甘草中主要化學成分的生物提取方法
2023-09-18 01:04:10 1
專利名稱：甘草中主要化學成分的生物提取方法
技術領域：
本發明涉及藥品、食品、日化品、化妝品添加劑以及獸藥、飼料添加劑生產技術領域，涉及一種用於中藥化學成分的生物提取技術及其應用，具體地說，是應用酶工程和發酵工程為核心技術的工藝從甘草中提取主要化學成分甘草酸，並將其製成中間體原料或終端產品。
背景技術：
甘草(Glycyrrhiza)為豆科屬多年生植物，種類較多，主要分布於我國西北、華北、華中和東北地區，具有抗寒、抗鹽鹼、耐熱、耐旱等優良特性，生態適應性強，生命力旺盛，系乾旱、半乾旱地區重要的植物資源之一。甘草被我國認定為食藥兩用植物，目前作為調味劑、增稠劑、輔助劑、添加劑、防腐劑、抗氧化劑等被廣泛用於食品、飼料、化妝品和日用化工等產業，但其最重要的用途是在醫藥領域。中醫藥有「十方九草」之說，即大部分中藥複方的配伍都離不開甘草，被譽為中藥的「國佬」；其主要化學成分甘草酸及其藥理活性成分甘草次酸，更是被大量用於中成藥和現代中藥中。此外，甘草以其獨特而顯著的藥學作用，也受到了其它國家特別是發達國家的極大關注，成為和銀杏齊名的被西方國家進行了較為徹底研究和開發的植物藥。甘草酸的衍生物甘草酸鈉(GaAHS)在英、法、日、德等國獲得了用作抗癌藥的專利，其治療子宮癌、直腸癌及膀胱癌的療效，超過了氨甲喋呤、長春新鹼、5-氟尿嘧啶等常用抗癌藥的療效，而無一般抗癌藥的嚴重副作用。
近幾年來，甘草主要化學成分在抑制愛滋病毒(HIV)、防治潰瘍病以及抗過敏、保肝、降脂、解毒等方面的顯著效果，也引起了國內外藥學界的極大興趣，加大了對甘草的開發和商業化力度。正因如此，從80年代至今，甘草一直是我國乃至全球的緊缺植物藥材，特別是野生甘草，由於利益驅動下的無限制採挖，已在瀕危邊沿。另一方面，甘草作為重要的固沙植物品種，對治理沙漠、防治土地荒漠化同樣具有重要意義，故國家曾多次下文，禁止對原產地的野生甘草進行濫採亂挖，從而更加劇了獲得和利用甘草資源的壓力；目前甘草雖已實現人工栽培，但還遠遠不能滿足國內外市場的旺盛需求。
從甘草主要化學成分的提取技術來看，目前的常規工藝幾乎均涉及強酸、強鹼和各種有機萃取劑的應用，存在如下一系列弊端①過多的萃取用料和設備增加生產成本；②過度產生的化學劑萃取廢液嚴重汙染環境；③常規技術不能有效解除根莖類中藥中含有的大量木質素和纖維素對藥效學成分的結構阻隔作用，致使有效成分的溶出和得率偏低，大量藥渣丟棄，嚴重浪費資源，也汙染環境；④強酸、強鹼和其它萃取溶劑的劇烈化學反應條件，造成有效化學成分消旋化、異構化和結構重排等問題，明顯影響有效成分的穩定性、純度和藥學效果；⑤無機和有機萃取溶劑的強烈藥理作用和/或易爆性、腐蝕性等，對工作環境和人體健康存在安全威脅。鑑於上述情況，亟需開發可以明顯提高有效成分得率(從而相對節省原料)、高效綜合利用原料資源、反應條件溫和、大幅度減少廢水廢渣、有利於環境保護、安全生產以及降低對人體健康威脅的新型中藥提取工藝。
發明內容
本發明的目的在於應用酶工程和發酵工程為核心技術的工藝從甘草中提取其主要化學成分甘草酸，旨在克服傳統提取工藝的上述弊端，提供能夠充分綜合利用中藥資源、可使有效成分得率大幅度提高、不使用對環境和人體健康有害的萃取劑及其設備、提取條件溫和節能、幾乎沒有廢液和廢渣排放、可產生高附加值副產品的一種增效節耗、環境友好、資源節約的綠色提取工藝，從而達到有效利用寶貴的甘草資源、促進甘草及中藥產業發展的目的。
本發明的另一目的是將提取、純化的甘草有效成分用製劑學上的通用方法製成各類劑型，包括散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、口服液、注射液等。
實現本發明的目的技術方案如下一種甘草中主要化學成分的生物提取方法，包括以下步驟將甘草經細粉化和超微粉化處理後，由來自微生物的木質素降解酶系粗酶液和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應，用生物降解酶深度破壞甘草細胞壁及細胞網架結構，酶解反應後通過煎提、分級過濾，得到富含有效成分的濾液和主要含無關成分的濾渣；將濾渣進一步處理，分離成副產品木質素和纖維素，將濾液減壓濃縮為發酵原液，接種嗜甘草乳桿菌進行厭氧液體深層發酵；終止發酵後先離心去除菌體，再用相應有機溶劑從發酵物中分別萃取出甘草酸粗品，進一步用吸附和重結晶方法對其進行純化，得到純品；用製劑學通用方法將甘草酸粗品和/或純品製成所需的各類製劑，包括散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、口服液、注射液等。
