二氧化矽微粒為載體的淋巴染料及其製備方法
2023-08-22 13:36:41
專利名稱：二氧化矽微粒為載體的淋巴染料及其製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種以二氧化矽微粒為載體的染料及其製備方法，尤其涉及的是一種將能標記淋巴結的藍染料包埋到二氧化矽微粒中或者連接到二氧化矽微粒表面或者連接到二氧化矽微粒孔隙中的方法，屬於微納米技術與臨床醫學基礎的交叉領域。
背景技術：
淋巴結轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。儘早發現淋巴結是否有轉移，對腫瘤的臨床分期以及據此對腫瘤進行相應的治療具有重要的臨床意義。
注射活性染料是術中示蹤淋巴結的常用方法，所採用的活性染料主要是異硫藍(isosulfan blue)、美藍(methythionium)、專利藍(patent blue)、伊文思藍(evans blue)，靛卡紅(indigocarmine)等，這些染料可顯示淋巴的大致輪廓。一般在注射染料後幾分鐘內就可發現淋巴管和淋巴結被染藍，術者須在較短的時間內準確分辨出原發腫瘤局部淋巴結循環的輸入淋巴管，作一皮膚切口，沿藍染的淋巴管尋找最先到達的淋巴結，即前哨淋巴結。這種方法對前哨淋巴結識別的成功率為66～98％。注射藍染料的方法標記淋巴的速度很快，是一種目前較好的方法。此外，還有採用放射性核素對前哨淋巴結進行活檢，以及將藍染料與放射性核素聯合使用來示蹤前哨淋巴結。如Jose M等人[Jose M，et al.Intraoperative sentinel node identification in early stage cervicalcancer using a combination of radiolabeled albumin injection andisosulfan blue dye injection.Gynecologic Oncology，2004，92845-850]採用放射性物質標記的人血清白蛋白與異硫藍(isosulfan)聯合使用來辨認早期宮頸癌的前哨淋巴結，結果在23位病人中，總共有51枚前哨淋巴結被檢測到。眾多研究表明，將藍染料與放射性核素聯合使用可明顯提高定位前哨淋巴結的準確性。
然而，這種方法存在較大缺陷，如染料分子因為分子太小而使其在幾分鐘內便從前哨淋巴結流入下一組淋巴結，術者一般要在術中每隔15～20分鐘要重新注射一次染料，否則染料將被淋巴通道快速轉運而使前哨淋巴結顏色變淡，給尋找前哨淋巴結帶來困難。對於乳腺癌來說，染料很難顯示胸廓內、鎖骨上及鎖骨下的淋巴結，除非擴展手術切口。此外，de Decicco等人對250例乳腺癌患者進行前哨淋巴結活檢時發現，太小的染色劑因過多地進入淋巴結而出現假陽性，認為較大的顆粒對前哨淋巴結進行活檢的準確性增大。使用放射性核素，無論對患者還是醫生都是有一定程度的危害的。
二氧化矽微粒尤其是納米級二氧化矽具有分散性好、比表面積大、吸附能力強等優點，可用來作為藥物的載體。如Natsugoe等將藥物BLM吸附到矽微粒子上，對食道癌患者瘤周黏膜下注射，結果表明，吸附藥物的矽微粒具有淋巴靶向給藥和緩釋的功能。
發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明的目的之一在於提供一種提高定位前哨淋巴結的方便性和準確性的以二氧化矽微粒為載體的淋巴染料；本發明的另一目的在於提供這種染料的製備方法。
本發明是通過以下技術方案實現的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，在淋巴染料分子與二氧化矽微粒的連接體系中，染料分子質量濃度為0.01～5wt％，二氧化矽微粒質量濃度為92～95wt％，餘量為微球的膠聯劑和修飾劑。
所述的標記淋巴結的染料是指可在臨床上使用的染料，包括異硫藍(isosulfan blue)，美藍(methythionium)，專利藍(patent blue)，伊文思藍(evans blue)，靛卡紅(indigocarmine)等中的任意一種及任意幾種的組合。
