工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法
2023-12-01 15:21:26 1
專利名稱：工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法，屬於生物細菌的定量檢測方法。
工業循環冷卻水系統本身就是一個良好的細菌生長的生態環境，為細菌的生長提供了空氣、水分、溫度和適宜的酸鹼度。在密閉的循環冷卻水系統中，一般均使用亞硝酸類的緩蝕劑，其亞硝酸根的濃度要保持在300～400mg/L。這為硝酸菌(NItrobacter)的生長提供了充分的無機鹽養料。硝酸菌大量的繁殖，將形成生物汙泥堆積在管道內，從而降低設備傳熱效率，並堵塞管道。同時由於細菌的生化作用，水中的亞硝酸根迅速地轉化為硝酸根，不僅使緩蝕劑的濃度大大降低，而生成的大量硝酸為強酸物質，腐蝕設備。現有技術中因沒有測定方法，只能用測定水中異氧菌數來代表細菌的總數，來評定水的質量。如中國專利ZL97112019.6公開的《快速測定循環水中含菌量的方法》，以TTC為染色劑，與由蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、蒸餾水配製成的染色培養基液，經組裝試管後滅菌備用；再將定量的被測水移入備好的試管中封閉搖均後，置入恆溫培養箱內培養，至試管內液體變為淺粉紅色，按所培養時間得出單位容積被測水中含菌數。該方法操作簡便、測定快速，但所測出的仍是水中異氧菌的總數。而硝酸細菌是一類化能自氧細菌，是與異氧菌生理代謝類型不同的細菌。因此只測定水中異氧菌數量，是無法正確判定有亞硝酸和氨類物質存在的水系統中細菌的總量，從而確定水的好壞程度的。在實際生產中，往往造成水系統中的藥劑濃度反覆波動，有時幾天內亞硝酸根從正常的300～400mg/L降到檢不出，而硝酸根從十幾個mg/L上升到上千個mg/L，嚴重影響生產的正常進行。
本發明的目的是提供一種能夠簡單、方便地對硝酸細菌進行定量檢測的工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法，以便科學地進行水質管理，合理指導水中殺菌劑的投加，有效地控制細菌的生長，保證生產正常進行，同時也使得對殺菌劑的殺菌效率能夠作出正確評價。
本發明的目的是通過以下措施實現的。
一種工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法，採用最大可能菌數計數法(MPN法)，其檢測步驟如下1)製備培養基用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養基，並用酸或鹼調pH值至中性，定量分裝於試管中滅菌後備用；2)製備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解後，用水稀釋到1000ml製成比色試劑原液，再取3～5份比色劑原液和1份水混合均勻製成比色試劑；3)水樣採集與稀釋用無菌採樣瓶採集被測水樣，在無菌箱內以10倍稀釋法做至少3個稀釋度，應使最後一個稀釋度接種培養後沒有硝酸細菌生長；4)接種在前述裝有培養基的滅過菌的試管中分別加入等量的不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做4～6個重複組，其中一組作為對照組，其餘為檢測組；5)恆溫培養將上述檢測組試管置於28～30℃恆溫培養3～14天，同時將對照組試管置於4℃冰箱內保存相同的時間；6)結果檢查計數從培養後的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養液於比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細菌生長，根據檢查結果，得出陽性組合指數，用MPN法查表求出每毫升水樣中硝酸細菌數。
製備培養基是按亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養基，並用鹽酸[1∶1]調pH值至7.0±0.2。
恆溫培養中的檢測組水樣在培養至少3天後進行預檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養液於比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，當目測結果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進行結果檢查記數。