所述甘草包括《中國藥典》中收載的甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、脹果甘草(G.inflata.Bat.)、光果甘草(G.glabra L.)和已在我國存在的黃甘草(G.eurycarpa P.)、粗毛甘草(G.aspera)、雲南甘草(G.yunnanesis)、刺果甘草(G.lallidiflora)及圓果甘草(G.sguanulosa)等。
所述細粉化和超微粉化處理，指將甘草切片後，通過機械粉碎設備粉碎成為平均粒徑100-150μm的細粉體，再通過氣流粉碎設備粉碎成為5-25μm的超微粉體。
所述產木質素降解酶微生物採用革菌科白腐真菌，更優選地，採用採絨革蓋菌(Coriolus versicolor，即雲芝菌)，出發菌株購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心(菌株編號GIM5.178)，由本發明人反覆馴化誘導為木質素降解酶系高產菌株後，送中國典型培養物保藏中心保藏(保藏編號CCTCC NO.M207024)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為雲芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)；粗酶液製備過程雲芝菌株接種於PDA斜面培養基恢復培養(復壯)7天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，28℃，150r/min恆溫振蕩培養5天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的不鏽鋼氣升式發酵罐中，30℃，100r/min好氧深層液體培養；約12d測多酚過氧化物酶活達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏備用。
所述產纖維素降解酶微生物採用木黴屬絲狀真菌，更優選地，本發明採用綠色木黴(Trichoderma viride)，出發菌株購自中國科學院普通微生物中心(菌株編號3.3711)，由本發明人反覆馴化誘導為纖維素降解酶系高產菌株後，送中國典型培養物保藏中心保藏(保藏編號CCTCC NO.M207025)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為綠色木黴ODK-TL1(Trichodermaviride ODK-TL1)；粗酶液製備過程綠色木黴菌株接種於PDA斜面培養基恢復培養(復壯)5天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，32℃，120r/min恆溫振蕩培養3天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的氣升式發酵罐中，35℃，100r/min好氧深層液體培養；約4d測濾紙酶活(FPA)達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏備用。
所述酶解反應，指以1∶4的料液比，在反應釜中充分混合甘草超微粉體和上述兩種粗酶液，每6h一次間歇攪拌，進行共酶解反應；以單位質量溶出甘草酸含量為評價指標，通過正交試驗，優化出兩種粗酶液共酶解甘草的最佳條件為雲芝酶液∶綠色木黴酶液的比例為1∶1，溫度30℃，酶解反應周期48h。
所述發酵原液的獲得，指將完成酶解反應的甘草物料與蒸餾水以料水比1∶10(w/v)的比例混合後，加熱至100℃，煎提120min；以60目、100目、200目、300目、500目、800目篩分級過濾，收集濾液，將濾渣再次煎提60min，合併濾液，減壓濃縮至原體積的1/3，成為發酵原液。
所述濾渣的處理，指將煎提和分級過濾後留下的不溶物(濾泥)，乾燥後用70％乙醇按料液比1∶10混勻，回流浸提3次，每次30min，合併浸提液，低速分離(2500r/min)出可溶性的上清和不溶性的沉澱，分別蒸發乾燥，前者主要為木質素超微粉體，後者主要為纖維素超微粉體，兩者均用作生物基原料。