所述的二氧化矽微粒是指二氧化矽的納米粒子和微米粒子，二氧化矽納米粒子是指粒度在3～1000nm粒子，二氧化矽微米粒子是指粒度在1～10μm的粒子，為球形，橢球形，或其他不規則形狀，二氧化矽粒子中含有孔隙或不含有孔隙。
所述膠聯劑為表面活性劑、高分子、及小分子中的一種或一種以上的混合物。
所述修飾劑為分子中含有羧基、氨基、羥基、磺酸基、腈基中的一種或一種以上極性基團的高分子或小分子或者矽烷偶連劑中的一種，二氧化矽表面修飾度為0～99％。
將臨床上可用來標記淋巴結的染料連接到二氧化矽微粒上。所述的染料分子與二氧化矽微粒的連接，是通過物理包埋、吸附任意一種方法或兩種方法同時並用。所述的物理包埋和吸附，是將染料分子溶解到二氧化矽微粒的水相溶液或有機溶液或水相與有機溶劑的混合液中，染料分子擴散進入二氧化矽微粒的空腔、孔隙以及表面。
所述的二氧化矽納米粒子，是通過化學氣相沉積法、離子交換法、化學沉澱法、溶膠-凝膠法、微乳液法、膠束法中的任意一種或幾種的組合方法獲得的。染料分子是在二氧化矽納米粒子合成前加入的，或者在合成結束後加入的，通過洗滌分離除去未結合的染料。
本發明可將染料分子水溶液包埋到油包水型(W/O)的微乳中，然後在該微乳中通過正矽酸乙酯的水解或矽酸鈉與酸反應合成二氧化矽，從而將染料分子包埋到二氧化矽粒子中。
本發明中，可先按常規方法獲得納米級二氧化矽，用有機溶劑和/或水洗滌後，分散於含膠聯劑的水溶液中，通過噴霧乾燥方法獲得二氧化矽微球，然後在水相或有機相中將染料分子連接到二氧化矽微球上。或者在獲得納米級二氧化矽後，用有機溶劑和/或水洗滌後，分散於含染料分子和膠聯劑的水溶液中，然後一起噴霧乾燥的。所述的噴霧乾燥，液滴的噴霧是通過氣流式霧化器、壓力式霧化器、旋轉式霧化器、超聲波霧化器中的任意一種進行的。噴霧乾燥的進風溫度為30～250℃，載氣為惰性氣體或空氣。通過控制噴霧乾燥條件，獲得小於10μm的粒子。所述的膠聯劑是指表面活性劑、高分子、及小分子中的任意一類中的任意一種或任意幾種的任意組合。所獲得的二氧化矽微球可進行常壓乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥中的任意一種方式進一步乾燥，乾燥的時間為0～3天。乾燥產物放置於矽膠乾燥器或空氣中保存。
此外，本發明還將在靜電力和高分子輔助下自組裝而成空心球形二氧化矽。即以納米級膠體粒子為模板，將納米二氧化矽和聚電解質通過靜電作用逐層交替吸附到模板表面。然後通過高溫煅燒或溶劑溶解的方法將模板溶解除去，形成微米級或納米級的二氧化矽空心粒子，通過控制吸附的納米二氧化矽和聚電解質的層數以獲得不同殼層厚度的二氧化矽空心粒子。所述的納米級膠體粒子模板，是指高分子納米粒子或無機納米粒子模板，模板材料為人血清白蛋白，牛血清白蛋白，小牛酪蛋白，雞蛋白，玉米蛋白，澱粉，明膠，阿拉伯膠，海藻酸鹽，殼聚糖，甲基纖維素，乙基纖維素，羧甲基纖維素，羧丙甲纖維素，鄰苯二甲酸醋酸纖維素，丁醋酸纖維素，琥珀酸醋酸纖維素，聚胺基酸，聚碳酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚丙烯酸樹脂，聚乳酸，聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物，聚合酸酐，乙交酯丙交酯共聚物，ε-己內酯丙交酯嵌段共聚物，羧甲基葡聚糖，聚苯乙烯中的任意一種以及半導體化合物中的任意一種。
所述的模板，其尺度為20～1000nm。
染料分子是在二氧化矽空心粒子形成之前加入的，或者在二氧化矽空心粒子形成之後加入的，或者在二氧化矽空心粒子形成過程中加入的。染料存在於二氧化矽空心粒子的空腔中、二氧化矽殼層之中和組成二氧化矽空心粒子的每一個二氧化矽納米粒子表面或孔隙之中的任何一個地方。
本發明中，二氧化矽微粒表面含有修飾劑，這些修飾劑是指分子中含有羧基、氨基、羥基、磺酸基、腈基中的一種或幾種極性基團的高分子或小分子，或者是指矽烷偶連劑，二氧化矽表面修飾度為0～99％。
