一種油田化學劑的生物毒性評價方法

2023-08-22 13:54:21

一種油田化學劑的生物毒性評價方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於環保技術領域，涉及一種對油田化學劑的生物毒性評價方法。
【背景技術】
[0002] 隨著世界範圍內環境保護法律法規的日益嚴格及公眾環境意識的日益強烈，油田 化學劑(主要包括鑽井液添加劑及體系、完井液添加劑及體系、油田汙水處理劑等）的環境 保護評價問題受到了普遍關注和重視。在國外，如美國、英國、加拿大、挪威、荷蘭等都制定 了有關油田化學劑(主要是鑽井液及其廢棄物）的環境保護指標。在我國，油田化學劑的 生物毒性問題日益受到重視，已經開展了廢棄鑽井液對海洋生物的毒性測試，並初步建立 了油基鑽井液毒性評價的實驗程序，但關於油田化學劑生物毒性測試方法的研究卻起步較 晚。油田化學劑生物毒性測試方法的研究始於九十年代初期，迄今為止，尚無統一的油田化 學劑生物毒性測試方法標準與分級標準。
[0003] 1995年國家環保局頒布了《水質急性生物毒性發光細菌法》即國標GB/T 15441-1955,並於1995年3月1日開始在全國實行。它是測定水質急性生物毒性的標準 方法。中國石油環境監測總站W《水質急性生物毒性發光細菌法》為基礎，參照EPA織奸生 物試驗法，建立了利用發光細菌法測定鑽井液及添加劑生物毒性的測試方法和生物毒性分 級方法，並W此為基準起草並建立了中國石油天然氣集團公司企業標準Q/SY111-2007,即 《油田化學劑、鑽井液生物毒性分級及檢測方法發光細菌法》。
[0004] 發光細菌法是基於毒性物質對發光細菌的發光度的抑制效果而設計的一種 評價方法，具有操作簡便，檢測周期短，易於現場操作等特點，被多個行業廣泛採用。 CN201110090246.9公開了一種發光菌毒性的測定方法，該方法包括W下步驟；1)菌種活 化：將明亮發光桿菌的凍乾粉溶解，接種到斜面上傳代3次後可用；2)菌種的培養；將傳代 好的菌種用接種環接種到液體培養基，2(TC，ISOrpm培養12h ;3)菌液的平衡；移取適量菌 液到20血3%化Cl溶液中，控制光值測定範圍在50-500萬之間，20°C條件下攬拌40min ;4) 加樣及發光強度檢測：將攬拌了 40min的菌液用連續進樣器加入200 U L到800 U L的3% 化Cl空白及800 U L濃度梯度的3%化Cl汙染液，加樣後立即在旋潤混勻器上混勻2min， 2(TC條件下，靜置15min後將樣品管置入英光檢測器中測定發光強度；5)雙交錯對照法計 算樣品對發光強度的抑制率。CN201010537039. 9公開了一種發光細菌菌種的長期保存、快 速復甦的方法。通過開發專口的細菌凍存培養基和復甦溶液，實現發光細菌菌種的長期保 存和快速復甦，既節省了測試成本，也大大縮短了毒性測試的時間，為化學汙染物的快速毒 性測試提供了可能。
[0005] 目前油田化學劑的生物毒性等級判斷主要是基於化學劑對發光細菌的發光量抑 製程度。由於發光細菌具有自主的代謝及條件反射機制，發光量作為生物毒性唯一的檢測 指標，其受菌體生長代謝及環境影響很大，準確量化的難度很大，因此發光細菌檢測方法的 穩定性、重現性不高。

