抗原或藥物遞送複合物的製作方法
2023-09-17 18:25:40
專利名稱：抗原或藥物遞送複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型抗原遞送複合物、疫苗、藥物遞送複合物等。
背景技術：
近年來，針對新發性和再發性感染性疾病，開發了失活疫苗和低毒性疫苗，獲得了高的預防效果。但是，日本對感染病疫苗的開發晚得多。為了撲滅發展中國家中的特定感染性疾病或者應對大流行病，需要研發能夠大量生產和長期保存，並且具有更高安全性和更強效價的疫苗。其中，DNA疫苗可以廉價地大量生產，其有效性受到期待，但從安全性或效價的觀點來看則尚未達到成功。此外，需要研發適用於激活全身免疫的靜脈注射、皮下/皮內注射的製劑，適用於黏膜免疫的經口、吸入或滴鼻給藥的製劑。
此外，針對人乳頭瘤病毒的疫苗作為宮頸癌疫苗已得到認可，據報導表現出較高的效果。但是，針對癌症抗原的疫苗療法在世界範圍內尚未確立。雖然有使用多種多樣的抗原或DNA的疫苗的報導，但尚未獲得充分的免疫誘導效果，不能在臨床上應用。特別地，DNA疫苗可選擇性活化與癌症相關的細胞免疫，期待其可增強抗癌免疫。此外，雖然由於可廉價地大規模生產而令人注目，但從安全性和效價的觀點來看還沒有成功的例子。DNA藥物根據鹼基的組合變化，表現出不同的藥理作用，可以廉價的大量生產，因此其作為有效的醫藥製品受人期待。迄今為止，已開發了各種作為基因遞送載體的納米構建體，報導了它們的器官特異性或細胞特異性。但是，由於安全性和效率低下，還不能在臨床上應用。由於多數使用合成材料，尚未確定其安全性，而且醫療成本的負擔也大。需要開發安全性高、具有普遍適用性的器官特異性載體。使載體具有器官趨向性有多種方法，一種方法是使用易於在目標器官中積累的特定分子，還有使用其他抗體、適體等具有特異性結合能力的分子的方法。本發明人通過前者的方法，應用藥物遞送複合物(專利文獻I)的技術，進一步簡單地加入生物可降解的脂類，成功地構建了對脾和肺具有選擇性的新型靶向化系統。具體地，只需向包合有DNA的陽離子型核中加入磷脂醯絲氨酸(帶負電)，就可以提高納米顆粒的安全性，向小鼠靜脈注射後，實現僅在脾臟中的選擇性的基因表達。脾臟富含免疫細胞，藉助向脾臟的選擇性基因表達，可以開發DNA疫苗。進一步地，通過添加N-月桂醯肌氨酸(帶負電)代替磷脂醯絲氨酸，同樣可以提高納米顆粒的安全性，向小鼠靜脈注射後，實現僅在肺中的選擇性基因表達(非專利文獻I)。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :特開2010-059064號非專利文獻非專利文獻I :Journal of Controlled Release, 136，213-219 (2009)發明概述發明要解決的技術問題
本發明的技術問題是提供安全、高效價，可以大量生產、保存的抗原遞送複合物、疫苗、藥物遞送複合物等。特別地，本發明的技術問題是提供以具有對細胞或器官的趨向性為特徵的抗原或藥物遞送複合物。解決技術問題的手段本發明人為了解決上述技術問題進行了深入的研究，結果發現，通過將瘧疾抗原DNA與陽離子型分子的複合物用Y-聚穀氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸中的任一種陰離子型分子包被而形成實質上不帶電荷或者具有負的表面電荷的複合物，細胞毒性低，不會引起紅細胞凝集，在各種細胞中表現出高的轉染效率，進一步通過在體內全身給藥，能夠高效地將抗原DNA遞送至脾臟。此外發現，通過多次給藥可以產生對瘧疾特異性的抗體，由此可以抑制瘧疾感染。進一步發現，在使用編碼作為癌抗原的惡性黑色素瘤表面抗原的PDNA的情況下，可以誘導 對惡性黑色素瘤特異性的細胞免疫，抑制惡性黑色素瘤的增殖和轉移。此外，本發明人將失活病毒或癌抗原與陽離子型分子的複合物用Y-聚穀氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸中的任一種陰離子型分子包被，成功地製備了實質上不帶電荷的、或者具有負的表面電荷的複合物。