檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒的製作方法
2023-12-01 10:01:26 1
專利名稱：檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒。
背景技術：
豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是單股正鏈RNA病毒，屬於小RNA病毒科，腸道病毒屬。豬薩佩羅病毒以前被歸類為豬腸道病毒A,並曾被命名為PEV-8,但是Krumbholz等2002年在《Journal of Virology》第11期上5813-5821頁發表了題為((Sequencing of Porcine Enterovirus Groups II and III Reveals Unique Featuresof Both Virus Groups》的文章，該文章根據其L和2A基因能將其與其它的豬腸道病毒區分開，因此歸類為一個新的屬。《病毒分類-國際病毒分類委員會(ICTV)第八次報告》最終將PEV-8稱為薩佩羅病毒屬，該屬包含豬薩佩羅病毒、禽薩佩羅病毒和猿薩佩羅病毒。豬薩佩羅病毒粒子為球形，無囊膜，直徑25_30nm。首例豬腸病毒感染的報導出現在20世紀30年代，發生在捷克斯洛伐克的捷申病，是一種高死亡率的腦脊髓灰質炎。豬薩佩羅病毒能引起中度或嚴重的神經系統紊亂、繁殖障礙、肺炎和腹瀉。感染豬只康復後依然會繼續排毒，成為重要的病毒傳播源。經對現有的技術文獻檢索分析發現，Knowles等在《Arch Virol)) 1979年第62期 201-208 頁發表了題為〈〈Classification of porcine enteroviruses by antigenicanalysis and cytopathic effects in tissue culture: description of 3 newserotype》文章，文中介紹了鑑定該類病毒的方法主要依靠抗原分析和豬腎細胞類型方法。Roland Zell 等 在《Journal of Virological Methods》2000 年第 88 期 205 - 218 頁發表了題為〈〈Detection of porcine enteroviruses by nRT - PCR: differentiation of CPEgroups 1-1II with specific primer sets))一文，文中介紹了 RT-PCR檢測方法檢測薩佩羅病毒。但這些方法費時費力，操作過程繁瑣且不易鑑定。目前，鑑定豬薩佩羅病毒的常規方法有病毒分離、病毒中和試驗、病變形態觀察、抗原分析、RT-PCR等，由於這些技術周期長，操作繁瑣或者只能進行定性檢測而不能定量分析，並且有時靈敏性不夠，尤其是低病毒含量的樣品，因此在實際應用中受到限制。目前還沒有使用Taqman-MGB實時螢光定量RT-PCR檢測該病毒的報導。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中的上述不足，提供一種檢測豬薩佩羅病毒的引物；另外提供一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針；以及提供一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒。本發明通過以下技術方案實現上述目的:
一種檢測豬薩佩羅病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示:
上遊引物:5』 -GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3』 (SEQ ID NO:1)；下遊引物:5』 -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID NO:2)。一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，核苷酸序列為SEQ ID NO: 3所示，該序列5』端標記有發光的報告螢光基團，3』端標記有不發光的淬滅基團和二氫環化吲哚卟啉-三月太(dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3):