所述厭氧液體深層發酵，指用本發明人自行分離馴化的嗜甘草植物乳桿菌(菌種保藏號CCTCC NO.M207026)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為植物乳桿菌ODK-LR1(Lactobacillusplantarum ODK-LR1)先在種子罐中增菌培養，生物量達到1011cfu/ml後，以1％的接種量轉入發酵罐中，對上述甘草原液進行厭氧液體深層發酵；通過正交試驗，優化出中試水平的最佳發酵條件為溫度35℃，pH6.0，攪拌速度100r/min，間歇攪拌5min/2h，發酵周期72h。
所述甘草酸萃取，指發酵終止並去除菌體後，發酵物加4倍量80％乙醇加熱溶解，1/40活性炭回流脫色30min，冷卻，過濾，水洗3次後濃縮濾液，60℃以下蒸發乾燥，得甘草酸粗品；將粗品溶於熱水，調pH6.0-6.5，過矽膠柱層析，將洗脫液減壓蒸乾後，用75％乙醇重結晶，得甘草酸純品。發酵物中未被乙醇溶解的部分，可繼續用於提取甘草的其它生理活性成分。
所述製劑製備，指用製劑學上通用的方法，將甘草酸粗品和/或純品，製成各種劑型，包括散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、口服液、注射液等。
本發明方法還可應用於其它根莖類中藥，諸如黃芪、川芎、五加皮、升麻、天麻、括樓根、白朮、柴胡、桔梗、地黃、接骨木、黃柏、遠志、龍膽草、黨參、桂枝、當歸、人參等。
本發明的有益效果在於1.本發明與傳統工藝相比，甘草酸提取的得率有數倍以上的增加，不僅明顯提高了甘草的藥用價值，也相對節約了緊缺的甘草資源；2.本發明技術方案以生物法酶解反應和微生物發酵為核心工藝，大部分工作單元在常溫、常壓下進行，較傳統工藝明顯減少了能耗；
3.與傳統工藝相比，本發明最突出的優點之一是擯棄了應用強酸、強鹼和有機溶劑做為主要提取方法的工藝，而用溫和的微生物酶法取代，不僅基本消除了強酸、強鹼、有害溶劑廢水排放造成的環境汙染，減少相關設備和試劑成本，而且基本杜絕了強烈化學反應導致目的產物的質量問題以及產品中化學溶劑殘留帶來的潛在健康威脅。
4.與傳統工藝相比，本發明的另一突出優點是通過酶分解的高選擇性和發酵法的高生物量特性，可得到一系列附加值高的副產物，通過資源綜合利用提高了經濟效益，有較高價值的副產物包括1)通過酶解-醇提過程從甘草中獲得高純度木質素和纖維素；2)通過發酵-離心過程從發酵液中獲得高生物量有益微生物菌體；3)經過本工藝路線充分處理的萃取殘液，仍可用於繼續提取甘草的其它含量少但生理活性顯著的有效物質，如黃酮類、多糖類、醇類等化學成分。
5.甘草經本工藝路線處理的過程產物，可根據純度不同(即甘草酸的含量水平不同)，分成等級，用於不同產業領域，以擴大市場範圍。即①製備發酵原液所餘濾渣(去除木質素和纖維素後)以及未經萃取的發酵物，可直接製備飼料級中間體原料或產品；②發酵後經初步萃取和脫色的甘草酸粗品，可用於製備食品級中間體原料或產品；③經過柱層析純化所得甘草酸純品用於製備醫藥級中間體原料或產品。
6.由於本工藝路線涉及的溶劑只有水和乙醇，熱源為蒸汽，原料和相應的工具微生物均無毒無害，故溶劑和熱源易於處理回收，循環利用，進一步節約了成本，最後的少量藥渣亦可加工成生物飼料或有機肥料，可基本做到「三廢」的零排放，具有顯著的生態效益。
圖1顯示了木質素酶系和纖維素酶系共酶解甘草對甘草酸溶出量的增加效果；圖2顯示了植物乳桿菌發酵甘草對甘草酸溶出量的增加效果。
具體實施例方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明的一種甘草中主要化學成分的生物提取方法進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
為了驗證本發明技術路線的有效性，發明人進行了如下工作1.考察了工藝中物理破碎處理對甘草主要化學成分得率的影響常規獲得甘草主要化學成分的方法是甘草飲片煎煮提取，更標準的傳統方法為索氏提取法，認為甘草飲片經索氏提取，甘草酸提取率可達100％。
本發明根據上述觀點所得實驗結果見表1表1 甘草飲片不同煎煮時間及索氏提取甘草酸溶出量