進一步發現，所獲得的疫苗能夠順利地被遞送到樹突狀細胞內，在對實驗動物給藥時表現出高的免疫誘導效果。此外，本發明人應用專利文獻I記載的技術，成功的構建了使得細胞或器官特異性遞送成為可能的新型靶向化系統。具體地說，成功的開發了具有下述特徵的抗原或藥物遞送複合物其含有抗原或藥物與陽離子型分子的複合物以及包合該複合物的陰離子型分子，並具有對細胞或器官的趨向性。此外，通過向抗原或藥物與陽離子型分子的複合物添加選自磷脂醯絲氨酸、N-月桂醯肌氨酸和甘草皂苷的陰離子型分子，成功的製備了被賦予對脾、肺或肝的選擇性(器官選擇性)的抗原或藥物遞送複合物。進一步發現，使用Y-聚穀氨酸作為陰離子型分子，可以製備出具有樹突狀細胞趨向性的複合物。這些複合物是抗原或藥物與陽離子型分子的複合物，以及陰離子型分子通過靜電結合而成的，因此已確定安全性極高，且沒有細胞毒性。此外，還通過向抗原或藥物與陽離子型分子的複合物添加選自適體、miRNA和抗體的陰離子型分子，成功地製備了被賦予更特異的細胞或器官選擇性的複合物。此外，在使用公知的成像用核素(成像探針)或診斷試劑作為抗原或藥物時，也成功地將上述複合物用作將成像用核素(成像探針)或診斷試劑遞送至特定細胞或器官的運輸載體。換言之，本發明提供了以下內容。[I]抗原或藥物遞送複合物，其含有抗原或藥物與陽離子型分子的複合物、以及陰離子型分子，並且具有對細胞或器官的趨向性，所述陰離子型分子包合(內包)所述抗原或藥物與陽離子型分子的複合物。[2] [I]記載的複合物，所述抗原或藥物是核酸、肽、蛋白質或失活的病毒。[3] [I]或[2]記載的複合物，其特徵是所述陰離子型分子選自磷脂醯絲氨酸、月桂醯肌氨酸和甘草皂苷，具有對脾臟、肺或肝臟的趨向性。
[4] [3]記載的複合物，其特徵是所述陰離子型分子是磷脂醯絲氨酸；抗原或藥物與陽離子型分子、磷脂醯絲氨酸的配比為1:2:4-1:8:8 ;且具有對脾臟的趨向性。[5] [3]記載的複合物，其特徵是所述陰離子型分子是月桂醯肌氨酸；陽離子型分子由陽離子型高分子和陽離子型脂類組成；抗原或藥物與陽離子型高分子、陽離子型脂類、月桂醯肌氨酸的配比為1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有對肺的趨向性。[6] [3]記載的複合物，其特徵是所述陰離子型分子是甘草皂苷；抗原或藥物與陽離子型分子、甘草皂苷的配比為1:2:8-1:8:16;且具有對肝臟的趨向性。[7] [I]或[2]記載的複合物，其特徵是所述陰離子型分子是Y-聚穀氨酸，具有對樹突狀細胞或脾臟的趨向性。[8] [7]記載的複合物，其特徵是抗原或藥物與陽離子型分子、Y-聚穀氨酸的配比為1:2:8-1:8:16 ;且具有對樹突狀細胞或脾臟的趨向性。 [9] [I]或[2]記載的複合物，所述陰離子型分子選自適體、miRNA和抗體。[10] [9]記載的複合物，所述抗原或藥物與陽離子型分子、陰離子型分子的配比為1:2:8-1:8:16。[11] [1]-[10]的任一項記載的複合物，所述複合物由抗原或藥物；和選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚乙烯亞胺和陽離子型樹形化合物(dendrimer)的陽離子型高分子；或選自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯銨的陽離子型脂類組成。[12] [1]-[10]的任一項記載的複合物，所述複合物由抗原或藥物；選自D0TMA、DOTAP和DC-Chol的陽離子型脂類；以及選自DOPE和膽固醇的脂類組成的脂質體或膠粒組成。[13]用於成像的、包含權利要求1-12的任一項記載的複合物的成像用核素的載體。[14] [13]記載的載體，其特徵是抗原或藥物是由成像用核素、陽離子型樹形化合物(dendrimer)和螯合劑組成的複合物；陽離子型分子是聚乙烯亞胺；陰離子型分子是
