一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法
2023-12-01 13:46:01 2
一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法
【專利摘要】針對現代生物醫藥與輕工業食品產業體系中，微生物控溫發酵生產過程高能耗的問題。本發明提供一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法，屬於生物化工領域。以嗜熱菌，耐熱菌中的熱激蛋白、泛素、ATP合成酶基因以及釀酒酵母中熱激蛋白基因作為功能元件，以釀酒酵母中不同強度啟動子作為調控元件，通過單功能、多功能、協同型3種不同組裝方式構建耐熱元器件，構建的耐熱元器件再以載體和基因組整合2種策略導入酵母細胞中，實現耐熱元器件與底盤宿主釀酒酵母的集成。通過梯度升溫和恆定高溫培養發酵表徵元器件的耐熱性，實現釀酒酵母在分子水平上不同耐熱程度的調控，為工業發酵生產生物基產品的高效、低能耗過程提供了新方法。
【專利說明】一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用構建的耐熱元器件提高工業微生物釀酒酵母的耐熱性及其工業應用，屬於生物化工領域。
【背景技術】
[0002]微生物耐熱性是決定發酵過程能量消耗和產物合成效率的重要因素。利用微生物發酵生產生物質產品的過程中，細胞新陳代謝釋放出大量的熱，發酵體系逐漸升溫，無法自行降到反應所需的最適溫度，所以需消耗大量冷卻水控溫，導致動力費用增加、發酵過程高能耗的問題。但與之矛盾的是，胞內大多數酶的最適反應溫度都高於最適生長溫度，從反應熱力學角度分析，提高溫度可以有效地活化反應過程，加速代謝傳質，提高細胞合成效率。所以提高發酵菌株耐熱性，擴寬最適生長溫度的範圍將很好的解決這一矛盾，能夠大幅度降低成本，同時提高生產效率。
[0003]釀酒酵母的耐熱性一直是酵母菌研究和發酵工業生產的熱點問題。釀酒酵母不僅由於它是一種公認的安全微生物，更因為其生長速度快、易於遺傳操作、發酵能力強、無內毒素、對乙醇及其他抑制物的耐受性也比較強的優勢，使其成為工業生物技術中應用最廣泛的工業生產菌株之一。因此，提高釀酒酵母的耐熱性是獲得低成本生物製品的有效途徑。
[0004]目前，國內外的研究人員主要通過適應性馴化策略或者遺傳操作策略主要包括雜交、隨機誘變、進化工程和基因組重排等方法對酵母菌進行耐熱性能的改造。但整體上來說，利用基因工程的方法構建的耐熱釀酒酵母成功的例子很少，效果不明顯。而且這些方法只能提高最適生長溫度，無法擴寬最適生長溫度範圍，不能滿足工業發酵逐漸升溫的需求。而通過引入外源耐熱機制分子水平上改造釀酒酵母的耐熱性雖已有報導，但研究不系統，應用於工業梯度升溫發酵還未見報導。
[0005]極端微生物代表著`生命的極限，蘊藏著豐富的未知生物學過程和功能，是豐富的特殊功能蛋白質資源寶庫，有著不可估量的生物技術開發前景。對於極端嗜熱菌，能生活在近100°C的環境中，有其獨特的適應機制，主要與芽孢、細胞膜的組成成分、嗜熱酶、蛋白質空間結構、熱激蛋白以及遺傳物質有關，其中產生大量熱激蛋白是一種重要分子調控手段。其不僅在熱脅迫下能夠有效的保護細胞，對於有機溶劑、酸性環境等脅迫也能發揮其生理生化功能。目前，將熱保護機制中的關鍵的基因開發成具有耐熱功能的分子元器件來改造釀酒酵母的耐熱性，並且應用於工業生產的發酵過程還未見有文獻報導。
[0006]基於近年來合成生物學快速發展，發掘了不同強度的耐熱元器件並進行人工設計及優化，對釀酒酵母進行分子水平的調控，提高了其耐熱性。應用於微生物發酵生產過程，將大幅度提高生產強度，降低成本。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是為解決工業微生物培養過程中由於控制常溫發酵導致生產過程高能耗的問題。提供一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法。[0008]為實現上述目的，本發明的技術方案提供一種構建耐熱元器件及耐熱釀酒酵母的方法，從分子水平上調控釀酒酵母的耐熱性。