表1可以看出，用煎煮法從甘草飲片中提取甘草甜素得率不佳，最高只有22.44mg.g-1，用索氏提取法，甘草飲片的甘草酸溶出率為100％，也只有25.27mg.g-1，遠低於資料顯示的甘草根莖中所含甘草酸最高可達乾重14％的實際含量，表明傳統提取方法效果較差，有改進必要。本發明人認為，甘草酸得率不佳的主要原因系甘草根莖組織對甘草酸溶出的結構阻隔作用，因此本發明人首先採用機械粉碎+氣流粉碎的方法部分消除此種結構阻隔作用。處理結果見表2表2 甘草機械粉碎(細粉體)和氣流粉碎(超微粉體)後甘草酸溶出量
表2可以看出，以同樣的煎煮時間和次數，甘草機械粉碎後的細粉體和氣流粉碎後的超微粉體甘草酸的溶出量有較大幅度的漸次增加，表明甘草的物理破碎處理有助於解除對甘草酸溶出的結構阻隔作用。
2.考察了工藝中增加酶解過程對甘草主要化學成分得率的影響在物理破碎的基礎上，本發明人採用木質素降解酶系和纖維素降解酶系的粗酶液，對甘草超微粉體進行共酶解反應，以期進一步解除甘草組織的結構阻隔作用。酶解前後水提處理結果見表3表3 木質素酶和纖維素酶共酶解反應前後甘草酸溶出量的比較
表3結果可見，酶解後水提物中的甘草酸溶出量(乾燥後測定結果)較酶解前有顯著提高，表明共酶解反應可在超微粉碎基礎上，通過水解作用深入破壞木質纖維素網絡架構，進一步解除甘草組織的結構阻隔作用，增加甘草酸的溶出量。
3.考察了工藝中增加發酵過程對甘草主要化學成分得率的影響以共酶解後的濃縮甘草水提液為發酵原液，用嗜甘草乳桿菌對甘草成分進行發酵，通過微生物酶的生化反應進一步解離與甘草酸化學結合的其它成分。發酵前後樣品的甘草酸測定結果見表4表4 甘草發酵原液和乳桿菌發酵液中甘草酸含量和溶出率比較
表4結果可見，發酵後發酵液中的甘草酸含量以及發酵物的甘草酸溶出量(乾燥後測定結果)均較發酵前的發酵原液明顯增加，表明酶解-水提後的發酵過程通過微生物酶的生物化學活動進一步解離了與甘草酸結合的其它成分，使得甘草酸的溶出量繼續顯著提高。
4.考察了工藝中增加純化過程對甘草酸純度的影響在前述工藝路線基礎上，用熱乙醇萃取得到甘草酸粗品，再經柱層析-重結晶得到甘草酸純品。為了評價純化過程的有效性和純化產品的質量，以甘草酸標準品(購自中國國家藥品生物製品檢定所)為純度標準，用高效液相色譜法(HPLC)檢驗本發明技術方案獲得甘草酸的純度。結果見表5表5 甘草酸粗品樣本及純品樣本HPLC純度測定結果
表5結果可見，發酵後萃取的甘草酸粗品與標準品相比，純度為標準品的76.32％，經柱層析-重結晶純化，則提高到99.07％，表明純化過程大大提高了甘草酸的純度，優化了質量，使本工藝所獲產品適合於用作中間體原料和製劑製備。
實施例1甘草酸中間體原料的製備目的獲得飼料級、食品級、藥品級中間體原料。
共性技術路線甘草洗淨、除雜、烘乾、切片，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm；反應釜內與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液；乳桿菌對發酵原液進行厭氧液體深層發酵，終止發酵後分離菌體並滅酶，發酵產物經熱乙醇萃取、活性炭脫色並過濾得甘草酸粗品，矽膠柱層析、乙醇重結晶得甘草酸純品。
產品製備工藝將上述所得剔除木質素、纖維素的發酵原液濾渣和去除菌體的發酵液合併，減壓濃縮後烘箱內乾燥，得粉末狀(超微粉體)產品，是為飼料級甘草酸中間體原料，甘草酸純度不低於50％，密封包裝待用。
將上述所得甘草發酵液去菌滅酶後，熱乙醇萃取，萃取物活性炭脫色、過濾後真空濃縮，噴霧乾燥，得粉末狀產品，是為食品級甘草酸中間體原料，甘草酸純度不低於75％，密封包裝待用。
將上述所得甘草酸萃取物進一步過柱層析，洗脫液蒸乾後乙醇重結晶，真空冷凍乾燥，得粉末狀產品，是為藥品級甘草酸中間體原料，甘草酸純度不低於95％，密封包裝待用。
實施例2甘草酸口服膠囊製備目的獲得甘草酸口服製劑。
共性技術路線甘草飲片淨化後，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm，與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應48h，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，乳桿菌對甘草發酵原液進行厭氧液體深層發酵，終止發酵後分離菌體並滅酶，發酵物熱乙醇萃取、活性炭脫色並過濾得甘草酸粗品，矽膠柱層析、乙醇重結晶得甘草酸純品。