Y-聚穀氨酸；且具有對淋巴結的趨向性。[15]前哨淋巴結的成像方法，其特徵是使用由藥物複合物、聚乙烯亞胺和Y-聚穀氨酸組成的複合物，其中所述藥物複合物由成像用核素、陽離子型樹形化合物(dendrimer)和螯合劑組成。[I』 ]抗原遞送複合物，包含抗原與陽離子型分子的複合物，和將其包合在內的陰離子型分子，是實質上不帶電荷或具有表面負電荷的抗原遞送複合物，所述陰離子型分子選自Y-聚穀氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸及其鹽。[2』 ] [Γ ]記載的複合物，所述抗原是病原體抗原或編碼其的DNA。[3』 ] [2』 ]記載的複合物，所述病原體是瘧原蟲。[4』 ] [Γ ]記載的複合物，所述抗原是失活的病毒。[5』] [4』]記載的複合物，病毒是流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、人乳頭瘤病毒或HIV病毒。[6』] [Γ]記載的複合物，陽離子型分子的帶正電荷的官能團與陰離子型分子的帶負電荷的官能團的摩爾比是3: f 1:4。[7』 ][1』 ]記載的複合物，陰離子型分子的分子量為10萬以下。
[8』 ] [Γ ]記載的複合物，陰離子型分子是Y-聚穀氨酸或其鹽。[9』 ][1』 ]記載的複合物，陽離子型分子是聚乙烯亞胺、苯扎氯銨、Ν-[1_(2，3-二油醯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基銨或其鹽。[10』 ] [8』 ]記載的複合物，使抗原遞送至脾臟。[11』 ]感染性疾病的疫苗，其包含[Γ ]_[10』 ]的任一項記載的複合物。
[12』 ] [11』 ]記載的疫苗，所述感染性疾病是瘧疾感染或病毒感染性疾病。[13』 ]向樹突狀細胞內遞送抗原的方法，其特徵是使[Γ ]_[10』 ]的任一項記載的複合物或[11』 ]或[12』 ]記載的疫苗與樹突狀細胞接觸。[14』]向動物細胞內遞送抗原的方法，其特徵是向哺乳動物細胞給藥[1』]-[10』]的任一項記載的複合物或[11』 ]或[12』 ]記載的疫苗。[15』]藥物遞送複合物，包含含有藥物與陽離子型分子的複合物的脂質體，和將其包合在內的陰離子型分子，是實質上不帶電荷或具有表面負電荷的藥物遞送複合物，所述陰離子型分子選自月桂醯肌氨酸和磷脂醯絲氨酸。[16』 ] [15』 ]記載的複合物，使藥物遞送至脾臟。[17』 ] [15』 ]記載的複合物，使藥物遞送至肺。[18』 ] [15』 ]記載的複合物，所述脂質體由藥物、陽離子型分子和陽離子型脂類組成。[19』 ][18』 ]記載的複合物，所述陽離子型分子是聚乙烯亞胺，陽離子型脂類是N-[I-(2，3- 二油醯氧基)丙基]-N, N, N-三甲基銨。[20』 ] [Γ ]和[6』 ]_[10』 ]的任一項記載的複合物，所述抗原是癌抗原或編碼癌抗原的DNA。[21』 ]包含[20』 ]記載的複合物的癌疫苗。[22』 ] [21』 ]記載的疫苗，所述癌是惡性黑色素瘤。[23』]向樹突狀細胞內遞送抗原的方法，其特徵是使[20』]記載的複合物或[21』]或[22』 ]記載的疫苗與樹突狀細胞接觸。[24』 ]向動物細胞內遞送抗原的方法，其特徵是向哺乳動物細胞給藥[20』 ]記載的複合物或[21』 ]或[22』 ]記載的疫苗。[25』]藥物遞送複合物，其特徵是包含藥物與陽離子型分子的複合物，和將其包合在內的抗體、適體或其鹽的器官特異性藥物遞送複合物，所述抗體、適體或其鹽與藥物和陽離子型分子的複合物靜電結合。[26』 ]向細胞內遞送藥物的方法，其特徵是將[25』 ]記載的藥物遞送複合物遞送到特定細胞。[27』 ]向動物的特定細胞內遞送藥物的方法，其特徵是向哺乳動物給藥[25』 ]記載的藥物遞送複合物。[28』 ] [15』 ]或[25』 ]記載的藥物遞送複合物，所述藥物是DNA、siRNA、miRNA、反義DNA等帶負電荷的核酸。發明的效果本發明的複合物不引起紅細胞凝集，且細胞毒性低，細胞內攝入的效率好，可以安全有效地遞送抗原或藥物。
特別地，本發明的複合物的特徵是具有對目標細胞、器官的高趨向性，可以作為新型藥物遞送系統的有效成分。
