棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用的製作方法
2023-09-18 02:31:10 3
棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用。本發明由棲土麴黴獲得的能夠對無活力組織進行傷口清創的蛋白酶，清創能力強、副作用小，並且製備工藝簡單、產量高。
【專利說明】棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]壓瘡、糖尿病足、燒傷及慢性傷口內存在很多失活組織。失活組織是機會性感染的優良培養基，會阻礙傷口的癒合。因此有效的清創是必要的。目前臨床上最常用的清創方式仍是手術清創。除此之外，還有採用蛋白水解酶的酶清創。酶清創可以將壞死或失活的組織分解清除，同時又不損害鄰近正常組織，從而達到清創目的。己有描述將枯草菌蛋白酶、膠原酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶及鏈激酶作為清創劑。但這些清創酶各有優缺點，並且早期清創效果尚未能完全令人滿意。
[0003]己發現棲土麴黴能夠廣生水解能力很強的棲土麴黴中性蛋白酶。但把棲土麴黴蛋白酶作為傷口清創酶並未見報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種清創能力強、副作用小，並且製備工藝簡單、產量高的棲土麴黴蛋白酶在制 備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用。
[0005]本發明的技術解決方案是:
[0006]一種棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用。
[0007]所述傷口為燒傷傷口、壓瘡傷口、慢性感染傷口或糖尿病足傷口。
[0008]所述棲土麴黴蛋白酶由下列步驟製得:
[0009](I)培養基的製備
[0010]發酵培養基配比為:麩皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2PO40.4%，加水至100%，並於120°C下高溫滅菌30分鐘；
[0011](2)粗酶液的製備液
[0012]將棲土麴黴3.942菌種按培養基8%的重量接種後，在250r/min振蕩器中30°C下培養72小時；終止培養後，將發酵培養物於離心機中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液；
[0013](3)棲土麴黴蛋白酶的分離
[0014]粗酶液過濾，濾液調節pH至7.0，加入20%濃度的單寧酸，邊加邊攪拌；單寧酸用量為粗酶液重量的1% ;待沉澱完全後離心，收集沉澱；沉澱用pH7.2,0.02M磷酸緩衝液溶解；使用聚乙二醇洗脫單寧酸，在攪拌下加入10%濃度的PEG，使PEG與單寧酸之比值達到3: lml/g ;離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉澱；沉澱再浸泡於冷丙酮，靜置過夜，然後過濾，沉澱用乙醚再洗滌一次，乾燥即得棲土麴黴蛋白酶丙酮粉粗製劑；[0015](4)棲土麴黴蛋白酶的純化
[0016]上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris -HCL 緩衝液溶解，上 DEAE -Sephadex A -25柱，然後用平衡緩衝液洗滌；層析共分離出7個峰，酶活力存在於Ρ2峰內；收集Ρ2峰，對水於低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮後，冷凍乾燥。
[0017](5)蛋白酶活力的測定
[0018]採用福林酚法測定蛋白酶活力。酶活定義為在40°C，適當的PH條件下，I分鐘內水解酪蛋白產生I微克酪氨酸所需的酶量為I個蛋白酶活力單位。測得棲土麴黴蛋白酶冷乾粉的酶活力為1.1xio5u/g。
[0019]本發明由棲土麴黴獲得的能夠對無活力組織進行傷口清創的蛋白酶，清創能力強、副作用小，並且製備工藝簡單、產量高。
[0020]下面結合實施例對本發明作進一步說明。
【具體實施方式】
[0021]棲土麴黴 蛋白酶的製備
[0022](I)培養基的製備
[0023]發酵培養基配比為:麩皮3%、米糠I %、玉米粉HKH2PO40.4%，加水至100%並於120°C下高溫滅菌30分鐘。
[0024](2)粗酶液的製備液
[0025]將棲土麴黴3.942菌種按培養基8%的重量接種後，在250r/min振蕩器中30°C下培養72小時。終止培養後，將發酵培養物於離心機中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液。