本發明利用硝酸細菌生化反應測定水中的硝酸細菌。硝酸細菌的生化反應為為證實以上反應，進行了如下實驗。在含有NaNO2濃度為500mg/L培養液中，加入有硝酸菌的水樣，在30℃培養後測定培養液中亞硝酸根和硝酸根的濃度變化，表1為實驗結果(以下所述對硝酸根和亞硝酸根的測定均採用離子色譜法)。表1
從以上實驗的結果可以看出，由於硝酸菌的生理活動，使培養液中的亞硝酸根離子的濃度很快降低，而硝酸根離子的濃度迅速升高。因此，從理論上分析，判斷水樣中是否有硝酸細菌，可以採用兩種方法一是測定培養液中硝酸根離子濃度的增加，二是測定培養液中亞硝酸根離子濃度的降低。測定硝酸根離子的增加，可利用其與二苯胺試劑的顏色反映。但被測定的水樣中，通常本身就含有硝酸根，甚至有大量的硝酸根，使其水樣未進行培養就會呈陽性反應；另外，該反應又受業硝酸根離子的嚴重幹擾，兩種因素使得用測定硝酸根濃度增加的方法，對水樣中有無硝酸菌無法進行正確的判定。用培養液中亞硝酸根離子的減少來判定水樣中是否有硝酸細菌生長，從理論分析和上述試驗都可以看出是可行的。
本發明採用的顯色劑中含有對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺，利用亞硝酸根與對氨基苯磺酸的重氮化反應，生成的對重氮苯磺酸再與鹽酸萘乙二胺反應，生成紅色的偶氮化合物。該反應靈敏，不受硝酸根離子和其他離子幹擾，為亞硝酸根的特徵反應，亞硝酸根含量的多少以紅色深淺來指示非常明顯，適用於細菌檢驗。該反應的化學反應式如下
本發明將對照組培養液置於冰箱內4℃保存，在保存期內亞硝酸根的濃度基本保持不變。為證明這一結論，比較在4℃和30℃下培養含硝酸菌水樣，對亞硝酸根的轉化實驗。表2所示為實驗結果。表2
從以上實驗結果可以看出，以放置在4℃的一組水樣培養液為對照組是可行的。
硝酸菌的培養時間，經多次實驗證明，如果水系統中硝酸菌含量高(可從測定未培養前接種培養液中硝酸根離子濃度高來確定)，則只需培養3天，接種培養液中亞硝酸根濃度就從100mg/L以上降到未檢出。一般情況在培養8、9天後亞硝酸根濃度就有明顯的減少，甚至下降到檢不出。因此以一般對細菌檢測周期14天進行培養，硝酸菌對亞硝酸根的轉換已經完成。對未含有硝酸菌的水樣在30℃進行培養，測試培養液中硝酸根及亞硝酸根的濃度，在14天後仍無明顯的變化。在培養43天後亞硝酸根濃度有一些變化。表3所示為未含有硝酸菌水樣的實驗結果，培養液中加入500mg/L濃度的亞硝酸鈉。表3
以上試驗結果表明，水樣在30℃培養14天，如果未含有硝酸菌，則培養液中硝酸根濃度無明顯變化；如果水樣中含有硝酸菌，則硝酸菌的生理活動以完全能夠將培養液中的亞硝酸根濃度明顯降低，從而可用MPN計數法定量檢測出硝酸菌的濃度。
根據水樣中硝酸菌濃度的不同，硝酸菌的生理活動對亞硝酸根的轉換完成的時間從3天到14天不等，採用預檢測步驟能夠有效地減少檢測所需要的時間。
培養液中亞硝酸根的濃度在500～1000mg/L的範圍內，對硝酸菌的生理活動影響不大，因此在這個濃度內配製都可以。表4為硝酸菌濃度為500mg/L和1000mg/L兩種培養基的對比試驗結果。表4<
考慮到用相對低的濃度培養更利於細菌生長，並在比色測定時色差更為明顯，故採用500mg/L的亞硝酸鈉培養液效果更加。
本發明方法與現有技術相比所具有的優點在於能夠簡單、方便地對工業循環冷卻水中的硝酸細菌進行定量檢測，而不是用測定水中的異氧菌來替代，使得能夠科學地對水質進行管理，合理指導水中殺菌劑的投加，有效地控制細菌的生長，保證生產正常進行，同時也使得對殺菌劑的殺菌效率能夠作出正確評價。由於該方法簡單、易行、容易學習、原料容易取得，因此可以很方便地用於冶金、化工、及各大化肥廠等工業循環冷卻水系統中，對硝酸細菌的測定、防治。
下面對本發明的實施例進行詳述。
一種工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法，採用最大可能菌數計數法(MPN法)，其檢測步驟如下1)製備培養基用亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養基，並用鹽酸[1∶1]調pH值至7.0±0.2，分裝於15×150毫米的試管中，每管準確裝入培養基5ml，管口塞上棉塞，於121±1℃高壓滅菌至少15分鐘後備用；2)製備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解後，用水稀釋到1000ml製成比色試劑原液，再取4份比色劑原液和1份水混合均勻製成比色試劑；3)水樣採集與稀釋採用在140℃高溫下乾熱滅菌至少2小時的無菌採樣瓶採集被測水樣，在無菌箱內以10倍稀釋法做5個稀釋度，使最後一個稀釋度接種培養後沒有硝酸細菌生長；4)接種在前述裝有培養基的滅過菌的試管中分別加入1毫升不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