【發明內容】

[0006] 針對現有技術的不足，本發明提供了一種油田化學劑生物毒性評價方法。該方法 通過菌種復甦、同步化培養、穩態篩選等方式獲得具有較高發光穩定性的供試發光菌菌懸 液；在毒性檢測過程中，加入發光促進劑，從而削弱了個體發光差異，保證了毒性評價結果 的穩定性和重現性。
[0007] 本發明油田化學劑生物毒性評價方法，包括如下內容： (1) 發光菌復甦；將發光菌用氯化鋼溶液配製成菌懸液，於冰水浴中復甦； (2) 同步化培養；將復甦菌懸液接種於活化培養基中，進行活化培養；活化培養後期， 在菌體培養液中加入生長抑制劑，進行同步培養；經同步培養後，收集菌體細胞； (3) 毒性評價：用氯化鋼溶液將菌體細胞配製成具有一定發光量的菌懸液，並添加發光 促進劑，用於毒性評價分析。
[0008] 本發明方法中，所採用的發光菌是具有特殊發光代謝途徑的一類菌種，包括弧菌 屬、發光桿菌屬、異短桿菌屬，其中優選明亮發光桿菌。
[0009] 本發明方法中，所採用的發光菌可W是來自於市售的發光菌凍乾粉，也可W是斜 面或液體保藏的菌種。
[0010] 本發明方法中，菌體復甦過程使用質量濃度為1. 5%~3. 0%氯化鋼溶液，復甦時間 2min~lOmin。復甦後菌懸液發光量達到600mV W上即滿足試驗要求。
[0011] 本發明方法中，所述的活化培養基配方為膜蛋白腺0.1 wt%~0.5wt%，酵母膏 0. 2wt% ~0. 5wt%，甘油 0.1 wt% ~0. 3wt%，磯酸二氨鍾 0. 05wt% ~0. 2wt%，磯酸氨二鋼 0. 05wt%~0. 2wt%，氯化鋼0. 2wt%~0. 5wt%，P冊.5。活化培養時間為1化~1她。
[0012] 本發明方法中，通過在活化培養基中加入生長限制性成分即生長抑制劑的方式， 進行生長同步化調節。所選擇的生長抑制劑為核酸合成抑制或細胞分裂抑制劑，如可W是 5-氣脫氧尿嚼巧、居基脈、阿糖胞巧、氨甲蝶嶺、腺嘿嶺、鳥嘿嶺、胸腺嚼巧、秋水仙素、秋水 仙胺等中的一種或幾種。具體根據選擇的生長抑制劑不同，確定其加入量，可W實現同步化 培養即可。
[0013] 本發明方法中，發光菌在加入生長抑制劑菌體培養液中培養化~1化後，進行離 必處理，獲得菌體沉澱。離必轉速為50化pm~1500巧m，離必時間IOmin~20min。
[0014] 本發明方法中，W質量濃度為2%~3%的氯化鋼溶液將收集的菌體沉澱進行2~ 4次清洗，並配製成發光菌菌懸液，用於鑽井液生物毒性評價。
[0015] 本發明方法中，發光菌菌懸液中加入質量濃度為0. 1%~0. 3%發光促進劑。發光 促進劑為六碳糖或八碳W上的醒類，優選葡萄糖、辛醒。
[0016] 與現有技術相比，本發明油田化學劑生物毒性評價方法通過有效菌體同步生長處 理步驟，獲得了生長一致性的菌體細胞，排除了菌體生長差異對菌體發光量的影響，同時根 據菌體發光原理，在檢測用菌懸液中添加了發光促進劑，提高了發光強度及發光穩定性，更 有利於提高毒性評價結果的穩定性和重現性： (1)現有毒性評價方案是W發光菌的發光量變化作為毒性檢測的指標，由於發光菌是 具有自主生理代謝調控的生物體，因此處於不同生長期的菌體，其發光量處於不斷的變化 中，其表現的發光總量波動性很大，作為檢測指標，其結果的穩定性、準確性會受到嚴重質 疑。本發明W菌體同步培養的方式，獲得了同步生長的供試菌體，從而提高了檢測結果的穩 定性。
[0017] (2 )現有鑽井液體系中富養有機成分較少，加入發光菌後，其發光量呈逐步下降的 趨勢，從而影響對其毒性的判定。因此，本方案在檢測用菌懸液中添加了發光促進劑，使其 發光量維持在一個恆定的水平，有利於其毒性判斷的準確性。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明方法的具體過程及效果進行說明，但不局限於W下實施 例。本發明中，wt%為質量分數。
[0019] 本實施例中所用的發光菌為市售的明亮發光桿菌凍乾粉。鑽井液毒性評價試驗過 程依據中國石油天然氣集團公司企業標準Q/SY111- 2007,即《油田化學劑、鑽井液生物毒 性分級及檢測方法發光細菌法》進行。
[0020] 實施例1 (1) 取市售的明亮發光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍乾粉 0. 5g，溶解於ImL質量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。於冰水浴中復甦5min ; (2) 將復甦菌懸液接種於50mL活化培養基中，於2(TC，活化培養1她； (3) 活化1化後，向培養基中加入5嗦秋水仙胺，同步培養化； (4) 同步培養化後，100化pm離必lOmin，棄上清液，取菌體沉澱，用3%氯化鋼溶液清洗 兩次，並再次離必獲得菌體沉澱； (5) 將菌體溶於IOmL含有3wt%氯化鋼，0.1 wt%葡萄糖的緩衝溶液，配製成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2mL3wt%氯化鋼溶液中進行發光量測定。
[0021] 實驗結果如下表所示。