附圖簡介[圖I]示出了實施例I中的疫苗抗體效價。[圖2]示出了實施例I中的瘧疾感染後的小鼠的存活率。[圖3]示出 了實施例2中的疫苗抗體效價。[圖4]示出了向細胞添加實施例3中的複合物後的螢光顯微鏡觀察圖像。[圖5]示出了實施例4中的腫瘤重量的變化。[圖6]示出了實施例4中的惡性黑色素瘤的肺轉移情況。[圖7]示出了實施例4中的肺轉移的細胞數。[圖8]示出了實施例5中的粒子大小和表面電荷。[圖9]示出了實施例5中的基因表達(螢光素酶活性)。[
圖10]示出了實施例5中的小鼠的螢光素酶成像圖像。[圖11]示出了實施例5中的多變量樣條插值法和貢獻指數。[圖12]示出了實施例6中的基因表達(螢光素酶活性)。[圖13]示出了實施例7中的粒子大小和表面電荷。[圖14]示出了實施例7中的基因表達(螢光素酶活性)。[圖15]示出了實施例7中的粒子大小和表面電荷。[圖16]示出了實施例8中的基因表達(螢光素酶活性)。[圖17]示出了樹突狀細胞攝入實施例9中的失活病毒。[圖18]示出了實施例10中的基因表達(螢光素酶活性)。[圖19]示出了實施例11中的基因抑制效率。[圖20]示出了實施例12中的感染瘧疾後的小鼠的存活率。[圖21]A:實施例13中基於稀釋小鼠血清的抗體效價變化。B :稀釋倍數10_4的小鼠抗體效價。[圖22]示出了實施例14中的腫瘤增殖變化。[圖23]示出了實施例15中的細胞毒性。[圖24]示出了實施例15中向大鼠足墊給藥24小時後，複合物在生物體內的分布。[圖25]示出了實施例15中向大鼠足墊給藥24小時後的SPECT/CT圖像。箭頭(實線)表示胭淋巴結；箭頭(虛線)表示腰部淋巴結。發明的實施方式本發明提供用於將抗原遞送至期望的細胞或器官內的抗原或藥物複合物(下文稱為「本發明的抗原遞送複合物」、「本發明的藥物遞送複合物」，或合稱為「本發明的複合物」)下面分別針對本發明的抗原遞送複合物和本發明的藥物遞送複合物進行說明。本發明的「抗原遞送複合物」的特徵是包含抗原與陽離子型分子的複合物及包合所述複合物的陽離子型分子，並具有對細胞或器官內的趨向性。本發明的抗原遞送複合物中的「抗原」可列舉例如病原體抗原(特別是病原體的表面抗原)或編碼它的DNA，或失活病毒。作為病原體抗原中作為對象的「病原體」，考慮如後文所述的本發明的抗原遞送複合物作為疫苗使用的情況，可列舉疫苗療法期望的各種病原體。具體而言，可列舉瘧原蟲、流感病毒、肝炎病毒、西尼羅熱病毒、HIV病毒(人免疫缺陷病毒)、乳頭瘤病毒、SARS (嚴重急性呼吸症候群)病毒等。此類病原體抗原選自病原體的表面抗原(例如蛋白質(抗原)、肽(抗原)等)及其編碼核酸(例如，DNA)抗原等。上述核酸抗原中的核酸的種類可以根據使用目的恰當地選擇，沒有特殊的限制，可列舉質粒DNA (pDNA)、cDNA、反義DNA、siRNA、miRNA、染色體DNA、PAC, BAC等，優選質粒DNA、cDNA、反義DNA。質粒DNA等環狀DNA通過適宜地限制性內切酶消化後，也可以作為線性DNA使用。
核酸的大小沒有特殊的限制，在質粒DNA的情況下，是2_15kbp，優選2_10kbp，更優選4-10kbp。此外，l-5kbp的DNA也是優選的。核酸可以是天然存在的，或者也可以是合成的，如果大小在約IOObp以下，可以通過磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常規使用的核酸自動合成儀來合成。對於大小更大的核酸，可以用通常使用的方法適宜地製備。本發明中使用的核酸沒有特殊的限制，優選通過本領域技術人員常用的方法純化。本說明書中的抗原除上述病原體的表面抗原或其編碼核酸以外，還可以使用病原體(病毒)自身。在此情況下，從防止感染的觀點看，使用失活病毒。就失活病毒而言，只要是通過常規方法獲得的就可以使用，例如，可以使用通過福馬林處理、紫外線照射、β-丙內酯等獲得的失活病毒。此類抗原可列舉優選核酸、肽、蛋白質或失活病毒，作為實例，可列舉瘧疾抗原基因、失活流感病毒等。作為本發明的其他實施方式，抗原可列舉用癌抗原或其編碼DNA獲得的抗原遞送複合物。從使用癌抗原作為抗原的觀點出發，優選所述抗原被細胞特異性地遞送。