產品製備工藝將上述技術路線所得甘草酸粗品或純品進行噴霧乾燥或真空冷凍乾燥，得淡黃色疏鬆粉末狀產品，無菌環境下與輔料β-環糊精以4；1的比例混合，充分混勻，80％的乙醇為潤溼劑，沸騰乾燥制粒，平均粒徑控制在50～100μm，自動灌裝硬膠囊，泡眼薄膜鋁塑板包裝，輻照滅菌後加外包裝。
實施例3甘草酸單銨鹽注射液製備目的獲得甘草酸注射用製劑。
共性技術路線甘草飲片淨化後，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm，與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應48h，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，乳桿菌對甘草發酵原液進行厭氧液體深層發酵，終止發酵後分離菌體並滅酶，發酵物熱乙醇萃取、活性炭回流脫色並過濾得甘草酸粗品濾液。
產品製備工藝將上述技術路線所得甘草酸粗品濾液用氨水調pH7～7.5，靜置沉澱，少量酒精洗滌後室溫乾燥得甘草酸三銨鹽，用等量冰醋酸重結晶2次，再用4倍量80％乙醇加熱溶解，活性炭再次脫色，過濾除菌，真空冷凍乾燥得白色結晶，是為甘草酸單銨鹽，注射用水或葡萄糖注射液溶解至一定濃度，加適量穩定劑後分裝密封。
實施例4甘草酸生物轉化為甘草次酸目的體外獲得甘草酸的藥理活性成分甘草次酸。
共性技術路線甘草飲片淨化後，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm，與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應48h，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，乳桿菌對甘草發酵原液進行厭氧液體深層發酵，終止發酵後離心去除乳桿菌菌體。
產品製備工藝將上述技術路線所得去菌體發酵液加熱滅酶後，按2％接種量接種本發明人馴化而得的甘草酸真桿菌(出發菌株編號ATCC NO.25540)，繼續進行厭氧液體深層發酵，發酵條件pH5.0-6.0，溫度30-35℃，周期80-96h。發酵菌株大量產生的葡萄糖醛酸苷酶將發酵液中的甘草酸生物轉化為其甙元甘草次酸。終止發酵後，按前述方法萃取甘草次酸粗品和純品。
實施例5甘草藥學成分甘草黃酮的提取目的獲得甘草中甘草酸以外的另一藥學成分甘草黃酮。
共性技術路線甘草飲片淨化後，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm，與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應48h，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，乳桿菌對甘草發酵原液進行厭氧液體深層發酵，終止發酵後離心去除乳桿菌菌體，熱乙醇萃取甘草酸。
產品製備工藝將上述經熱乙醇萃取完甘草酸後的發酵殘液，熱水溶解後用乙酸乙酯繼續萃取，取水層，正丁醇再次萃取，濃縮、乾燥得淺棕色固體，是為甘草總黃酮。進一步聚醯胺柱層析，乙醇-水系統梯度洗脫，可收集到三個流分流分1用矽膠柱中壓層析，氯仿＝甲醇系統梯度洗脫，分離得到甘草苷和異芒柄花苷；流分2先用SephadexLH-20柱層析，再製備薄層層析(氯仿∶甲醇＝8∶2)，分離得到異甘草苷；流分3先後經矽膠夾板層析、低壓聚醯胺柱層析和製備薄層層析，可分離得到新異甘草苷和甘草素。
實施例6木質素中間體原料的製備目的獲得高純度木質素中間體原料產品。
共性技術路線甘草洗淨、除雜、烘乾、切片，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm；反應釜內與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，收集分級過濾後的所有濾渣。
產品製備工藝將上述技術路線所得濾渣，用80％乙醇按料液比＝1∶10的比例充分混勻浸提，低速分離(2500r/min)出可溶性上清和不溶性沉澱，收集可溶性上清，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，合併浸提液，抽濾、蒸餾回收乙醇，濃縮液的pH調至4.0充分沉澱，將沉澱徹底乾燥，得木質素產品，其中木質素含量不低於90％，佔甘草乾重不低於20％，密封包裝待用。
