一種透性化細胞製備茶氨酸的方法與流程

2023-09-17 18:52:10

本發明涉及一種利用產胞內穀氨醯胺酶的菌體透性化細胞製備茶氨酸的方法。

背景技術：

茶氨酸(l-theanine)天然存在，是茶葉特有的一種胺基酸。由於其具有降血壓、抗腫瘤、保護神經、放鬆、抗抑鬱、抗疲勞、提高免疫力、減輕體脂等多種生理功能，在食品、保健品方面有著廣泛的需求和應用，因此研究者們致力於研究一種可大規模生產，不受資源限制的生產方法。

微生物酶法具有環境汙染小、生產周期短、不受資源限制、可大規模生產等優點。目前報導了微生物來源的穀氨醯胺酶酶法生產茶氨酸的方法，如來自硝基還原假單胞菌、假單孢菌屬、以及2005年公開的來自香茅醇假單孢菌gea和2007年公開的來自芽孢桿菌屬、黴菌或酵母菌中的1種或2種以上的穀氨醯胺酶，還有2008年公開了一種利用來自枯草芽孢桿菌的穀氨醯轉肽酶生產茶氨酸的方法，在實際生產過程中，發現利用產胞內酶的菌體細胞進行細胞轉化來製備茶氨酸

不需要對酶液進行提純與濃縮處理、不存在發酵液成分帶入導致後處理工藝複雜的問題，但是仍舊存在成本高的問題，致使產品價格居高不下，限制了產品的應用。

細胞透性化技術可以不造成細胞裂解以及不破壞細胞內部結構的情況下改善細胞的通透性，使得小分子物質和一些較大分子物質能夠自由地進出細胞，從而提高菌體的表觀催化活力。採用有機溶劑或者表面活性劑等透性化試劑或加熱等物理方法來製備透性化細胞。透性化細胞可以提高表觀酶活，並且可以反覆使用，可以顯著降低成本。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種方法簡便，透性化細胞可重複使用的透性化細胞製備茶氨酸的方法。

本發明的技術解決方案是：

一種透性化細胞製備茶氨酸的方法，其特徵是：

（1）製備透性化細胞：

首先將含胞內穀氨醯胺酶的菌株進行培養，培養好後離心，收集菌體；

用ph9.0-10.0的0.1m硼砂緩衝液清洗菌體後，將菌體加入到處理試劑中進行處理，然後離心收集菌體；再用ph9.0-10.0的0.1m硼砂緩衝液清洗菌體，收集菌體，即得到透性化細胞；

（2）透性化細胞轉化法製備天然茶氨酸：

將步驟（1）得到的透性化細胞置於含0.2～0.4m穀氨醯胺和1.5～2.5m乙胺鹽酸鹽的ph為9～10的50～100mm硼酸緩衝液中，在35～40℃下進行2～8小時的酶反應，製備得到茶氨酸。

將菌體加入到處理試劑中進行處理，是將菌體加入50%的乙醇中，25℃下震蕩處理1min；或是將菌體重新置於ph9.0-10.0的0.1m硼砂緩衝液中，50℃加熱10min，冷卻。

步驟（1）中將含胞內穀氨醯胺酶的菌株進行培養的具體方法是：在發酵培養基中，以g/l計：葡萄糖12、酵母抽提物0.9、穀氨酸鈉12、mgso4·7h2o0.5、k2hpo40.6、kh2po40.6、edta-fe0.1，ph6.8-7.0，35-37℃，200rpm的條件下培養可產穀氨醯胺酶的硝基還原假單胞菌16h。

步驟（1）中的處理試劑還可以使用：丙酮、土溫80等有機溶劑或表面活性劑等。

一種透性化細胞在製備固定化細胞中的應用，其特徵是：將透性化細胞加入到海藻酸鈉溶液中，再逐滴滴入到氯化鈣溶液中，製備得到固定化細胞。

本發明的有益效果：方法簡便，透性化細胞表觀酶活力提高，表現出比游離酶更高的催化合成茶氨酸的活性。所得透性化細胞的酶活達可達到未滲透細胞的5-10倍。透性化細胞可以重複使用，可顯著降低生產成本。

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

具體實施方式

實施例1：

獲得菌體：在發酵培養基中（以g/l計）：葡萄糖12、酵母抽提物0.9、穀氨酸鈉12、mgso4·7h2o0.5、k2hpo40.6、kh2po40.6、edta-fe0.1，ph6.8-7.0，35-37℃，200rpm的條件下培養可產穀氨醯胺酶的硝基還原假單胞菌16h，離心，收集菌體。

透性化細胞的製備：用0.1m硼砂緩衝液（ph9.0-10.0）清洗菌體後，將菌體加入50%的乙醇中，25℃下震蕩處理1min。在4000rpm、4℃下離心5min後，沉澱用0.1m硼砂緩衝液（ph10.0）洗滌，棄去上清液，取沉澱即獲得透性化細胞。

製備茶氨酸：按照體系1.0u/ml加酶量添加透性化細胞，在含穀氨醯胺0.3m、乙胺鹽酸鹽1.5m的50mm硼酸緩衝液（na2b4o7-naoh、ph10）中，在37℃下進行6小時的酶反應，合成得到茶氨酸。

實施例2：

獲得菌體：在發酵培養基中（以g/l計）：葡萄糖12、酵母抽提物0.9、穀氨酸鈉12、mgso4·7h2o0.5、k2hpo40.6、kh2po40.6、edta-fe0.1，ph6.8-7.0，35-37℃，200rpm的條件下培養可產穀氨醯胺酶的硝基還原假單胞菌16h，離心，收集菌體。

透性化細胞的製備：用0.1m硼砂緩衝液（ph9.0-10.0）清洗菌體後，將菌體重新置於0.1m硼砂緩衝液（ph9.0-10.0）中，50℃加熱10min，冷卻。在4000rpm、4℃下離心5min後，沉澱用0.1m硼砂緩衝液（ph10.0）洗滌，棄去上清液，取沉澱即獲得透性化細胞。

製備茶氨酸：添加1.5u/ml透性化細胞，在含穀氨醯胺0.3m、乙胺鹽酸鹽1.0m的50mm硼酸緩衝液（na2b4o7-naoh、ph10）中，在37℃下進行8小時的酶反應，合成了茶氨酸。

實施例3：

一種透性化細胞在製備固定化細胞中的應用，將透性化細胞加入到海藻酸鈉溶液中，再逐滴滴入到氯化鈣溶液中，製備得到固定化細胞。