從嗜熱菌和耐熱菌中通過克隆或人工合成得到一系列對細胞具有熱保護功能的基因作為功能元件，如熱激蛋白，泛素和ATP合成酶基因等，以釀酒酵母中不同強度啟動子作為調控元件，通過以下3種不同的組裝方式構建耐熱元器件:(I)以單個功能元件和調控元件組裝成單功能型耐熱元器件:啟動子-功能元件-終止子；(2)針對功能互作的或者具有不同熱保護功能的功能元件組裝成多功能型耐熱元器件:啟動子1-功能元件1-終止子1-啟動子2-功能元件2-終止子2-啟動子η-功能元件η-終止子n(n ^ 2) ; (3)以從底盤宿主釀酒酵母中挖掘出的耐熱基因作為內源功能元件，與上述外源功能元件進行組裝成協同型耐熱元器件:啟動子1-外源功能元件1-終止子1-啟動子2-內源功能元件2-終止子2-啟動子η-(內，外)功能元件η-終止子η (η ^ 2)。將構建的所有耐熱元器件以2種策略導入釀酒酵母中，第一種策略是以載體的形式導入，第二種策略是利用基因組裝的方法將其直接整合到釀酒酵母基因組上，實現耐熱元器件與釀酒酵母的集成，以拓寬釀酒酵母的最適生長溫度範圍，提高其耐熱性，作為真正意義上的耐熱底盤宿主用於工業微生物發酵過程。通過梯度升溫發酵及恆定高溫發酵表徵工程菌耐熱性，並進行耐熱元器件與β -香樹脂醇人工合成途徑的功能驗證，實現釀酒酵母不同耐熱程度的分子調控，使其在高溫培養下β_香樹脂醇的產量有了明顯的提高。此外對構建的耐熱元器件進行了有機溶劑的耐受性分析，發現這種分子水平調控方法使釀酒酵母兼備耐熱和耐有機溶劑的雙重功能。
[0009]本發明的提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法，具有以下優點:
[0010]1、本發明構建的耐熱元器件實現了釀酒酵母不同程度耐熱性的分子調控，滿足了不同發酵生產要求。
[0011]2、本發明構建的耐熱釀酒酵母工程菌，簡化了發酵工藝，降低了生產成本，達到節能減排的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】`
[0012]圖1 為構建的三個工程菌 Τ.te-TTE2469, T.te_GroS2，T.te-1bpA 以及 WT/Vector對照菌株分別在6% (v/v)和8% (v/v)乙醇濃度下的OD66tol值的變化(a) (b)和細胞存活率(C) Cd)圖。
[0013]圖2為構建的耐熱β -香樹脂醇工程菌Sg-sb-T.te-TTE2469和Sg_sb對照菌株在40°C培養下β_香樹脂醇的產量圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0015]實施例1:單功能型耐熱元器件組裝
[0016]通過NCB1、HSPIA等資料庫查閱已完成測序的嗜熱微生物以及相關具有熱保護功能基因，選取嗜熱菌和耐熱菌中的熱激蛋白、泛素和ATP合成酶基因作為功能元件。以騰衝嗜熱菌HSPlO家族基因GroS2為例，與啟動子和終止子進行兩次OE-PCR連接組裝耐熱元器件:啟動子-GroS2-終止子。將構建的所有耐熱元器件與穿梭載體連接後，轉化大腸桿菌，陽性篩選後，挑單菌落培養提取質粒，轉化到釀酒酵母菌中，或者利用基因組裝的方法將耐熱元器件直接整合到釀酒酵母基因組上，實現與底盤宿主釀酒酵母的集成。
[0017]實施例2:多功能型耐熱元器件組裝
[0018]NCBI, HSPIA等資料庫獲得的功能元件中，針對功能互作的如熱激蛋白GroES/GroEL系統或者具有不同熱保護功能的功能元件如(泛素，熱激蛋白和ATP合成酶)組裝成多功能型耐熱元器件。先以GroES/GroEL系統為例，14個單體GroEL分子和7個GroES分子形成中間位空腔的聚合體，幫助蛋白質正確摺疊。首先通過兩次OE-PCR分別得到單功能元件耐熱元器件啟動子1-GroES-終止子I和啟動子2-GroEL-終止子2。然後用基因組裝的方法把兩個單功能耐熱元器件和穿梭載體按一定的濃度比例轉化到釀酒酵母中，或者將兩個單功能耐熱元器件直接整合到釀酒酵母基因組上，陽性篩選後，得到新的耐熱元器件:啟動子1-GroES-終止子1-啟動子2-GroEL-終止子2。不同的耐熱功能元件對細胞具有不同的保護作用，以泛素，熱激蛋白和ATP合成酶為例，泛素的主要功能是將高溫脅迫下細胞中變性蛋白的進行降解，生成一系列的短肽和游離胺基酸後，作為營養物質繼續供細胞利用，使細胞體內達到一種蛋白的平衡，維持其繼續生長。而熱激蛋白最基本的功能是與高溫環境下的變性的蛋白質結合，修復錯誤摺疊的蛋白並維持空間構象和功能，防止其受到環境的損害。ATP合成酶參與氧化磷酸化，在跨膜質子動力勢的推動下合成ATP，為細胞提供能力。實施方法同上，首先通過兩次OE-PCR分別得到單功能耐熱元器件:啟動子1-泛素-終止子1，啟動子2-熱激蛋白-終止子2和啟動子3-ATP合成酶-終止子3，然後用基因組裝的方法把三個單功能耐熱元器件和穿梭載體按一定的濃度比例轉化到釀酒酵母中，或者將三個單功能耐熱元器件直接整合到釀酒酵母基因組上，陽性篩選後，得到新的耐熱元器件:啟動子1-泛素-終止子1-啟動子2-熱激蛋白-終止子2-啟動子3-ATP合成酶-終止子3，實現了與底盤宿主釀酒酵母的集成。其他功能互作的或不同功能的元件採用同樣的方式構建耐熱元器件。