[002引 實施例2 (1) 取市售的明亮發光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍乾粉 0. 5g，溶解於ImL質量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。於冰水浴中復甦5min ; (2) 將復甦菌懸液接種於50mL活化培養基中，於2(TC，活化培養1她； (3) 活化1化後，向培養基中加入25mg胸腺嚼巧，同步培養16h ; (4) 同步培養1化後，500巧m離必20min，棄上清液，取菌體沉澱，用3wt%氯化鋼溶液清 洗H次，並再次離必獲得菌體沉澱； (5) 將菌體溶於IOmL含有3wt%氯化鋼、0. 2wt%辛醒的緩衝溶液，配製成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2血3wt%氯化鋼中進行發光量測定。
[0023] 實驗結果如下表所示。

[0024] 實施例3 (1) 取市售的明亮發光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍乾粉 0. 5g，溶解於ImL質量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。於冰水浴中復甦5min ; (2) 將復甦菌懸液接種於50mL活化培養基中，於2(TC，活化培養1她； (3) 活化1化後，向培養基中加入25mg腺嘿嶺，同步培養16h ; (4) 同步培養1化後，120化pm離必lOmin，棄上清液，取菌體沉澱，用3wt%氯化鋼溶液 清洗H次，並再次離必獲得菌體沉澱； (5) 將菌體溶於IOmL含有3wt%氯化鋼、0. 2wt%葡萄糖的緩衝溶液，配製成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2mL3wt%氯化鋼中進行發光量測定。
[0025] 實驗結果如下表所示。

[002引 實施例4 W實施例1所獲得發光菌菌懸液，用於5%氯化巧鑽井液體系的生物毒性評價。毒性評 價試驗步驟按照中國石油天然氣集團公司企業標準Q/SY111- 2007,即《油田化學劑、鑽井 液生物毒性分級及檢測方法發光細菌法》進行。實驗結果如下表所示。

[0027] 相對發光度，其中％。。。指實驗樣品的發光量，Epk指對照樣品的發光量。
[002引 比較例1 同實施例1中（1)~（4)實驗操作，獲得菌體沉澱，並將菌體溶於IOmL含有3wt%氯化 鋼溶液中，不使用發光促進劑，用於發光量檢測，實驗結果如下表所示：

與實施例1相比，菌體發光量較低，證明發光促進劑有利於促進菌體二次復甦，從而 提高發光量。
[002引 比較例2 同實施例1中（1)、（2)、（4)、（5)實驗操作，獲得菌體沉澱，不使用生長抑制劑秋水仙 胺，獲得的菌體溶於IOmL含有3wt%氯化鋼、0.1 wt%葡萄糖的緩衝溶液中，用於發光量檢測， 實驗結果如下表所示：

與實施例1相比，菌體發光量的存在無序的波動性，證明同步化處理有利於提高菌體 發光穩定性。
[0030] 比較例3 (1)取市售的明亮發光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍乾粉 0. 5g，按照CN201110090246. 9公開方式進行復甦、活化； (2)取10化菌懸液加入2血3%氯化鋼中進行發光量測定。
[0031] 實驗結果如下表所示：

