一種發酵法生產苯乙酮酸的培養基的製作方法

2023-09-17 18:55:20 1

專利名稱：一種發酵法生產苯乙酮酸的培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵工程領域，具體說，本發明涉及一種發酵法生 產苯乙酮酸的培養基。
背景技術：
苯乙酮酸(phenylglyoxilic acid )又名苯甲醯甲酸(benzoylformic acid )，
是合成某些農藥和醫藥產品的重要中間體，可合成除草劑苯嗪草酮、醫藥 產品胃長寧等。R (-)-扁桃酸是極其重要的手性藥物中間體，被廣泛應用 於光學純的胺基酸、血管緊張肽轉化酶抑制劑、輔酶A的不對稱合成。目 前國內已有研究以苯乙酮酸為底物，不對稱合成R (-)-扁桃酸。但目前苯 乙酮酸的製備方法主要有苯甲醯氰水解法、苯乙烯氧化法兩種方法，前者 在苯甲醯氰的製備中涉及到劇毒的氰化鈉的使用，而後者則收率很低，所 以導致環境影響大，成本居高不下。因此迫切需要找尋新的更為廉價的底 物原料。
Hiroshi Kanzaki等人發表在Agric Biol. Chem" 1990， 2101-2105的題為 "Production of Benzoylformic Acid from Phenylglycine by Sacc/zoTomjcop* /*o/j^'ca"的論文報導了採用復膜孢酵母屬進行微生物 轉化製備苯乙酮酸，其方法是將培養好的^cc/zaram:^o/wz、 /^w/;;"ca種 子液以8%的接種量接入發酵培養基(果糖0.2 wt。/。,蛋白腖0.7wt。/。， (NH4) 2SO40.1wt%， KH2PO40.4 wt%， 2ml微量元素液，lml維生素溶液，pH7.0， 100ml微量元素液包括5 gMgCl2'2H20、 0.47g MnCl2'4H20、 FeCl2'H20、 0.2g ZnCl2、 0.1gCaCl2、 0.02g CoCl2'H20、 0.02g CuCl2-2H20、 O.Olg NaMoO小H20、 和O.Ol gNa2B407， lOOml維生素溶液包含l mg維生素BLHC1、 2mg核黃素, 2mg泛酸鈣、2mg維生素B6'HC1、 0.1 mg維生素H、 1 mg p-安息香酸和2mg 菸鹼酸)，相同條件好氧培養6d，當底物濃度40g/L時，苯乙酮酸轉化率為 36.25%。此方法的缺點是轉化培養過程中生物量低；初始pH為7.0時，轉化過程中pH值維持在苯甘氨酸的等電點附近，對底物溶解度和底物氨基基
團的分子形態均造成影響；原轉化培養基中鈣離子濃度0.0002 wt。/。則偏低， 起不到最佳的作用效果，因此，造成底物濃度和轉化率無法繼續提高。

發明內容
本發明的要解決的技術問題是進一步提高微生物酶法製備苯乙酮酸 的轉化率。
我們研究發現以通過微生物酶法，以廉價的苯甘氨酸為底物，製備苯 乙酮酸，粗品可直接用於不對稱合成R (-)-扁桃酸，可以大大節約成本， 為其工業化進程提供了更廣闊的空間。
為此，本發明提供一種發酵法生產苯乙酮酸的培養基，所述培養基包 含果糖、蛋白腖、(NH4)2S04、 KH2P04、酵母提取物，微量元素、維生素 和D，L-苯甘氨酸等，其特徵在於，所述培養基的初始pH值為pH"至pH =10。
所述pH值可用NaOH調節。
本發明培養基中果糖的濃度可以為0-1.5wt%，蛋白腖的濃度可以為 0.3-1.5wt%， (NH4)2S04的濃度可以為0-0,4wt%， KH2P04的濃度可以為 0.2-1.0wt。/。。所述果糖、蛋白腖、(NH4)2SO4、KH2PO4的濃度也可參照Hiroshi Kanzaki等人發表的論文中所述的培養基來選定。
本發明人發現，當Hiroshi Kanzaki等人將初始pH調節為7.0時，轉 化過程中pH值維持在苯甘氨酸的等電點附近，這對底物溶解度和底物氨 基基團的分子形態均造成影響。因此本發明人對培養基的pH值做了一系 列試驗，結果如附圖3所示，從附圖3可以清楚看出，pH值大於7時苯 乙酮酸的相對轉化率呈明顯上升趨勢，到pH值等於9時苯乙酮酸的相對 轉化率達到頂峰，而pH值為10時苯乙酮酸的相對轉化率出現下降趨勢， 但仍略大於現有技術中pH值為7時的相對轉化率。而當pH值大於等於 11時，因超出酵母生長的pH適應範圍，菌體生長嚴重受阻。因此，將本 發明培養基的pH值控制在大於7到10。本發明所述培養基的最佳pH值 為9。
本發明人進一步發現，往該培養基中加入酵母提取物能進一步提高苯乙酮酸的轉化率。由附圖1可見，添加酵母提取物後，苯乙酮酸的相對轉 化率亦呈明顯上升趨勢，到酵母提取物的濃度為1.2wt。/。時苯乙酮酸的相對 轉化率達到頂峰，當酵母提取物的濃度為2.4wtM時，促進作用略低於酵母 提取物的濃度為1.2wt。/。時苯乙酮酸的相對轉化率，未發現明顯抑制苯乙酮
酸轉化現象。因此，從成本角度出發，將培養基中的酵母提取物的添加濃
度控制在0.3 2.4wt%，優選1.2wt%。
本發明人還發現，現有技術中轉化培養基的微量元素中的鈣離子濃度 0.0002 wt。/。偏低，當培養基中鈣離子濃度大於0.0002 wt。/。時，苯乙酮酸的 相對轉化率亦呈明顯上升趨勢，到鈣離子的濃度為0.075wt。/。時苯乙酮酸的 相對轉化率達到頂峰，而當酵母提取物的濃度為0.125wt。/。時，苯乙酮酸的 相對轉化率將低於現有技術。因此，將培養基中的鈣離子的濃度控制在 Ca2 + >0.0002wt%至Ca2 + = 0.015wt% ，所述牽丐離子的最佳濃度為 0.0075wt%。
本發明培養基中底物D,L-苯甘氨酸的濃度範圍可以為2 5wt%，優選 2wt%。當底物濃度小於2wtn/。時，從成本角度則不經濟，而大於5wt。/。則 由於底物過多，且溶解度小，而造成發酵液過於濃厚，影響溶氧，不利於 菌體生長，轉化率降低，從而造成底物浪費。
因此，本發明最優選的培養基由下列成分組成
果糖 0.2wt%
蛋白腖 0.7wt%
(NH4)2S04 0.1 wt%
KH2P04 0.4wt%
酵母提取物 1.2wt%
氯化f丐 0.0075wt%
D,L-苯甘氨酸 2wt%
且該培養基的初始pH值為9.0。
HPLC檢測方法為轉化結束後取出5ml發酵液，濃鹽酸酸化至pHl.O 左右，加入3ml的乙酸乙酯。取50pl上清液真空抽乾，加入lml的甲醇充分 溶解後進行HPLC分析。色譜柱Waters (318柱(4.6mmx250mm, 5|im); 進樣量2(Hd;檢測波長254nm;流動相磷酸鹽緩衝液:甲醇=9:1;流速0.8ml/min。轉化率的測定樣品溶液製備同HPLC測定，對照品溶 液為0.6g/L標準品的甲醇溶液。轉化率的計算樣品的轉化率=底物轉化 濃度/底物投料濃度xlOOX。
本發明的優點是在優化培養基條件下，底物投料量可提高到50g/L， 培養6d，轉化率達36.8%，反應特異性高，幾乎無副產物，只需簡單萃取 即可，操作非常方便。


圖1的曲線顯示培養基中添加不同濃度酵母提取物後對苯乙酮酸相對 轉化率的影響(以對比例的轉化率為參照)；
圖2的曲線顯示培養基中添加不同濃度鈣離子後對苯乙酮酸相對轉化 率的影響(以對比例的轉化率為參照)；