也就是說，通過特異性地將抗原遞送至樹突狀細胞等抗原呈遞細胞，可以期待高的免疫誘導效果。上述抗原可以與下文所述的本發明的藥物共同形成本發明的複合物。因此，本發明的抗原遞送複合物也可以是納入了藥物的抗原遞送複合物。另一方面，本發明的「藥物遞送複合物」的特徵是包含藥物與陽離子型分子的複合物，以及包合所述複合物的陰離子型分子，並具有對細胞或器官的趨向性。本發明的藥物遞送複合物中的「藥物」可以是任何物質，可列舉例如核酸、肽、蛋白質、脂類、肽脂、糖、低分子化合物、其他合成的或天然的化合物等。這些化合物還可以包含各種核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正電子放射性核素等)，也可以通過核素進行放射性標記。或者也可以用各種化合物(例如，公知的螢光色素、酶等)標記。此外，所述藥物可以只有一種，也可以是兩種以上。在以治療和/或預防疾病為目的通過本發明的藥物遞送複合物向細胞或器官內遞送藥物的情況下，所述藥物是具有治療和/或預防所述疾病的活性的藥物，可列舉例如可作為抗高血壓劑、抗低血壓劑、抗精神病劑、鎮痛劑、抗抑鬱劑、抗躁劑、抗不安劑、鎮靜劑、催眠劑、抗癲癇劑、阿片激動劑、哮喘治療劑、麻醉劑、抗心律不齊劑、關節炎治療劑、解痙劑、ACE抑制劑、解充血藥、抗生素、抗心絞痛劑、利尿劑、抗帕金森氏病劑、支氣管擴張劑、促分娩劑、抗利尿劑、抗高脂血症劑、免疫抑制劑、免疫調節劑、止吐劑、抗感染劑、抗新生物劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗糖尿病劑、抗過敏劑、解熱劑、抗腫瘤劑、抗痛風劑、抗組胺劑、止癢劑、骨調節劑、心血管劑、降膽固醇劑、抗瘧劑、用於戒菸的藥劑、鎮咳劑、去痰劑、粘液溶解劑、鼻塞用藥劑、多巴胺能劑、消化道用藥劑、肌肉舒張劑、神經肌肉阻斷劑、副交感神經激動劑、前列腺素、興奮劑、食慾抑制劑、甲狀腺藥或抗甲狀腺藥、激素、抗偏頭痛劑、抗肥胖齊U、抗炎劑等發揮作用的藥物。在一個特別優選的實施方案中，能夠導入細胞內的藥物是核酸。核酸沒有特殊的限制，可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的雜合體等。此外，核酸可以使用
1-3條鏈，優選I條鏈或2條鏈。核酸也可以是作為嘌呤或嘧啶鹼基的N-糖苷的其他類型的核苷酸，或者是具有非核苷酸骨架的其他寡聚體(例如，市售的肽核酸(PM)等)，或者是含有特殊聯接的其他寡聚體(但是，所述寡聚體含有DNA或RNA中可見的鹼基對，或者具有允許鹼基附著的配置的核苷酸)等。進一步，可以添加有公知的修飾，例如具有所屬領域中 已知的標誌物的、加帽的、甲基化的、I個以上的天然核苷酸被類似物替換的、經過了分子內核苷酸修飾的，例如具有不帶電聯接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯等)的、具有帶電聯接或含硫聯接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的、具有例如蛋白質(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號肽等)或糖(例如單糖等)等側鏈基團的、具有插層化合物(例如，吖啶、補骨脂素等)的、含有螯合化合物(例如，金屬、具有放射性的金屬、硼、氧化性的金屬等)的、含有烷化劑的、具有經修飾的聯接(例如，α異頭物型核酸等)的。例如，DNA的類型可以根據使用目的恰當地選擇，沒有特殊的限制，可列舉例如質粒DNA、cDNA、反義DNA、染色體DNA、PAC、BAC等，優選是質粒DNA、cDNA、反義DNA。質粒DNA等環狀DNA也可以通過適宜地限制性內切酶消化後，作為線性DNA使用。此外，RNA的類型可以根據使用目的恰當地選擇，沒有特殊的限制，可列舉例如siRNA、miRNA、shRNA、反義RNA、信使RNA、單鏈RNA基因組、雙鏈RNA基因組、RNA複製子、轉運 RNA、核糖體 RNA 等，優選 siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反義 RNA、RNA 複製子。核酸的大小沒有特殊的限制，從染色體(人工染色體等)等大型核酸分子(例如大小約107kbp)至低分子核酸(例如大小約5bp)都可以導入，但考慮到向細胞內導入核酸的效率，優選15kbp以下。例如，質粒DNA這樣的高分子核酸的大小可示例為2-15kbp，優選