本發明所述的二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，是以水溶液狀態存在的，或是以粉末狀態存在的。染料分子連接到二氧化矽微粒上之後，進行滅菌，滅菌方式為加熱滅菌或熱壓滅菌或濾過除菌或紫外燈輻照或其他無菌操作中的一種。
本發明將標記淋巴結的染料通過包埋、吸附等方法連接到3nm～10μm的二氧化矽微粒表面、孔隙或內部空腔中，形成連接藍染料的二氧化矽微粒。這種微粒可通過其空間體積的位阻將染料截留在前哨淋巴結或減慢流過前哨淋巴結的速度，此外，還可藉助納米二氧化矽所具有的淋巴靶向性的特點使染料定向釋放或定向緩釋到淋巴結。二氧化矽微粒的空間體積的位阻、多孔的緩釋效應以及淋巴靶向性的特點，使連接在二氧化矽微粒上的染料比單純的染料在標記識別前哨淋巴結時具有更大的優越性，在腫瘤普外科領域具有廣泛的應用。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例進一步說明本發明是如何實現的實施例1將6mL環己烷、1.5mL Triton X-100、1.5mL正己醇和2.5mL的水溶液混合，得到透明澄清的微乳。向該微乳中滴加正矽酸乙酯的乙醇溶液，並用氨水調節pH至9左右，室溫下攪拌反應。通過離心分離產物，用乙醇和去離子水反覆交替洗滌離子所得的沉澱，然後將沉澱分散於去離子水中。
TEM觀察表明，所得產物主要為規則的接近單分散的球形二氧化矽粒子，粒度為70nm左右。但也有部分顆粒發生了團聚。
將洗滌後的沉澱再分散於水相中，向其中加入異硫藍溶液，超聲波分散10min，再靜置30min左右後，離心，棄去上清，結果得到藍色沉澱。通過控制混合體系中二氧化矽和異硫藍的量，可得異硫藍約佔5wt％、二氧化矽約佔95wt％的產物。
實施例2將6mL環己烷、1.5mL Triton X-100、1.5mL正己醇和2.5mL的異硫藍水溶液混合，得到透明澄清的異硫藍微乳。向異硫藍微乳中滴加正矽酸乙酯的乙醇溶液，並用氨水調節pH至9左右，室溫下攪拌過夜。通過離心分離產物，用乙醇和去離子水反覆交替洗滌離子所得的沉澱，然後將沉澱分散於去離子水中，並於100℃蒸汽滅菌30min。
結果得到包埋異硫藍的藍色溶膠，TEM觀察表明，所得產物主要為規則的接近單分散的球形粒子，粒度為70nm左右，少部分團聚體粒度達到了亞微米。
實施例3在實施例2的異硫藍微乳體系中，水相中含有聚乙二醇，然後按實施例2相同的方法合成二氧化矽，獲得的二氧化矽分散於生理鹽水中，並於100℃蒸汽滅菌30min。
結果亦得到包埋異硫藍的藍色溶膠。TEM觀察下，大部分粒子為50～70nm的球形粒子，具有很好的分散性。
實施例4按實施例2製備不含藍染料的二氧化矽納米粒子溶膠，通過下面5種方法進行噴霧乾燥(1)將獲得的二氧化矽納米粒子分散於含異硫藍去離子水中，然後在進風溫度為110℃，出風溫度為75±2℃，霧化盤轉速度為20000r·min-1，進料速度為1ml·min-1的條件下噴霧乾燥。噴霧乾燥過程中，對噴霧的前驅體混合液進行攪拌。
將粉末粒子分散於含1mg·ml-1的聚二甲基二烯丙基氯化胺(PDADMAC)和0.5mol·l-1的NaCl的混合溶液中，振蕩，使PDADMAC吸附在二氧化矽微球表面。
結果獲得藍色的產物，顯微鏡下觀察發現，粒子為1～3μm，具有較好的分散性。
(2)將獲得的二氧化矽納米粒子分散於含異硫藍和0.2wt％牛血清白蛋白(BSA)的去離子水中，然後在進風溫度為110℃，出風溫度為75±2℃，霧化盤轉速度為20000r·min-1，進料速度為1ml·min-1的條件下噴霧乾燥。噴霧乾燥過程中，對噴霧的前驅體混合液進行攪拌。將獲得的乾燥粉末置於120℃烘箱中加熱2h，使BSA變性。產物置於矽膠乾燥器中保存。
結果得到不溶於水的藍色粉末粒子，粒子粒度亦為1～3μm。對微球的水溶液進行超聲波處理，微球仍能較好地保持原有的形貌。
(3)將獲得的二氧化矽納米粒子分散於含0.2wt％BSA的去離子水中，然後在進風溫度為110℃，出風溫度為75±2℃，霧化盤轉速度為20000r·min-1，進料速度為1ml·min-1的條件下噴霧乾燥。噴霧乾燥過程中，對噴霧的前驅體混合液進行攪拌。將獲得的乾燥粉末置於120℃烘箱中加熱2h，使BSA變性。