實施例7纖維素中間體原料的製備目的獲得高純度纖維素中間體原料產品。
共性技術路線甘草洗淨、除雜、烘乾、切片，機械粉碎至平均粒度100～150μm，再氣流粉碎至平均粒度5～25μm；反應釜內與木質素降解酶系和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應，純水煎提，濾液分級過濾並濃縮為發酵原液，收集分級過濾後的所有濾渣，用80％乙醇按料液比＝1∶10的比例充分混勻浸提，低速分離(2500r/min)出可溶性上清和不溶性沉澱，收集沉澱，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，收集不溶性沉澱。
產品製備工藝將上述技術路線所得不溶性沉澱物，用18％的氫氧化鈉溶液按料液比＝1∶20的比例混合，加熱至120℃，攪拌45min，水洗3次後充分乾燥，得纖維素產品，其中纖維素含量不低於90％，佔甘草乾重不低於35％，密封包裝待用。
本發明的實施例是為了更好地理解本發明進行的詳細的描述，並不是對本發明所保護的範圍的限定，本發明的保護範圍以本發明權利要求限定為準。因此，本領域普通技術人員不脫離本發明的主旨未經創造性勞動而對本明所做的改變在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於包括以下步驟將甘草經細粉化和超微粉化處理；由來自微生物的木質素降解酶系粗酶液和纖維素降解酶系粗酶液進行共酶解反應；酶解反應後通過煎提、分級過濾，得到富含有效成分的濾液和主要含無關成分的濾渣；濾渣處理，分離成副產品木質素和纖維素，將濾液減壓濃縮為發酵原液；將所述發酵原液接種嗜甘草乳桿菌進行厭氧液體深層發酵；終止發酵後先離心去除菌體，再從發酵物中萃取出甘草酸粗品，進一步用吸附和重結晶方法對其進行純化得到甘草酸純品。
2.根據權利要求1所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於還包括利用製劑學通用方法將所述甘草酸粗品和/或甘草酸純品製成散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、口服液或注射液。
3.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述甘草包括脹果甘草、光果甘草、黃甘草、粗毛甘草、雲南甘草、刺果甘草及圓果甘草。
4.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述細粉化和超微粉化處理指將甘草切片後，通過機械粉碎設備粉碎成為平均粒徑100-150μm的細粉體，再通過氣流粉碎設備粉碎成為5-25μm的超微粉體。
5.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述產木質素降解酶微生物採用革菌科白腐真菌。
6.根據權利要求5所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述產木質素降解酶微生物採用採絨革蓋菌(又名雲芝)，其保藏編號為CCTCC NO.M207024，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為雲芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY1)；粗酶液製備過程採絨革蓋菌株接種於PDA斜面培養基恢復培養7天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，28℃，150r/min恆溫振蕩培養5天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的不鏽鋼氣升式發酵罐中，30℃，100r/min好氧深層液體培養；約12d測多酚過氧化物酶活達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏備用。