2-10kbp,更優選4-10kbp。此外，siRNA這樣的較低分子的核酸的大小可列舉5_1000bp,優選 10-500bp，更優選 15-200bp。核酸可以是天然存在的或者合成的，如果大小在約IOObp以下，可以通過磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常規使用的核酸自動合成儀來合成。本發明中使用的核酸沒有特殊的限制，優選是通過本領域技術人員常用的方法純化了的。上述藥物也可以與本發明的抗原一起形成本發明的複合物。因此，本發明的藥物遞送複合物也可以是納入了抗原的藥物遞送複合物。在以細胞或器官的診斷或成像為目的通過本發明的藥物遞送複合物向細胞或器官內遞送藥物的情況下，，所述藥物可以是接受了適合診斷裝置或成像裝置的修飾(例如，核素、通過核素標記(放射標記)的化合物、螢光色素、用螢光色素標記的化合物等)的化合物(下文有時將其統一簡寫為「成像用核素」)。此類藥物可列舉例如用於正電子體層掃描(PET)的放射性核素(nC、13N、150、18F等)或用所述核素標記的化合物、用於單光子發射計算機體層掃描(SPECT)的放射性核素(67GA、99nTC、mIn、123I等)或用所述核素標記的化合物、用於MRI (核磁共振成像)的造影劑(Gd3+等)或用所述造影劑標記的化合物、色素(異舒泛藍(4 y 7 寸> O—)、舒泛藍、亞甲基藍、吲哚氰綠、靛胭脂等)或用所述色素標記的化合物、螢光色素或用所述螢光色素標記的化合物(形成螢光絡合物的鑭系元素等)、以及其他作為分子探針或示蹤物使用的化合物。本領域技術人員可以用本身已知的方法製備這些化合物。或者這些成像用核素可以通過共價鍵或配位鍵與後述各種陽離子型分子或陰離子型分子(優選陽離子型分子)結合。此類結合方法是本領域技術人員公知的。作為上述藥物封入本發明的藥物遞送複合物中的化合物沒有特殊的限制，可使用 本身公知的核素、色素、螢光色素、分子探針、診斷藥物等。換言之，本發明的藥物遞送複合物可以作為用於遞送上述成像用核素的載體使用。所述複合物基於本發明的藥物遞送複合物所具有的趨向性而去往特定的細胞或器官，因此通過使用本發明的藥物遞送複合物作為遞送成像用核素的載體，與只使用成像用核素的傳統診斷方法、成像方法相比，可以更正確地對目的部位進行診斷、成像。或者，本發明的藥物遞送複合物本身可作為用作診斷或成像試劑的藥物的分子探針使用。本發明的藥物遞送複合物不引起紅細胞凝集，細胞毒性低，且向細胞內攝入的效率好，並具有對細胞、器官的趨向性，因此可以說是可以安全且有效地使用的分子探針。當本發明的藥物遞送複合物作為用於遞送成像用核素的載體使用的情況下，本發明的藥物優選製備為陽離子型樹形化合物與螯合劑的複合物(下位簡稱為藥物複合物)。對於陽離子型樹形化合物所具有的陽離子基團(例如氨基)，可以通過共價鍵導入色素、螢光色素分子等藥物，此外，對於螯合劑，也可以導入放射性核素、MRI造影劑、鑭系元素等藥物。使陽離子型樹形化合物與螯合劑結合的方法，或製備本發明的藥物與陽離子型樹形化合物和螯合劑的複合物的方法是本領域技術人員公知的。例如，藥物複合物的製備方法可列舉混合陽離子型樹形化合物和螯合劑而形成陽離子型樹形化合物與螯合劑的複合物，並用成像用核素加以標記的方法。通過適用作為此類陽離子型樹形化合物和螯合劑的複合物而製備的藥物，本發明的載體也可能適用於多模態成像探針。在用於所述用途時，包含在藥物複合物中的陽離子型樹形化合物可列舉聚醯胺樹形化合物等。此外作為螯合劑，可列舉P-SCN苄基二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等。