探針核苷酸序列:5』 -CGATAGCCATGTTAGTG-3』 (SEQ ID NO:3)。優選地，上述的檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其所述報告螢光基團為FAM (Carboxyfluorescein,竣基突光素)，萍滅基團為 NFQ (Non-Fluorescent Quencher,非螢光淬滅基團)。一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，包括上述SEQ ID NO:1 2的引物，以及SEQ IDNO:3序列結合螢光基團和淬滅基團的Taqman-MGB探針。一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，包括以下組分:PCR反應緩衝液、Mg2+、SEQ IDNO: Γ2的引物序列、由SEQ ID NO: 3構成的Taqman-MGB探針、dNTP混合物以及Taq酶。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
採用Taqman-MGB實時螢光定量RT-PCR方法，克服了病毒分離操作過程繁瑣且不易鑑定和傳統PCR檢測速度慢、易汙染、擴增後需電泳檢測和每次檢測的樣品數量少等缺點，可以對樣品中的病毒含量進行精確的定量檢測。本發明的引物和Taqman-MGB探針特異性高，穩定性好，檢測準確率高，Taqman-MGB診斷試劑盒具有檢測快速、靈敏性高、穩定性好、易於定量、假陽性低等特點，有利於規 模化和自動化檢測分析。TaqMan-MGB探針與傳統的 TaqMan-TAMRA (TaqMan-四甲基羅丹明)探針比較具有以下優勢:
(I)提高Tm值:平均15bases可提高18°C，這樣可以使探針的長度縮短，尤其對AT含量高的序列設計有很大的幫助，並且提高配對與非配對模板間的Tm值差異。(2)提高信噪比:由於在探針的3』端的淬滅基團為不發光的螢光基團，並且與報告基因在空間的位置更接近，實驗結果更精確，解析度更高。(3)更簡化實驗:MGB探針實驗優化步驟簡單，雜交的穩定性大大提高，重複性大大提聞。
圖1 =TaqMan-MGB螢光定量PCR標準曲線；
圖2:豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB螢光定量PCR方法敏感性實驗；
圖3:豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB螢光定量PCR方法特異性實驗檢測結果曲線圖，其中a為PSV YC2011株，b為豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合症病毒。
具體實施例方式為便於理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例來進一步闡述本發明。以下實施例中，「ηΧ」(η表示數字)意為稀釋η倍。實施例中使用的生物材料及試劑說明:
PSV YC2011毒株由廣東溫氏食品集團研究院分離保存，也可以使用其他市售或自分離的PSV病毒株，僅為便於本領域技術人員理解本發明技術方案使用，不對本發明的技術方案產生影響；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、pMD18_T載體和DH5 α感受態細胞均為寶生物工程(大連)有限公司產品；質粒抽提試劑盒購於Omega公司；Axyprep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒購於Axygen公司。實施例1
1)設計引物和TaqMan-MGB探針
從Genbank中檢索獲得的豬薩佩羅病毒的全基因組序列(參考毒株Genbank登錄號為JX286666.1,NC_003987.1和HQ875059.1 )，通過DNAstar軟體進行序列比對，找出豬薩佩羅病毒基因組特異性的保守序列共10段,登錄http://www.ncb1.nlm.nih.gov/進行BLAST確定其保守性。運 用Oligo 6.0軟體對這些保守序列做鹼基組成成分及穩定性等方面分析，並從引物和探針設計等原則綜合考慮，最終篩選出I段最合適的保守序列，該段保守序列位於PSV基因組的5』非翻譯區的第153bp到第260bp(毒株Genbank登錄號JX286666.1)。運用專業引物設計軟體對該保守序列進行引物設計，得到多對特異性引物和探針序列，經過比對篩選，最終確定一組最佳引物對和一條MGB探針，引物和探針位於5』非翻譯區，目的擴增片段為IOSbp。上遊引物:5』-GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3』 (SEQ ID NO:1)；
下遊引物:5』 -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID N0:2)；
探針:FAM-5』 -CGATAGCCATGTTAGTG-3』 -MGB (序列為 SEQ ID NO:3)
2)定量標準質粒的構建和製備
以提取 PSV YC2011 毒株的 RNA 為模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 試劑盒說明書步驟進行反轉錄，合成cDNA,以cDNA為模板,用上述試劑盒內的SapU和SapD引物進行PCR擴增。SapU:ACGGCGAGTACATATGG (SEQ ID N0:4)；