7.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述產纖維素降解酶微生物採用木黴屬絲狀真菌。
8.根據權利要求7所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述產纖維素降解酶微生物採用綠色木黴，其保藏編號為CCTCCNO.M207025，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為綠色木黴ODK-TL1(Trichoderma viride ODK-TL1)；粗酶液製備過程綠色木黴菌株接種於PDA斜面培養基恢復培養5天，轉種於裝有300mlPDA液體培養基的500ml三角燒瓶中，32℃，120r/min恆溫振蕩培養3天，再以5％的接種量，將此菌種培養液轉種至裝有6L液體PDA培養基的氣升式發酵罐中，35℃，100r/min好氧深層液體培養；約4d測濾紙酶活(FPA)達到高峰時，終止發酵，用管式菌體離心機去除菌體，取其上清液為粗酶液，密封低溫保藏備用。
9.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述酶解反應指以1∶4的料液比，在反應釜中充分混合甘草超微粉體和上述兩種粗酶液，每6h一次間歇攪拌，進行共酶解反應，其中採絨革蓋菌酶液∶綠色木黴酶液的比例為1∶1，溫度30℃，酶解反應周期48h。
10.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述發酵原液的獲得指將完成酶解反應的甘草物料與蒸餾水以料水比1∶10(w/v)的比例混合後，加熱至100℃，煎提120min；以60目、100目、200目、300目、500目、800目篩分級過濾，收集濾液，將濾渣再次煎提60min，合併濾液，減壓濃縮至原體積的1/3，成為發酵原液。
11.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述濾渣處理指將煎提和分級過濾後留下的不溶物乾燥後用70％乙醇按料液比1∶10混勻，回流浸提3次，每次30min，合併浸提液，低速分離出可溶性的上清和不溶性的沉澱，分別蒸發乾燥，前者主要為木質素超微粉體，後者主要為纖維素超微粉體。
12.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述厭氧液體深層發酵指用嗜甘草植物乳桿菌(菌種保藏號CCTCC NO.M207026)，保藏單位是中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏時間為2007年3月23日，分類命名為植物乳桿菌ODK-LR1(Lactobacillus plantarum ODK-LR1)，先在種子罐中增菌培養，生物量達到1011cfu/ml後，以1％的接種量轉入發酵罐中，對上述甘草原液進行厭氧液體深層發酵；最佳發酵條件為溫度35℃，pH6.0，攪拌速度100r/min，間歇攪拌5min/2h，發酵周期72h。
13.根據權利要求1或2所述的甘草中主要化學成分的生物提取方法，其特徵在於所述甘草酸萃取指發酵終止並去除菌體後，發酵物加4倍量80％乙醇加熱溶解，1/40活性炭回流脫色30min，冷卻，過濾，水洗3次後濃縮濾液，60℃以下蒸發乾燥，得甘草酸粗品；將粗品溶於熱水，調pH6.0-6.5，過矽膠柱層析，將洗脫液減壓蒸乾後，用75％乙醇重結晶，得甘草酸純品。
全文摘要
本發明公開了一種甘草中主要化學成分的生物提取方法，及其主要化學成分製成中間體原料或終端產品。所述方法包括以下步驟將甘草粉碎製成超微粉體，再經酶解、煎濾和發酵充分解離；發酵液經離心去除菌體以及滅酶處理，化學沉澱析出甘草酸粗品，經純化得純品。所述製備成型製劑指採用製劑學上通用方法將甘草提取成分的粗品或純品製成各類劑型。本發明有益效果有效成分得率大幅提高，廢渣減少，技術路線簡化、能耗和成本降低，充分規避了化學法技術路線中過多使用強酸、強鹼及有害溶劑對環境造成的汙染，克服了劇烈的化學反應條件所導致的有效化學成分消旋化、異構化和結構重排問題。
文檔編號A61P31/00GK101067146SQ20071009825
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者吳力克 申請人:重慶立克生物技術有限公司