用於本發明的複合物中的陰離子型分子是與上述抗原或後述藥物和陽離子型分子一起形成的具有細胞或組織趨向性的複合物的、作為陰離子型的分子。陰離子型分子與後述的陽離子型分子通過靜電相互作用締合，形成實質上不帶電荷或帶負的表面電荷的本發明的複合物。優選的陰離子型分子可列舉陰離子型高分子、陰離子型脂類(例如月桂醯肌氨酸(下文有時縮寫為LS)、磷脂醯絲氨酸(下文有時縮寫為DOPS)等)、整體上帶負電荷的基因(例如適體等)、整體上帶負電荷的抗體等。其中，例如月桂醯肌氨酸、Y-聚穀氨酸(下文有時縮寫為Y-PGA)、甘草皂苷(下文有時縮寫為GLY)、磷脂醯絲氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸等是特別優選的。這些陰離子型分子可以是包含各種核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正電子放射性核素等)的，也可以是用核素進行放射性標記的。或者，也可以是用各種化合物(例如，公知的螢光色素、酶等)標記的。各種陰離子型分子可以呈現鹽的形態，所述鹽的形態可列舉鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、鋁鹽、鹽酸鹽等。在本發明的複合物中，陰離子型分子是賦予複合物的細胞或器官趨向性最重要的分子。 例如，在賦予脾、肺或肝趨向性的情況下，陰離子型分子優選選自磷脂醯絲氨酸、月桂醯肌氨酸和甘草皂苷。特別是在賦予脾趨向性的情況下，優選選擇磷脂醯絲氨酸，在賦予肺趨向性的情況下，優選選擇月桂醯肌氨酸，在賦予肝臟趨向性的情況下，優選選擇甘草皂苷。對各器官中攝入本發明的複合物的細胞沒有特殊的限制，可以是形成各器官的任何細胞。例如，具有肝趨向性的本發明的複合物可以被肝實質細胞攝入。陰離子型脂類也可以作為本發明的複合物中的脂質體的組成成分使用。此類陰離子型脂類可列舉磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、磷脂醯甘油、LS等。在本發明的一個實施方案中，陰離子型分子可選自適體、miRNA和抗體。在本說明書中，適體是指通過體外選擇方法(SELEX:基於指數富集的配體系統性進化)產生的高親和力、高特異性的基於RNA或DNA的配體。適體是從20-30個核苷酸的隨機配列生成的，基於與分子抗原或細胞的吸附選擇性地進行篩選，並進行濃縮以特異性地純化高親和力的結合配體。為了提高體內的穩定性和實用性，通常化學修飾適體，以抑制核酸酶分解，或使其易於與試劑、標誌物或顆粒結合。此外，通過更簡單的化學交聯方法，替換不具體參與與配體的相互作用的核酸。在溶液中，適體雖不形成結構，但有可能摺疊、包圍目標表位，據此特異性地識別。表位周圍的核酸的特異摺疊產生氫鍵、靜電力、堆積、具有由形狀互補性介導的識別力的分子間接觸。與基於蛋白質的配體相比，一般而言，適體是穩定的，加熱滅菌的傳導性高，免疫原性低。現在，適體已以包括血管形成、血小板活化、實體腫瘤在內的多種具有臨床意義的病變為目標使用，其用途正在增多。在適體作為成像和/或治療用乳液顆粒中的靶向配體使用的情況下，其臨床實用性有時依賴於相對於清除率的由核酸的磷酸基賦予的表面負電荷強度。使用基於脂類的顆粒進行的在先研究表示，負的4電位顯著降低脂質體的血液半衰期，另一方面，中性或陽離子型顆粒則都在全身維持更長的時間。本發明的適體還可以採用鹽的形態，此類適體的鹽可列舉鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、招鹽等。所述適體或其鹽可以使用市售的(例如，北海道SystemScience公司生產),也可以使用常用規程來恰當地製備。在本發明的複合物中，作為陰離子型分子使用的抗體只要是表現為陰離子型分子(例如，抗體表面作為整體帶負電)的抗體即可，沒有特殊的限制。使用抗體作為陰離子型分子，可以利用抗原抗體反應進一步提高對細胞、器官的趨向性。此類抗體可以使用市售的，也可以使用常用的規程，針對所選定的抗原來適宜地製備。在本發明的一個實施方案中，用於本發明的複合物中的陰離子型分子選自Y-聚穀氨酸、硫酸軟骨素(下文縮寫為CS)、海藻酸(下文縮寫為AGA)及其鹽。所述實施方案中的陰離子型分子優選是Y-PGA。本說明書中，Y-PGA或其鹽可列舉下列通式(I)所表示的化合物。[化學式I]