[0026](3)棲土麴黴蛋白酶的分離
[0027]粗酶液過濾，濾液調節pH至7.0。加入20%質量濃度的單寧酸，邊加邊攪拌。單寧酸用量為粗酶液重量的I %。待沉澱完全後離心，收集沉澱。沉澱用pH7.2,0.02M磷酸緩衝液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脫單寧酸。在攪拌下加入10%質量濃度的PEG，使PEG (ml)與單寧酸(g)之比值達到3:1。離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉澱。沉澱再浸泡於冷丙酮，靜置過夜，然後過濾，沉澱用乙醚再洗滌一次，乾燥即得棲土麴黴蛋白酶丙酮粉粗製劑。
[0028](4)棲土麴黴蛋白酶的純化
[0029]上述丙酮粉粗酶用少量pH8.4,0.05Μ Tris - HCL緩衝液溶解，上DEAE - SephadexA-25柱，然後用平衡緩衝液洗滌。層析共分離出7個峰，酶活力存在於Ρ2峰內。收集Ρ2峰，對水於低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮後，冷凍乾燥。
[0030](5)蛋白酶活力的測定
[0031]採用福林酚法測定蛋白酶活力。酶活定義為在40°C，適當的PH條件下，I分鐘內水解酪蛋白產生I微克酪氨酸所需的酶量為I個蛋白酶活力單位。測得棲土麴黴蛋白酶冷乾粉的酶活力為1.lX105U/g。
[0032]實施例1:燒傷組織體外酶清創效果
[0033]將豬耳皮片燒傷並將其經受棲土麴黴蛋白酶蛋白水解作用，監測由棲土麴黴蛋白酶對組織的裂解時間。根據如下方法進行分析:通過將皮膚與軟骨分離並去除多餘脂肪製備豬耳皮膚。煮沸豬耳皮片(約直徑lcm) 20分鐘模擬燒傷皮膚。將0.1g棲土麴黴蛋白酶粉與水相5ml混合，調節PH為7.0,並使用裝配有塑料管的注射器或吸量管將其應用於細胞底部。在37°C的環境下孵育，檢測豬耳皮膚的裂解時間。結果顯示棲土麴黴蛋白酶於63.2±10.2分鐘內對燒傷的豬耳皮膚進行了清創。結果詳見表1。
[0034]表1:棲土麴黴蛋白酶的燒傷組織體外清創活性
[0035]
【權利要求】
1.一種棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用，其特徵是:所述傷口為燒傷傷口、壓瘡傷口、慢性感染傷口或糖尿病足傷口。
3.根據權利要求1或2所述的棲土麴黴蛋白酶在製備傷口清創、促進傷口癒合的藥物中的應用，其特徵是:所述棲土麴黴蛋白酶由下列步驟製得: (1)培養基的製備 發酵培養基配比為:麩皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2P04 0.4%，加水至100%，並於120°C下高溫滅菌30分鐘； (2)粗酶液的製備液 將棲土麴黴3.942菌種按培養基8%的重量接種後，在250r/min振蕩器中30°C下培養72小時；終止培養後，將發酵培養物於離心機中3000 r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液； (3)棲土麴黴蛋白酶的分離 粗酶液過濾，濾液調節pH至7.0，加入20 %濃度的單寧酸，邊加邊攪拌；單寧酸用量為粗酶液重量的1% ;待沉澱完全後離心，收集沉澱；沉澱用pH 7.2,0.02M磷酸緩衝液溶解；使用聚乙二醇洗脫單寧酸，在攪拌下加入10%濃度的PEG，使PEG與單寧酸之比值達到3: lml/g ;離心，收集 上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉澱；沉澱再浸泡於冷丙酮，靜置過夜，然後過濾，沉澱用乙醚再洗滌一次，乾燥即得棲土麴黴蛋白酶丙酮粉粗製劑； (4)棲土麴黴蛋白酶的純化 上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris-HCL緩衝液溶解，上DEAE-S^hadex Α-25柱，然後用平衡緩衝液洗滌；層析共分離出7個峰，酶活力存在於Ρ2峰內；收集Ρ2峰，對水於低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮後，冷凍乾燥。
【文檔編號】A61K38/48GK103977398SQ201410243456
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優先權日:2014年6月3日
【發明者】陳宏林, 朱昌來 申請人:南通大學