[0019]實施例3:協同型耐熱元器件組裝
[0020]從底盤宿主釀酒酵母中克隆或人工合成對細胞具有較好熱保護功能的基因如HSP104作為內源功能元件，與上述較好的外源功能元件如泛素，HSPlO等再次組裝成協同型耐熱元器件。首先通過兩次OE-PCR分別得到單功能耐熱元器件:啟動子1-HSP104-終止子1、啟動子2-泛素-終止子2、啟動子3-HSP10-終止子3，然後用基因組裝的方法把三個單功能耐熱元器件和穿梭載體按一定的濃度比例轉化到釀酒酵母中，或者將三個單功能耐熱元器件直接整合到釀酒酵母基因組上，陽性篩選後，得到新的耐熱元器件:啟動子1-HSP104-終止子1-啟動子2-泛素-終止子2-啟動子3-HSP10-終止子3，實現了與底盤宿主釀酒酵母的集成。其他不同功能或功能互作的內，外源功能元件採用同樣的方式構建耐熱元器件。
[0021]實施例4:耐熱元器件的生化表型驗證
[0022]通過工程菌高溫發酵表徵所有元器件的耐熱性。挑一單菌落30°C 170rpm培養36小時後，按初始OD66tlnm0.1接種到新的培養基中，正常培養12小時後，通過兩種方式進行高溫培養發酵:(I)發酵溫度上升到35°C繼續培養12後，再以2°C為一個溫度梯度，逐步提高培養溫度至45°C，每個溫度梯度培養12h ; (2)發酵溫度直接上升至42°C、44°C和46°C並連續培養84h。通過菌落形態來定性表徵耐熱性，OD66tol值的變化、細胞存活率、海藻糖含量來定量表徵耐熱性。通過工程菌常溫發酵表徵元器件的乙醇耐受性，挑一單菌落30°C 170rpm培養36小時後，按初始OD66tol0.1接種到含有6% (v/v)和8% (v/v)乙醇濃度下的新的YPD培養基中，連續培養84小時，通過OD66tol值的變化和細胞存活率來定量表徵乙醇耐受性。結果表明構建的工程菌對乙醇耐受性有了明顯的提高。
[0023]實施例5:耐熱元器件的功能驗證
[0024]將獲得的較好的耐熱元器件以載體的形式電轉到釀酒酵母β -香樹脂醇人工合成體系中，構建具有耐熱特性的β_香樹脂醇合成體系。通過β_香樹脂醇產量的變化研究耐熱元器件的引入對底盤宿主及人工合成β-香樹脂醇體系的效應。
[0025]挑一耐熱β -香樹脂醇工程菌30°C 170rpm培養36小時後，按初始OD66tol0.1接種到新的培養基中，然後通過三種方式進行高溫培養發酵:(I)正常培養12小時後，溫度上升到37°C繼續培養12後，再以2°C為一個溫度梯度，逐步提高培養溫度至45°C，每個溫度梯度培養24h ; (2)正常培養12小時後，溫度直接上升至40°C並連續培養至72h ; (3)直接在35°C和38°C分別培養120小時。培養結束後，處理培養物，萃取β -香樹脂醇，最後利用氣相色譜-質譜聯用儀GCMS-QP2010進行耐熱釀酒酵母工程菌發酵生產β -香樹脂醇的分析，產量明顯提高，結果說明耐熱元器`件的構建提高了釀酒酵母在高溫下的耐受能力。
【權利要求】
1.一種提高釀酒酵母耐熱性的分子調控方法，其特徵在於:從嗜熱菌和耐熱菌中通過克隆或人工合成得到對細胞具有熱保護功能的基因作為功能元件，以載體或基因組整合的方式構建耐熱元器件，實現釀酒酵母不同耐熱程度的分子調控。
2.如權利要求1所述的實現分子調控的耐熱元器件的構建，是通過3種不同組裝方式實施的:(1)以單個功能元件和調控元件組裝成的單功能型耐熱元器件；(2)針對功能互作的或者具有不同熱保護功能的功能元件組裝成多功能型耐熱元器件；(3)以從底盤宿主釀酒酵母中挖掘的耐熱基因作為內源功能元件，與上述外源功能元件進行再次組裝的協同型耐熱元器件，構建的耐熱元器件以2種不同策略導入酵母細胞中，第一種策略是以載體的形式導入，第二種策略是將其直接整合到釀酒酵母基因組上。
3.如權利要求2所述的構建的耐熱元器件及其構建方法在提高釀酒酵母耐熱性及其乙醇耐受性方面的應用。`
【文檔編號】C12R1/865GK103820345SQ201410022595
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】李春, 劉月芹, 孫翔英, 孫歡, 周曉宏 申請人:北京理工大學