SapD:GCCATTGCATTAGCTATC (SEQ ID NO:5)。擴增體系如下:
cDNA6 μ L
上遊引物 SapU (10 μ Μ)4 μ L
下遊引物 SapD (10 μ Μ)4 yL
Taq DNA polymerase50 μ L
ddH2046 μ L
總量110 μ L
配好體系混勻後，低速離心，將液體全部置於管底，用PCR自動擴增儀進行擴增，擴增程序如下:94°C預變性5min ;94°C變性15sec ;55°C退火15sec ;72°C延伸Imin ；30個循環後再延伸lOmin。擴增結束後在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳鑑定，將748bp處的目的條帶切割下來，通過膠回收試劑盒(Omega公司)進行純化,純化的目的片段與pMD18_T載體在16°C條件下連接過夜，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，挑選單克隆菌落進行擴大培養並做PCR鑑定，鑑定為陽性的單克隆菌落送上海英駿生物技術有限公司進行測序驗證，測序驗證正確的單克隆菌落擴大培養。上述鑑定陽性且測序驗證正確的單克隆菌液用質粒抽提試劑盒(Omega公司)進行質粒抽提和純化，紫外分光光度計測定質粒濃度，並根據以下公式換算為質粒拷貝數。質粒濃度(yg/yL)=0D260X稀釋倍數X50/1000 ;質粒拷貝數=質粒濃度X6.02X 1023mol/1000M，M代表質粒分子量。該質粒便為以下步驟製作標準曲線的定量標準質粒。3)病毒RNA的提取:
取PSV YC2011株，按Axyprep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒使用說明書進行，步驟如下:
①取200μ 已知陽性病毒樣品，加入1.5mL離心管中；
②加200μ Buffer V_L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min ；
③加75PLBuffer V-N，漩渦振蕩混合均勻，12000 Xg離心5min ；④將上清轉移到新的2mL離心管中，加300μ 異丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置6_8次，混合均勻；
⑤將製備管置於2mL離心管(試劑盒內提供)中，取步驟④中的混合液移入製備管中，6000 X g 離心 Imin ；
⑥棄濾液，將製備管置回到2mL離心管中，加500μ Buffer W1A，室溫靜置lmin，12000 X g 離心 Imin ；
⑦棄濾液，將製備管置回到2mL離心管中，加800μ Buffer W2，12000 Xg離心lmin ；
⑧將製備管置回到2mL離心管中，12000Xg離心Imin ；
⑨將製備管置於潔淨的1.5mL離心管(試劑盒內提供)中，在製備管膜中央加40μ Buffer TE,室溫靜置 Imin，12000 X g 離心 Imin 洗脫 DNA/RNA。4)病毒RNA的逆轉錄:
以步驟 3)提取的 PSV YC2011 株的 RNA 為模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA,反轉錄體系如下:5XAMV buffer 4 μ L, dNTP( IOmM)
2μ L, Random Primer (6_9mer) 50pmol, AMV 反轉錄酶 10 U, RNA 樣品 I μ g，RNaseInhibitor 20U，加DEPC H2O至20 μ L0將各試劑混合均勻，置PCR儀中按以下程序進行:300C 10 min，42°C溫浴30 min,90°C 5 min反應結束後_20°C保存，用於螢光定量PCR檢測。5) TaqMan-MGB螢光定量PCR反應條件的優化:
以步驟4)所得的cDNA為模板，通過對反應體系中不同的Mg2+、引物濃度、MGB探針濃度、dNTP濃度等實驗結果比較，選擇反應靈敏度高、本底螢光信號低、具有典型S型擴增螢光信號曲線、擴增效率接近I的反應體系。經優化後的20μ L最佳反應體系為:
組分用量/終濃度
IOXBuffer (PCR 緩衝液)IX
2Smmol/T, MgCl2Smmol/I,
dNTP 混合物Immol/I,
SEQ ID NO:1 2引物每種引物各0.4 μ mol/L
TaqMan-MGB 探針0.2 μ mol/L
cDNA 模板2 μ L
Taq 酶5UnitROX reference dye0.04 μ L
