Hmgb蛋白及抗體在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用的製作方法
2023-12-01 02:41:01 2
專利名稱：Hmgb蛋白及抗體在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及HMGB基因、蛋白及在製備牡蠣抗感染免疫製劑中的作用。
背景技術：
高遷移率族蛋白B (high mobility group box,簡稱HMGB)是高遷移率族蛋白家族的成員，是一族廣泛存在於真核生物細胞體內，富含電荷的染色體非組蛋白。在結構上 HMGB包含三個特徵性結構域，即兩個具有相似結構及較高同源性的HMG box (A box和Bbox)，以及一個富含天冬氨酸和穀氨酸的酸性C末端。在細胞核內HMGB行使「DNA伴侶」的功能，能通過與多種轉錄因子、複製蛋白和甾體受體作用，參與DNA的重組、修復、基因轉錄調控、細胞複製及分化成熟等生命活動。此外，目前的研究表明，HMGB能在特定條件下釋放到細胞外，介導多項炎症反應，是一種重要的前炎症細胞因子和趨化因子，可作為一種「預警信號」調控機體免疫，是細胞內核酸介導的天然免疫反應的普適性哨兵。並且HMGB與多項炎症疾病如膿毒症、關節炎、胰腺炎、動脈樣硬化(Kalinina et al.，2004)等發生發展密切相關，是治療膿毒症等炎症疾病的重要『靶分子』，而其抗體可以顯著降低患膿毒症等炎性疾病的小鼠死亡率。牡蠣是重要的海水養殖經濟貝類，具有「海洋牛奶」之美譽，其肉質細嫩、肉味鮮美、營養價值高，是世界性的水產佳餚。我國是水產大國，牡蠣等貝類養殖是我國海水養殖的支柱產業之一，其中我國牡蠣養殖年產量居世界首位，達到300多萬噸(溼重)，佔我國海水養殖總產量(約1000萬噸)的約三分之一(聯合國糧農組織(FAO)統計數據)。牡蠣養殖業的迅速發展為我國農業經濟作出了重要的貢獻，也極大的改善了沿海漁民的生活水平，但是近年來，隨著牡蠣種質退化，養殖規模的不斷擴大，養殖環境的惡化和養殖模式的局限性，牡蠣養殖病害頻發，造成了巨大的經濟損失，極大的損害了當地漁民養殖積極性，限制了牡販產業進一步的發展。其中研究證實類立克次體(rickettsia-like organism,簡稱RL0)是其主要病原之一，因此研究牡蠣抗RLO感染相關細胞因子及其抗感染機制顯得尤為重要和迫切，將有助於牡蠣抗感染免疫製劑的開發。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中存在的不足之處，提供HMGB基因、蛋白及其在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的作用為解決技術問題，本發明是通過這樣的技術方案來實現的提供一種近江牡蠣HMGB基因編碼的蛋白質，該蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明還提供了一種編碼前述蛋白質的基因編碼框，該基因的編碼框核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。
本發明還提供了所述蛋白質在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用，是將所述蛋白質免疫紐西蘭大白兔進而獲得多克隆抗血清。本發明還提供了前述蛋白質製備的多克隆抗血清(即HMGB蛋白的多克隆兔抗體)在抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細菌細胞壁成分——脂多糖(Lipopolysaccharide,簡稱LPS)引起的炎症反應及細胞壞死和細胞凋亡中的應用。本發明的有益效果在於本發明獲得了近江牡蠣HMGB基因編碼框全序列，並通過構建原核表達載體，表達並純化了可溶性的HMGB蛋白質產品，並製備了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細菌LPS引起的炎症反應及細胞壞死和細胞凋亡的作用。
具體實施例方式本發明的下述實施例所使用分子生物學的方法均為已知的技術。本發明中的近江牡蠣HMGB基因編碼的蛋白質，該蛋白質的胺基酸序列如SEQ IDNO 2所示。編碼前述蛋白質的基因編碼框的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發明所述蛋白質在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用，是將所述蛋白質免疫紐西蘭大白兔進而獲得多克隆抗血清。該多克隆抗血清(即HMGB蛋白的多克隆兔抗體)應用在抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細菌細胞壁成分——脂多糖(Lipopolysaccharide,簡稱LPS)引起的炎症反應及細胞壞死和細胞凋亡。本發明的實現步驟包括I、以近江牡蠣血淋巴細胞總RNA為模板，構建cDNA文庫，獲得HMGB的基因編碼框核苷酸序列。