將粉末粒子分散於含異硫藍的溶液中，60℃水浴中處理30min，然後冷卻至室溫。通過離心和洗滌，除去游離的藍染料。
結果獲得藍色的沉澱，粒子為2～5μm。
(4)將獲得的二氧化矽納米粒子分散於含0.2wt％BSA的去離子水中，然後在進風溫度為70℃，出風溫度為50±2℃，霧化盤轉速度為20000r·min-1，進料速度為1ml·min-1的條件下噴霧乾燥。噴霧乾燥過程中，對噴霧的前驅體混合液進行攪拌。將獲得的乾燥粉末置於120℃烘箱中加熱2h，使BSA變性。
將粉末粒子分散於含異硫藍的溶液中，60℃水浴中處理30min，然後冷卻至室溫。通過離心和洗滌，除去游離的藍染料。結果獲得藍色的沉澱，所有粒子均為規則的球形，粒子為2～5μm。
(5)將獲得的二氧化矽納米粒子分散於含0.5wt％BSA的去離子水中，然後在進風溫度為250℃，霧化盤轉速度為20000r·min-1，通過控制進料速度使出風溫度穩定在220±2℃，噴霧乾燥過程中，對噴霧的前驅體混合液進行攪拌。將獲得的乾燥粉末置於120℃烘箱中加熱2h，使BSA進一步變性。
將粉末粒子分散於含異硫藍的溶液中，60℃水浴中處理30min，然後冷卻至室溫。通過離心和洗滌，除去游離的藍染料。
結果得到的粒度為2～10μm藍色粒子本實施例的5種方法中，通過加入的異硫藍、二氧化矽、PDADMAC、BSA的比例，可方便地獲得異硫藍質量濃度為0.01～5wt％，二氧化矽微粒質量濃度為92～95wt％的二氧化矽微球。異硫藍主要是通過吸附的方法結合到二氧化矽的表面及其孔隙中的。
實施例5按實施例2製備不含藍染料的50nm左右的納米二氧化矽粒子。並用乙醇和去離子水反覆洗滌沉澱，將沉澱配製適當濃度的去離子水溶液。
將經過蒸餾的30mL苯乙烯單體、適量K2S2O3和0.8g聚乙烯醇加入到500mL去離子水中，在氮氣保護和75℃下高速攪拌回流反應3h.用甲醇分離產物，並用去離子水和甲醇反覆洗滌分離出的沉澱，結果得到粒度主要分布在200～500nm的球形聚苯乙烯粒子。
將聚苯乙烯加入到50mL濃度為1mg·mL-1的PDADMAC和0.5mol·l-1的NaCl的混合溶液中，超聲波分散，使聚苯乙烯與PDADMAC吸附約30min。用去離子水洗滌產物2次，然後加入到二氧化矽溶液中，攪拌吸附30min，用去離子水洗滌產物2次，再將沉澱分散到50mL濃度為1mg·mL-1的PDADMAC水溶液中吸附30min，用去離子水洗滌後，然後將沉澱分散到二氧化矽溶液中吸附30min。如此依次交替吸附PDADMAC和二氧化矽，得到吸附4層PDADMAC和二氧化矽的聚苯乙烯微球。將這種聚苯乙烯微球於500℃煅燒1h，將聚苯乙烯除去，即得到空心的二氧化矽微球。
TEM觀察表明，獲得的二氧化矽空心粒子為400～2μm。
取獲得的空心球形二氧化矽適量，浸泡在含美藍的溶液中，磁力攪拌2h，離心後棄去上清，沉澱進行冷凍乾燥24h，結果得到藍色的二氧化矽粉末，藍染料主要存在於二氧化矽空心粒子的空腔中。
權利要求
1.一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其特徵在於淋巴染料分子與二氧化矽微粒的連接體系中，染料分子質量濃度為0.01～5wt％，二氧化矽微粒質量濃度為92～95wt％，餘量為微球的膠聯劑和修飾劑，所述的二氧化矽微粒為載體的淋巴染料為水溶液狀或粉末狀中的一種。
2.根據權利要求1所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其特徵在於所述淋巴染料為異硫藍、美藍、專利藍、伊文思藍或靛卡紅中的一種或一種以上的混合物。
3.根據權利要求1所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其特徵在於所述二氧化矽微粒為粒度在1～10μm的微米粒子和粒度在3～1000nm的納米粒子，形狀為球形，橢球形，或不規則形狀。
4.根據權利要求1所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其特徵在於所述膠聯劑為表面活性劑、高分子、及小分子中的一種或一種以上的混合物。