將加好樣品的PCR管放置螢光PCR儀中進行擴增，反應程序如下:50°C，2分鐘，熱啟動；95°C，10分鐘預變性；95°C，10秒，60°C 40秒，45個循環。試驗結果可以實時檢測。豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB螢光定量PCR的檢測結果判定:進行螢光定量PCR時設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為定量標準質粒，陰性對照為滅菌水，檢測結果若出現典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結果，表明檢測樣品中含有豬薩佩羅病毒；若檢測樣品中不含有豬薩佩羅病毒則無擴增信號。6) TaqMan-MGB螢光定量PCR標準曲線的建立
用無菌雙蒸水將步驟2)獲得的定量標準質粒稀釋至2.475X 109，2.475X 108，
2.475 X IO7, 2.475 X IO6, 2.475 X IO5Copies^L,用步驟5)最優化的體系進行反應，反應條件按上述優化好的條件 進行。檢測結束後螢光定量PCR會自動繪製標準曲線(圖1)。本檢測方法在2.475X 109 2.475X 105copies/reaction範圍內具有良好的線性關係。7)檢測靈敏度分析
步驟2)獲得的定量標準質粒用無菌雙蒸水稀釋至2.475X 109，2.475X 108，2.475X107，2.475X106，2.475X105，2.475X104，2.475X103，2.475X102，
2.475 X lOkopies/^L，用步驟5)最優化的體系進行反應，反應條件按上述優化好的條件進行檢測其靈敏度。通過分析檢測結果可以看出，檢測靈敏度可達到10(Γ1000個拷貝/μ (圖2)。8)特異性分析
設定可能存在潛在交叉反應的病毒cDNA為模板(以豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合症病毒為模板)，設定無菌蒸餾水作為陰性對照，PSV YC2011株cDNA作為陽性對照，按上述最優反應體系和條件進行螢光定量PCR反應，結果顯示該檢測體系特異性良好，非目標病毒核酸均沒有擴增曲線，只有豬薩佩羅病毒才有良好的擴增曲線(圖3)。9)穩定性分析
選取3個已知陽性的臨床樣品，分別進行批內重複檢測和批間重複檢測。批內重複實驗:將3個已知陽性樣品在同一批中進行檢測，每個樣品設置兩個重複，分析同一樣品在批內檢測的穩定性；批間重複實驗:將3個已知陽性樣品分批次檢測，每次單獨檢測一個樣品，樣品設置兩個重複，比較同一樣品在不同批次中檢測的穩定性。從下表中的檢測結果分析，可以看出批內變異係數在0.63%-1.14%之間，批間變異係數在1.09%-1.46%之間，所以可以判斷出本檢測方法穩定性良好。表I樣品檢測穩定性分析
權利要求
1.一種檢測豬薩佩羅病毒的引物，其特徵在於，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示。
2.一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其特徵在於，核苷酸序列為SEQ IDNO: 3所不,該序列5』端標記有發光的報告突光基團，3』端標記有不發光的淬滅基團和二氫環化吲哚卟啉-三肽。
3.根據權利要求2所述的檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其特徵在於，所述報告螢光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。
4.一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，其特徵在於，包括權利要求1所述的引物，以及權利要求2或3所述的Taqman-MGB探針。
5.一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，其特徵在於，包括以下組分:PCR反應緩衝液、Mg2+、SEQ ID NO:1 2的引物序列、由SEQ ID NO: 3構成的Taqman-MGB探針、dNTP混合物以及Taq酶。
全文摘要
本發明公開了檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒，屬於動物病原微生物檢測技術領域。用於檢測豬薩佩羅病毒的引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，Taqman-MGB探針的DNA序列如SEQIDNO:3所示。本發明的引物和Taqman-MGB探針特異性高，穩定性好，檢測準確率高，Taqman-MGB診斷試劑盒具有檢測快速、靈敏性高、穩定性好、易於定量、假陽性低等特點，有利於規模化和自動化檢測分析。採用Taqman-MGB實時螢光定量RT-PCR方法，克服了病毒分離操作過程繁瑣且不易鑑定和傳統PCR檢測速度慢、易汙染、擴增後需電泳檢測和每次檢測的樣品數量少等缺點。
文檔編號C12R1/93GK103205512SQ201310168628
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月9日 優先權日2013年5月9日
發明者陳俊偉 申請人:廣東溫氏食品集團股份有限公司