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後放置在培養箱裡，於25°C培養30天得到若干純腐爛莖線蟲。
2.如權利要求1所述的一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於甘薯斷面上接種線蟲孔的直徑為2-6毫米，深度為1(Γ30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4釐米。
3.如權利要求1所述的一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於在培養箱內接入腐爛莖線蟲前，預先噴施少量無菌水，以保持薯塊溼潤的生長環境。
4.一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於包括下列步驟(1)線蟲的準備在40Χ體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼蟲、雄蟲放到器皿中備用；(2)純化培養將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內，再將切下的薯塊做為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後放置在培養箱裡，於25°C培養30天得到若干純腐爛莖線蟲。
5.如權利要求4所述的一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於甘薯斷面上接種線蟲孔的直徑為2-6毫米，深度為1(Γ30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4釐米。
6.如權利要求4所述的一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特徵在於在培養箱內接入腐爛莖線蟲前，預先噴施少量無菌水，以保持薯塊溼潤的生長環境。
全文摘要
本發明公開了一種純化培養甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟(1)線蟲的準備。在40×體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100×顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然後放到器皿中備用；(2)純化培養。將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔裡注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之後將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內，再將切下的薯塊做為天然保溼蓋蓋在接入腐爛莖線蟲後的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，並用彈性材料捆綁後放置在培養箱裡，於25℃培養30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。本發明方法簡單、容易操作、工作量小，更為重要的是獲得的群體純度高、生命力好，為系統研究該線蟲的生物學特性、致病機理、種群群體及個體的遺傳變異等工作的提供了保證。
文檔編號A23K1/18GK102318585SQ201110128860
公開日2012年1月18日 申請日期2011年5月18日 優先權日2011年5月18日
發明者李茹, 梁照文, 王宏寶 申請人:江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所