權利要求
1.抗原或藥物遞送複合物，其含有抗原或藥物與陽離子型分子的複合物、以及陰離子型分子，並且具有對細胞或器官的趨向性，所述陰離子型分子包合所述抗原或藥物與陽離子型分子的複合物。
2.權利要求I所述的複合物，其中，所述抗原或藥物是核酸、肽、蛋白質或失活的病毒。
3.權利要求I或2所述的複合物，其中，所述陰離子型分子選自磷脂醯絲氨酸、月桂醯肌氨酸和甘草皂苷，並具有對脾、肺或肝的趨向性。
4.權利要求3所述的複合物，其中，所述陰離子型分子是磷脂醯絲氨酸；抗原或藥物、陽離子型分子、及磷脂醯絲氨酸的配比為1:2:4-1:8:8 ;且具有對脾臟的趨向性。
5.權利要求3所述的複合物，其中，所述陰離子型分子是月桂醯肌氨酸；陽離子型分子由陽離子型高分子和陽離子型脂類組成；抗原或藥物、陽離子型高分子、陽離子型脂類、及月桂醯肌氨酸的配比為1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有對肺的趨向性。
6.權利要求3所述的複合物，其中，所述陰離子型分子是甘草皂苷；抗原或藥物、陽離子型分子、及甘草皂苷的配比為1:2:8-1:8:16;且具有對肝的趨向性。
7.權利要求I或2所述的複合物，其中，所述陰離子型分子是Y-聚穀氨酸，且具有對樹突狀細胞或脾的趨向性。
8.權利要求7所述的複合物，其中，抗原或藥物、陽離子型分子、及Y-聚穀氨酸的配比為1:2:8-1:8:16 ;且具有對樹突狀細胞或脾的趨向性。
9.權利要求I或2所述的複合物，其中，所述陰離子型分子選自適體、miRNA和抗體。
10.權利要求9所述的複合物，其中，所述抗原或藥物、陽離子型分子、及陰離子型分子的配比為 1:2:8-1:8:16。
11.權利要求1-10中任一項所述的複合物，其中所述複合物由 抗原或藥物 '及 選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚こ烯亞胺和陽離子型樹形化合物的陽離子型高分子，或選自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯銨的陽離子型脂類組成。
12.權利要求1-10中任一項所述的複合物，其中，所述複合物由抗原或藥物；及脂質體或膠束組成， 所述脂質體或膠束由選自DOTMA、DOTAP和DC-Chol的陽離子型脂類與選自DOPE和膽固醇的脂類製成。
13.成像用核素的載體，包含用於成像的權利要求1-12中任一項所述的複合物。
14.權利要求14所述的載體，其中，抗原或藥物是由成像用核素、陽離子型樹形化合物和螯合劑組成的複合物；陽離子型分子是聚こ烯亞胺；陰離子型分子是Y-聚穀氨酸；且具有對淋巴結的趨向性。
15.前哨淋巴結的成像方法，其特徵是使用由藥物複合物、聚こ烯亞胺和Y-聚穀氨酸組成的複合物，其中所述藥物組合物由成像用核素、陽離子型樹形化合物和螯合劑組成。
全文摘要
本發明的目的是提供抗原遞送複合物或藥物遞送複合物，其特徵是安全性和效價高，可以大規模生產和保存，並具有細胞或器官趨向性。本發明提供了抗原或藥物遞送複合物，其特徵是含有抗原或藥物與陽離子型分子的複合物以及包合所述複合物的陰離子型分子，並具有細胞或器官趨向性。本發明的抗原或藥物遞送複合物可用作向特定細胞或器官遞送各種抗原或藥物的藥物遞送系統的主要組分。
文檔編號A61K39/002GK102858367SQ201180021210
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月24日 優先權日2010年2月26日
發明者佐佐木均, 黑崎友亮, 北原隆志, 藤秀人, 由井克之, 平山謙二, 森田公一, 向高弘, 間賀田泰寬, 小川美香子, 佐野紘平 申請人:國立大學法人長崎大學, 國立大學法人九州大學, 國立大學法人浜松醫科大學