圖3的曲線顯示不同初始pH的培養基對苯乙酮酸相對轉化率的影響 (以對比例的轉化率為參照)。
具體實施方式
實施例1:
將OwAWa //po/j^ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基中(葡萄糖 3 wt%，酵母提取物0.3 wt%,，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04.3H20 0.1 wt%， MgS04.7H20 0.05 wt0/0， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8X的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2 wt。/。，蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2PO40.4 wt%，酵母提取物0.3 wt%，氯化鈣0.0003 wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為8.0)， 相同條件好氧培養6d， HPLC分析苯乙酮酸得率為35.9。/。。
實施例2:
將OwAWa /^ o/^/ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基中(葡萄糖 3 wt%,酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgSO4'7H2O0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8X的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wt。/。,蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2SO40.1 wt%， KH2PO40.4 wt%，酵母提取物1.2 wt%，氯化鈣0.005 wt°/。， D，L-苯甘氨酸2wt。/。，用NaOH將pH值調節為7.5)， 相同條件好氧培養6d， HPLC分析苯乙酮酸得率為39.5。/。。
實施例3:
將Om^/a SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基中(葡萄糖
3 wt%，酵母提取物0.3 wt%,，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04.3H20 0.1 wt%， MgS04-7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8^的接種量接入25m撥酵培養基(果糖0.2wt。/0, 蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，酵母提取物2.4 wt%， 氯化韓0.005 wt%， D,L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為8.0)，相同 條件好氧培養6d， HPLC分析苯乙酮酸得率為37.70/。。
實施例4:
將Om^WaSlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%，酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgS04-7H20 0.05 wt0/o， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30。C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8X的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wtn/。， 蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化l丐0.0075 wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為8.0),相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為41.1%。
實施例5:
將Om^Wa//po一z'ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04- 3H20 0.1 wt%， MgS04'7H20 0,05 wt°/。， KC10.05wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wt。/。, 蛋白腖0.7wt。/。， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化f丐0.015 wt%， D,L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為8.5),相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為37.3%。實施例6:
將Ca^/Wa//po(y"'ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgS04'7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wty。， 蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化f丐0.0075 wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為8.0)，相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為39.7n/。。
實施例7:
將Ca"AWa/^ o/;^'ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%，酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04- 3H20 0.1 wt%， MgS04.7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wt。/。, 蛋白腖0,7wt。/。， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化f丐O.OOl wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為9.0)，相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為42.4e/。。
實施例8:
將OmAWa//po/;;"ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgS04'7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8X的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wtn/。, 蛋白腖0.7wt0/。， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化f丐0.0075 wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為lO.O)，相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為38.2。/。。
實施例9:
將Ca"AWaSlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3wt%，酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HPCV 3H20 0.1 wt%， MgS04,7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8Q^的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wto/。, 蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，酵母提取物1.2 wt%， 氯化鈣0.0075 wt%， D，L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為9.0)，相 同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為47.4n/。。
實施例10:
將Ow^/a/*o/_y//ca SlPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%，酵母提取物0.3 wt%,，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgS04,7H20 0,05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧培 養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入75ml發酵培養基(果糖0.2wt。/c， 蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，酵母提取物1.2 wt%， 氯化鈣0.0075 wt%， D,L-苯甘氨酸2.5 wt%，用NaOH將pH值調節為9.0)， 相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為46.3e/。。
實施例lh
將OwAWa //po&"ca SIPI0201菌種接種於25ml種子培養基(葡萄糖3 wt%，酵母提取物0.3 wt%，，蛋白腖0.3 wt%， K2HP04-3H20 0.1 wt%， MgS04.7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧 培養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入25ml發酵培養基(果糖 0.2wt。/o,蛋白腖0.7wt。/0， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，酵母提取 物2.1 wt%，氯化鈣0.0075 wt%， D,L-苯甘氨酸5 wt%，用NaOH將pH值 調節為9.0)，相同條件好氧培養6d， HPLC分析轉化率為36.8%。
對比例
將Om^Wa //po/;^/ca SIPI0201菌種接種於25ml種子培養基中(葡萄 糖3wt%,酵母提取物0.3wt。/。，，蛋白腖0.3wt。/。，K2HP(V3H20 0.1 wt%, MgS04.7H20 0.05 wt%， KC1 0.05 wt%，自然pH) ， 30°C、 230r/min好氧 培養20h，得到種子液，然後以8%的接種量接入25ml發酵培養基(果糖0.2wt。/o,蛋白腖0.7 wt%， (NH4)2S04 0.1 wt%， KH2P04 0.4 wt%，氯化,丐 0.0002 wt%， D,L-苯甘氨酸2 wt%，用NaOH將pH值調節為7.0)，相同條 件好氧培養6d， HPLC分析苯乙酮酸得率為31.2%。
權利要求
1. 一種發酵法生產苯乙酮酸的培養基，所述培養基包含鈣離子和D，L-苯甘氨酸，其特徵在於，所述培養基的初始pH值為pH>7至pH＝10。
2. 如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述培養基的初始pH值為9。
3. 如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述D,L-苯甘氨酸的濃 度為2 5wt。/。。
4. 如權利要求3所述的培養基，其特徵在於，所述D，L-苯甘氨酸的濃 度為2wt。/。。
5. 如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述培養基還包含酵母 提取物。
6. 如權利要求5所述的培養基，其特徵在於，所述酵母提取物的濃度 為0.3 2.4wt0/。。
7. 如權利要求6所述的培養基，其特徵在於，所述酵母提取物的濃度 為1.2wt0/0。
8. 如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述鈣離子的濃度為 0&2+>0.0002 1%至€32+ = 0.015wt% 。
9. 如權利要求8所述的培養基，其特徵在於，所述鈣離子的濃度為 0.0075wt%。
10. 如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述培養基由下列成分組成果糖 0.2wt%蛋白腖 0.7wt%(NH4)2S04 0.1 wt%KH2P04 0.4wt%酵母提取物 l.2wt%氯化轉 0.0075wt%D,L-苯甘氨酸 2wt%且該培養基的初始pH值為9.0。
全文摘要
本發明公開一種發酵法生產苯乙酮酸的培養基，所述培養基包含鈣離子和D，L-苯甘氨酸，其特徵在於，所述培養基的初始pH值為pH＞7至pH＝10。採用本發明的培養基生產苯乙酮酸，底物投料量可提高到50g/L，轉化率達36.8％，反應特異性高，幾乎無副產物，只需簡單萃取即可，操作非常方便。
文檔編號C12P7/40GK101463369SQ200710172640
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月20日 優先權日2007年12月20日
發明者琴 張, 梅 徐, 胡海峰 申請人:上海醫藥工業研究院