5.根據權利要求1所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其特徵在於所述修飾劑為分子中含有羧基、氨基、羥基、磺酸基、腈基中的一種或一種以上極性基團的高分子或小分子或者矽烷偶連劑中的一種，二氧化矽表面修飾度為0～99％。
6.根據權利要求1、2、3、4或5所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，其製備方法如下選用物理包埋或吸附中的一種方法或兩種方法同時並用將染料分子溶解到二氧化矽微粒的水相溶液或有機溶液或水相與有機溶劑的混合液中，染料分子擴散進入二氧化矽微粒的空腔、孔隙以及表面，染料分子在二氧化矽微粒合成前加入或者在合成結束後加入的，通過洗滌分離除去未結合的染料，最後進行滅菌。
7.根據權利要求1、2、3、4或5所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料的製備方法，其特徵在於將染料分子水溶液包埋到油包水型微乳中，然後在該微乳中通過正矽酸乙酯的水解或矽酸鈉與酸反應合成二氧化矽，從而將染料分子包埋到二氧化矽粒子中，最後進行滅菌。
8.根據權利要求1、2、3、4或5所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料的製備方法，其特徵在於將納米級二氧化矽用有機溶劑和/或水洗滌後，分散於含膠聯劑的水溶液中，通過噴霧乾燥方法獲得二氧化矽微球，然後在水相或有機相中將染料分子連接到二氧化矽微球上或者將納米級二氧化矽用有機溶劑和/或水洗滌後，分散於含染料分子和膠聯劑的水溶液中，然後一起噴霧乾燥，噴霧乾燥的進風溫度為30～250℃，載氣為惰性氣體或空氣，最後進行滅菌。
9.根據權利要求1、2、3、4或5所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料的製備方法，其特徵在於以納米級膠體粒子為模板，模板尺度為20～1000nm，將二氧化矽和聚電解質通過靜電作用逐層交替吸附到模板表面，然後通過高溫煅燒或溶劑溶解的方法將模板溶解除去，形成微米級或納米級的二氧化矽空心粒子，進行滅菌，染料分子在二氧化矽空心粒子形成之前加入，或者在二氧化矽空心粒子形成之後加入，或者在二氧化矽空心粒子形成過程中加入，
10.根據權利要求9所述的一種二氧化矽微粒為載體的淋巴染料的製備方法，其特徵在於所述的納米級膠體粒子模板為高分子納米粒子或無機納米粒子模板，模板材料為人血清白蛋白，牛血清白蛋白，小牛酪蛋白，雞蛋白，玉米蛋白，澱粉，明膠，阿拉伯膠，海藻酸鹽，殼聚糖，甲基纖維素，乙基纖維素，羧甲基纖維素，羧丙甲纖維素，鄰苯二甲酸醋酸纖維素，丁醋酸纖維素，琥珀酸醋酸纖維素，聚胺基酸，聚碳酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚丙烯酸樹脂，聚乳酸，聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物，聚合酸酐，乙交酯丙交酯共聚物，ε-己內酯丙交酯嵌段共聚物，羧甲基葡聚糖，聚苯乙烯中的任意一種以及半導體化合物中的任意一種。
全文摘要
本發明公開了二氧化矽微粒為載體的淋巴染料的製備方法，屬於微納米技術與臨床醫學基礎的交叉領域。本發明將標記淋巴結的染料通過吸附、包埋等方法連接到二氧化矽微粒表面、孔隙或內部空腔中，形成可用於標記識別前哨淋巴結二氧化矽微粒。本發明具有實質性特點和顯著進步，本發明可通過二氧化矽的空間體積的位阻效應將染料截留在前哨淋巴結或減慢流過前哨淋巴結的速度，此外，還可藉助納米二氧化矽所具有的淋巴靶向性的特點使染料定向釋放或定向緩釋到淋巴結。本發明所提供的二氧化矽微粒為載體的淋巴染料，可提高定位前哨淋巴結的方便性和準確性，在腫瘤普外科領域具有重要的科學研究價值和廣闊的應用前景。
文檔編號A61K49/06GK1698909SQ20051002559
公開日2005年11月23日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者儲茂泉 申請人:同濟大學