2、利用DNA重組技術將HMGB基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體(Takara公司，日本)中，再經限制性內切酶酶切，與經同樣酶切的pET_32 (a)原核表達載體(Novagen公司，德國)連接，獲得重組表達質粒pET_32 (a) -HMGB。3、將陽性重組質粒PET-32 (a)-HMGB轉化到表達宿主菌Ε· coli Rossetta (DE3)(Novagen公司，德國),異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sangon公司,力口拿大)誘導表達，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測。4、將陽性表達菌液擴大培養，利用蛋白質純化試劑盒分離純化重組蛋白質。5、培養近江牡蠣單層血淋巴細胞，並分別用LPS/RL0刺激，其中部分刺激添加HMGB多克隆兔抗血清，部分刺激添加HMGB免疫前的兔血清。 6、選擇不同的時間點收集處理過的細胞，用螢光定量PCR檢測炎症相關細胞因子LITAF (LPS-induced TNF-a factor，脂多糖誘導的腫瘤壞死因子α )的表達，用流式細胞儀檢測血淋巴細胞壞死和凋亡。具體的操作步驟如下I、近江牡蠣血淋巴細胞cDNA文庫的構建及篩選
提取近江牡販血淋巴細胞總RNA,根據In-Fusion SMART cDNA libraryconstruction kit (BD Clotech公司)構建cDNA文庫。利用M13引物對文庫陽性質粒進行PCR擴增並測序。
2、近江牡蠣HMGB編碼框核苷酸全長序列的獲得通過對文庫篩選，我們得到一個和哺乳動物HMGB有較高同源性的基因，我們將其命名為Ca-HMGB (Ca代表近江牡蠣)。該基因的編碼框核苷酸全長序列為SEQ ID NO :1。3、PET-32 (a) -HMGB 表達載體的構建以近江牡蠣cDNA為模板擴增目的片段，PCR擴增Ca-HMGB的反應條件為94°C預變性5分鐘，然後35個循環(94°C變性30秒，51°C退火30秒，72°C延伸45秒)，72°C延伸10分鐘。PCR產物分別連入PMD-19T載體，轉化大腸桿菌DH5 a (Takara公司，日本)，塗布LBA篩選平板，挑取若干個克隆進行PCR鑑定及進一步的測序鑑定，將PCR陽性克隆 產物用BamHI、XhoI限制性內切酶(Takara公司，日本)雙酶切，連接入經過同樣雙酶切的PET_32a載體的相應位點上，轉化大腸桿菌DH5a (天根公司，中國)。PCR篩選陽性克隆，經測序鑑定獲得編碼框正確的表達載體PET-32 (a) -HMGB。4、重組蛋白質的表達將陽性重組質粒PET-32(a)_HMGB轉化表達宿主菌E. coli Rossetta (DE3 )感受態，塗布LBA平板，37°C培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LBA培養液，37°C振搖培養過夜。取適量菌液，按1:100擴大培養至0D_為O. 4-0. 5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續培養6小時，離心收集宿主菌。細菌經超聲波裂解後(300W，20分鐘，超聲2秒鐘，間隔3秒鐘)離心分離上清液和沉澱，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳。5、重組蛋白質的純化將陽性表達質粒擴大培養，按上述方法超聲處理，利用Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司，德國)對表達產物進行分離純化，並採用12%的SDS-PAGE進行鑑定。挑選體重約I. 5 kg的健康紐西蘭白雄兔進行免疫。經過一次初始免疫和三次加強免疫後，頸動脈取血，分離血清，存儲於_80°C。6、蛋白質定量將純化鑑定過的蛋白質按Brad-ford法進行定量(Bradford MM. A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976， 72:248-254)o7、Ca-HMGB多克隆兔抗血清製備蛋白質定量後，取適量蛋白，挑選2隻體重約2 kg的健康紐西蘭大白兔(雄兔)，進行多克隆抗體製備，用純化所得的PET32a-HMGB為抗原加入等體積的佐劑充分乳化後免疫兔子，採用多點背部皮下注射，共免疫四次。(I)免疫前，從耳靜脈處收集3_5ml正常血清作為檢測抗體時的陰性對照。(2)用剪刀剪去兔子背部部分兔毛，酒精消毒後進行背部皮下多點注射。(3)初次免疫取約I mg抗原，加入等體積的完全弗氏佐劑充分乳化後注射，背部選取8-10個點，每個點注射約0. I ml ;(4)第二次免疫間隔14天後進行，抗原量為0.5 mg，加入等體積不完全弗氏佐劑充分乳化後注射，方法同上；(5)第三、四次免疫間隔7天後按同樣方法進行，第四次免疫後，從耳靜脈採血Iml分離血清，用雙相瓊脂擴散法進行免疫血清的抗體效價檢測，效價應達到1:16以上才能放血；(6)分離血清第四次免疫後第4天，待抗體效價達到要求後，進行頸動脈採血並分離血清。