與實施例1相比，該專利報導的菌體復甦、活化的方法，其菌體發光量存在較大的波動 性。
[00礎 比較例4 按照中國石油天然氣集團公司企業標準Q/SY111- 2007,即《油田化學劑、鑽井液生物 毒性分級及檢測方法發光細菌法》中全部試驗過程，對5%氯化巧鑽井液體系進行生物毒性 評價。結果如下：

與實施例4相比，相對發光度的變化沒有規律性，因此不能明確判定其毒性範圍。
【主權項】
1. 一種油田化學劑的生物毒性評價方法，其特徵在於包括如下內容： (1) 發光菌復甦：將發光菌用氯化鈉溶液配製成菌懸液，於冰水浴中復甦； (2) 同步化培養：將復甦菌懸液接種於活化培養基中，進行活化培養；活化培養後期， 在菌體培養液中加入生長抑制劑，進行同步培養；經同步培養後，收集菌體細胞； (3) 毒性評價：用氯化鈉溶液將菌體細胞配製成具有一定發光量的菌懸液，並添加發光 促進劑，用於毒性評價分析。2. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（1)所述的發光菌為弧菌屬、發光杆 菌屬或異短桿菌屬。3. 按照權利要求2所述的方法，其特徵在於：所採用的發光菌為明亮發光桿菌。4. 按照權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於：所採用的發光菌來自於市售的發 光菌凍乾粉或者是斜面或液體保藏的菌種。5. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（1)中菌體復甦過程使用質量濃度為 1. 5%~3. 0%氯化鈉溶液，復甦時間2min~lOmin。6. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2)所述的活化培養基配方為胰 蛋白腺〇· lwt%~0· 5wt%，酵母膏0· 2wt%~0· 5wt%，甘油0· lwt%~0· 3wt%，憐酸二氫鉀 0· 05wt% ~0· 2wt%，磷酸氫二鈉 0· 05wt% ~0· 2wt%，氯化鈉 0· 2wt% ~0· 5wt%，ρΗ6· 5 ;活化 培養時間為12h~18h。7. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2)所述的生長抑制劑為核酸合成抑 製劑或者細胞分裂抑制劑。8. 按照權利要求7所述的方法，其特徵在於：步驟（2)所述的生長抑制劑為5-氟脫氧 尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、秋水仙素、秋水仙胺等中 的一種或幾種。9. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2)中發光菌在加入生長抑制劑 菌體培養液中培養5h~16h後，進行離心處理，離心轉速為500rpm~1500rpm，離心時間 lOmin ~20min〇10. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2)中以質量濃度為2%~3%的氯 化鈉溶液將收集的菌體細胞進行2~4次清洗。11. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（3)菌懸液中加入質量濃度為 0. 1%~0. 3%發光促進劑，發光促進劑為六碳糖或八碳以上的醛類。12. 按照權利要求11所述的方法，其特徵在於：所述的發光促進劑為葡萄糖或辛醛。
【專利摘要】本發明公開了一種油田化學劑生物毒性評價方法，包括如下內容：（1）發光菌復甦：將發光菌用氯化鈉溶液配製成菌懸液，於冰水浴中復甦；（2）同步化培養：將復甦菌懸液接種於活化培養基中，進行活化培養；活化培養後期，在菌體培養液中加入生長抑制劑，進行同步培養；經同步培養後，收集菌體細胞；（3）毒性評價：用氯化鈉溶液將菌體細胞配製成具有一定發光量的菌懸液，並添加發光促進劑，用於毒性評價分析。本發明方法通過菌種復甦、同步化培養、穩態篩選等方式獲得具有較高發光穩定性的供試發光菌；在毒性檢測過程中，加入發光促進劑，從而削弱了個體發光差異，保證了毒性評價結果的穩定性和重現性。
【IPC分類】C12Q1/02, C12R1/63, C12R1/01
【公開號】CN105713952
【申請號】CN201410736313
【發明人】張霖, 姚新武, 廖莎, 樊亞超, 師文靜
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院