做5個重複組，其中一組作為對照組，其餘為檢測組；5)恆溫培養將上述檢測組試管置於28～30℃恆溫培養，同時將對照組試管置於4℃冰箱內保存相同的時間；6)預檢測恆溫培養中的檢測組水樣在培養至少3天後進行預檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養液於比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，當目測結果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進行下一步的結果檢查記數。
7)結果檢查計數從培養後的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取0.05毫升的培養液於10毫升比色管中，再於比色管中加入5毫升比色試劑，15分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細菌生長。根據檢查結果，採用GB/T14643.6-93《工業循環冷卻水中鐵細菌的測定-MPN法》，得出陽性組合指數，查表求出每毫升水樣中硝酸細菌數。
本發明方法中，製備培養基中所給出的液體培養基的各成分的含量和製備比色劑中比色劑原液的各成分含量，實際是比例關係，而不限於其所給出的具體量。另外比色劑原液可隨時製備，貯於棕色瓶內密閉置於冰箱中，可保存一個月。
權利要求
1.一種工業循環冷卻水中硝酸細菌的測定方法，採用最大可能菌數計數法(MPN法)，其特徵在於1)製備培養基用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養基，並用酸或鹼調pH值至中性，定量分裝於試管中滅菌後備用；2)製備比色試劑取冰醋酸50ml與900ml水混合，加入對氨基苯磺酸5.0克，蓋塞搖均，加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解後，用水稀釋到1000ml製成比色試劑原液，再取3～5份比色劑原液和1份水混合均勻製成比色試劑；3)水樣採集與稀釋用無菌採樣瓶採集被測水樣，在無菌箱內以10倍稀釋法做至少3個稀釋度，應使最後一個稀釋度接種培養後沒有硝酸細菌生長；4)接種在前述裝有培養基的滅過菌的試管中分別加入等量的不同稀釋度的水樣，每個稀釋度做4～6個重複組，其中一組作為對照組，其餘為檢測組；5)恆溫培養將上述檢測組試管置於28～30℃恆溫培養3～14天，同時將對照組試管置於4℃冰箱內保存相同的時間；6)結果檢查計數從培養後的每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養液於比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，紅色較淡的比色管為陽性(+)，表示有硝酸細菌生長，與對照組紅色一致的為陰性(-)，表示沒有硝酸細菌生長，根據檢查結果，得出陽性組合指數，用MPN法查表求出每毫升水樣中硝酸細菌數。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的製備培養基是按亞硝酸鈉0.5克、碳酸鈉1.0克、磷酸二氫鈉0.25克、磷酸氫二鉀0.75、硫酸鎂0.03與蒸餾水1000毫升的比例配置成液體培養基，並用鹽酸[1∶1]調pH值至7.0±0.2。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的恆溫培養中的檢測組水樣在培養至少3天後進行預檢測，從一組每個稀釋度的每支檢測組試管及對照組試管中分別取適量的培養液於比色管中，加入適量比例的比色試劑，10～20分鐘後，將檢測組發出的紅色與對照組目測比較，當目測結果具有為陽性(+)的檢測組試管時，即可進行結果檢查記數。
全文摘要
一種利用硝酸細菌生化反應對工業循環冷卻水中硝酸細菌進行測定的方法,用適量的亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂與蒸餾水配置成液體培養基;取冰醋酸50ml與900ml水混合,加入對氨基苯磺酸5.0克搖均,加入鹽酸萘乙二胺0.05克溶解,用水稀釋到1000ml製成比色試劑液;採用多管發酵技術,在28℃～30℃恆溫培養3～14天;再用比色法測定試管培養基中被測試樣是否為陽性反應;最後採用MPN法,對被測試樣中的硝酸細菌進行定量。
文檔編號C12Q1/06GK1250103SQ9911921
公開日2000年4月12日 申請日期1999年8月26日 優先權日1999年8月26日
發明者劉韻秋 申請人:上海寶鋼集團公司