分裝後，-80°C保存。8、Western blot (免疫印跡)檢測抗體效價參照Sambrook 等的方法進行(Sambrook J, Russell D ff. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)，1:5000稀釋HMGB多克隆兔抗血清檢測抗體效價，具體步驟如下9、近江牡蠣單層血淋巴細胞培養及處理 參考Lacoste 和 Canesi 等的報導(Lacoste A. , Cueff A. and Poulet S. A.,2002. P35-sensitive caspases, MAP kinases and Rho modulate beta-adrenergicinduction of apoptosis in mollusc immune cells. Journal of cell science115, 761-8 ； Cane si L, Lorusso LC, Ciacci C, Betti M, Zampini M, Gallo G.Environmental estrogens can affect the function of mussel hemocytesthrough rapid modulation of kinase pathways. Gen Comp Endocrinol. 2004138:58-69.)，具體步驟如下(I)取10-15隻健康、活性良好的牡蠣，實驗室暫養後自來水衝洗外殼；(2)用一次性注射器從圍心腔中抽取10-15 ml血淋巴液；(3)取適量血淋巴液，800 xg，離心5分鐘，上清液用0.22 Mm孔徑的濾膜過濾後得到血清；(4)向每個培養皿中加入I ml血淋巴液，15°C孵育30分鐘；(5)吸去未貼壁血淋巴細胞，向每個培養皿中加入2 ml血清，置於15°C無菌培養箱中備用。(6)培養24小時後，更換血清，分別做以下處理a)在血淋巴細胞中加入RLO (lul/106 cells)，部分添加抗HMGB多克隆血清(1:1000)，分別培養O小時、1. 5小時、4小時、8小時和12小時，提取總RNA，用於real_timeRT-PCR分析LITAF表達變化；b)在血淋巴細胞中加入LPS (1001^/1111)，部分添加抗!^0多克隆血清(1:1000)，分別培養O小時、I. 5小時、4小時、8小時和12小時，提取總RNA，用於real-time RT-PCR分析LITAF表達變化；c)在血淋巴細胞中加入RLO (lul/106 cells)，部分添加抗HMGB多克隆血清(1:1000)，部分添加免疫前血清(I: 1000)，培養12小時後流式細胞儀檢測血淋巴細胞凋亡和壞死；d)在血淋巴細胞中加入LPS (1001^/1111)，部分添加抗!^0多克隆血清(1:1000)，部分添加免疫前血清(I: 1000)，培養12小時後流式細胞儀檢測血淋巴細胞凋亡和壞死。10、螢光定量PCR按Takara公司(日本)螢光定量PCR說明書進行，採用28s rDNA序列為內參，每個樣品做3個重複樣本，反應條件為95°C 3分鐘變性；40個循環擴增(95°C 20秒，55°C 40秒)。反應結束後，使用Bio-Rad iCycle IQ5螢光定量PCR儀自帶軟體包進行溶解曲線分析，得到的數據應用相對CT法(2_「eT)分析，在使用CT方法前，確定目的基因與看家基因擴增效率基本一致，數據分析採用學生t檢驗方法。11、流式細胞儀檢測細胞凋亡分析凋亡分析按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒對細胞進行,Annexin V-FITC的綠色螢光通過FITC通道(FLI)檢測，PI紅色螢光通過PI (FL2或FL3)檢測。具體的實施例子I、近江牡蠣血淋巴細胞cDNA文庫的構建和篩選提取近江牡販血淋巴細胞總RNA,根據In-Fusion SMART cDNA libraryconstruction kit (BD Clotech公司)構建cDNA文庫。利用M13引物對文庫陽性質粒進行PCR擴增並測序。篩選出近江牡蠣高遷移率族蛋白(HMGB)。2、HMGB的原核表達、純化和鑑定將陽性重組質粒PET-32 (a)-HMGB轉化到表達宿主菌E. coli Rossetta (DE3 )感受態，塗布LBA平板，37°C培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LBA培養液，37°C振搖培養過夜。取適量菌液，按1:100擴大培養至0D_為O. 4-0. 5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續培養6小時，離心收集細菌。細菌經超聲波裂解後(300W，20分鐘，超聲2秒鐘，間隔3秒鐘)離心分離上清液和沉澱，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳。將陽性表達質粒擴大培養，利用Ni-NTA親和層析柱對表達產物進行分離純化，進行12%的SDS-PAGE電泳鑑定純化的蛋白質產物。3、HMGB多克隆抗血清製備及效價檢測用純化的HMGB蛋白免疫健康紐西蘭大白兔，取免疫前血清為陰性對照，經過一次初始免疫和三次加強免疫後，頸動脈取血，分離血清，存儲於_80°C。ffestern-blot 1:5000檢測抗體效價確定獲得具有較高特異性的HMGB多克隆兔 抗血清。4、HMGB多克隆兔抗血清抑制LPS/RL0刺激引起的炎症相關因子LITAF的表達近江牡蠣單層血淋巴細胞體外培養24小時後，更換血清後將細胞分為LPS刺激組；LPS + anti-Ca-HMGB刺激組；RLO刺激組；RLO + anti-Ca-HMGB刺激組。螢光定量PCR檢測O小時、I. 5小時、4小時、8小時和12小時的LITAF mRNA表達量變化。其中LITAF是一個新發現的重要轉錄因子，被認為可以調控腫瘤壞死因子TNF α的表達，而LPS是革蘭氏陰性菌主要致病成分脂多糖。結果表明刺激後4小時，Ca-HMGB多克隆兔抗血清能顯著抑制LPS和RLO刺激引起的LITAF表達量上調(LPS + anti-Ca-HMGB, 4-12小時分別抑制 37. 71%, 89. 99% 和 86. 62% ；RL0 + anti-Ca-HMGB, 4-12 小時分別抑制 74%, 62. 57% 和56. 23%)。Ca-HMGB多克隆抗血清具有有效抑制革蘭氏陰性菌和RLO感染引起的炎症反應的作用。因此，Ca-HMGB多克隆抗血清可有效應用於近江牡蠣抗RLO和革蘭氏陰性菌等微生物感染的免疫製劑相關產品的開發中。5、HMGB多克隆兔抗血清抑制LPS/RL0刺激引起的細胞凋亡和壞死近江牡蠣單層血淋巴細胞體外培養24小時後，更換血清後將細胞分為LPS刺激組；LPS + anti-Ca-HMGB 刺激組；LPS + 免疫前血清組；RLO 刺激組；RLO + anti-Ca-HMGB刺激組；RLO +免疫前血清組。12小時後採用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞技術檢測血淋巴細胞凋亡和壞死率，結果表明添加Ca-HMGB兔抗血清較未添加和添加免疫前血清組，LPS/RLO誘導的細胞壞死和晚期細 胞凋亡均顯著降低，細胞存活率顯著增加(較未添加組和添加免疫前血清組，添加Ca-HMGB多克隆抗血清組，RLO刺激晚期細胞凋亡率均降低了約26%，壞死細胞率均降低了約35%。活細胞數分別增加了 7%和5% ；LPS刺激組，晚期凋亡細胞分別減少了約50%和18%，壞死細胞分別約減少了 22%和48%，活細胞數分別增加了約34%和30%)。Ca-HMGB抗血清能夠顯著抑制革蘭氏陰性菌和RLO感染引起的細胞凋亡和細胞壞死，顯著增加細胞存活率，可有效應用於近江牡蠣抗革蘭氏陰性菌和RLO等微生物感染的免疫製劑相關產品的開發中。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干具體實施例框架。顯然，本發明不限於以上實施例，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種近江牡蠣HMGB基因編碼的蛋白質，其特徵在於，該蛋白質的胺基酸序列如SEQID NO 2 所示。
2.用於編碼權利要求I所述蛋白質的基因，其特徵在於，該基因的編碼框核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。
3.權利要求I所述蛋白質在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用，是將所述蛋白質免疫紐西蘭大白兔進而獲得多克隆抗血清。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，旨在提供HMGB蛋白及抗體在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用。該蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO2 所示；該基因的編碼框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白質在製備近江牡蠣抗感染免疫製劑中的應用，是將所述蛋白質免疫紐西蘭大白兔進而獲得多克隆抗血清。本發明獲得了近江牡蠣HMGB基因編碼框全序列，並通過構建原核表達載體，表達並純化了可溶性的HMGB蛋白質產品，並製備了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細菌LPS引起的炎症反應及細胞壞死和細胞凋亡的作用。
文檔編號C07K16/06GK102649816SQ20121015158
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月15日 優先權日2012年5月15日
發明者吳信忠, 許婷 申請人:浙江大學